孟憲偉 羅亮 孫源 趙志剛 王世會(huì) 張瑞 郭坤

摘要 采用超聲輔助提取法從生姜中提取多糖，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)生姜多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生姜多糖最佳提取工藝為液料比1∶20，勻漿時(shí)間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲時(shí)間80 min為宜，超聲溫度80 ℃，超聲波功率為100 W，在該條件下多糖得率為12.56%。抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，生姜多糖在5 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除能力可達(dá)到90.96%，且還原力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 生姜多糖；提?。唤Y(jié)構(gòu)表征；抗氧化作用

中圖分類號(hào) R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）11-0149-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.032

Study on Extraction and Antioxidant Effect of Polysaccharide from Zingiber officinale Roscoe

MENG Xian-wei1，2， LUO Liang2， SUN Yuan1 et al

（1. Research Center of Pharmaceutical Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin， Heilongjiang 150076；2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Harbin， Heilongjiang 150070）

Abstract Ultrasonic assisted extraction method was used to extract polysaccharide from Zingiber officinale Roscoe. First， single factor and orthogonal test were used to optimize the extraction process of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide. The experimental results showed that the optimal extraction process of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide was as follows： liquid to material ratio 1∶20， homogenization time 5 min， homogenization temperature 70 ℃， ultrasonic time 80 min and ultrasonic temperature 80 ℃. Under the condition of ultrasonic power of 100 W， the yield of polysaccharide was 12.56%. Then， the antioxidant activity of the extracted Zingiber officinale Roscoe polysaccharide was determined. The experimental results showed that the hydroxyl radical scavenging ability of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide reached 90.96% at 5 mg/mL， and the reducing power was the strongest.

Key words Zingiber officinale Roscoe polysaccharide;Extraction;Structural characterization;Antioxidation

基金項(xiàng)目 哈爾濱商業(yè)大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目（2020CX10）；黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（2023-KYYWF-1036）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金項(xiàng)目（BS0062）。

作者簡(jiǎn)介 孟憲偉（1993—），女，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，研究方向：中藥提取分離及活性。*通信作者，助理研究員，博士，從事環(huán)境微生物學(xué)研究。

收稿日期 2023-06-20；修回日期 2023-08-02

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為多年生草本植物的新鮮根莖，作為傳統(tǒng)藥用和食用植物被人們廣泛熟知，也是屬于有價(jià)值的烹飪香料之一，具有廣泛的應(yīng)用前景。生姜包含多種化學(xué)成分，如黃酮、二苯基庚烷類化合物、姜黃素、姜辣素、姜精油、多糖等［1-2］。研究表明，生姜具有廣泛的生物活性，如抗氧化［3］、抗炎［4］、抗菌［5］、抗腫瘤［6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、降血脂血糖［8］、調(diào)節(jié)腸道菌群［9］等藥理活性。多糖作為生姜活性化學(xué)成分之一，具有較高的研究?jī)r(jià)值。生姜多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，降低糖尿病小鼠的血糖［10］，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［11］，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡起到抗腫瘤作用［12-13］。生姜多糖還具有抗氧化［14-15］，免疫調(diào)節(jié)［16-17］，抗凝血［18］，抗疲勞［19］等生物活性功能。但目前關(guān)于生姜的研究大多集中在黃酮類［20-21］、姜辣素［22-23］、姜精油［24］等化學(xué)成分上，對(duì)從生姜中提取多糖的研究較少，限制了其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。筆者采用濕法勻漿協(xié)同超聲波提取生姜多糖，先將生姜進(jìn)行濕法勻漿，采用超聲輔助提取法得到多糖，通過(guò)勻漿快速提取使有效成分溶出，再通過(guò)超聲提取時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用使有效成分進(jìn)一步釋放、擴(kuò)散和溶解，可以縮短提取時(shí)間，增加提取效率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交提取法得到最佳工藝，并測(cè)定其抗氧化活性作用，以期為生姜多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生姜（市售）；實(shí)驗(yàn)室水為蒸餾水；氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，以上均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲儀，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分光光度計(jì)，購(gòu)自屹譜儀器制造（上海）有限公司；電子天平，購(gòu)自上海力辰邦西儀器科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.3 生姜多糖提取工藝

清洗→切片→烘干→精密稱取干品→勻漿→超聲提取→離心→濃縮→醇沉→冷凍干燥→測(cè)定提取率。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 液料比對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察液料比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。

1.4.2 勻漿溫度對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察勻漿溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。

1.4.3 勻漿時(shí)間對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿溫度70 ℃，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察勻漿時(shí)間分別為 3、4、5、6、7 min時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。

1.4.4 超聲時(shí)間對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，超聲溫度70 ℃，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察超聲時(shí)間分別為60、70、80、90、100 min時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。

1.4.5 超聲溫度對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，超聲時(shí)間80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。

1.4.6 超聲功率對(duì)生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min條件下，考察超聲功率分別為60、70、80、90、100 W時(shí)對(duì)生姜多糖得率的影響。提取率下式計(jì)算：

多糖得率（%）=提取的多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.5 生姜多糖正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取顯著的影響因素，采用 L9（34）正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)平行3次，取生姜多糖提取率平均值進(jìn)行極差分析（表1）。

1.6 生姜多糖純化

將上述所得多糖溶于水，加入1/3體積Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配），劇烈振蕩20 min，充分靜止，除去有機(jī)相及蛋白與有機(jī)溶劑產(chǎn)生的蛋白變性物質(zhì)，收集上層水相溶液，重復(fù)2～5次直至無(wú)蛋白析出。將脫蛋白后的溶液進(jìn)行活性炭粉末脫色，3 500 Da透析袋進(jìn)行透析，將得到的溶液加入4倍量無(wú)水乙醇4 ℃靜置24 h，離心（4 000 r/min）10 min，棄去上清液取沉淀，干燥得生姜多糖粉末。

1.7 生姜多糖含量測(cè)定

1.7.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

生姜多糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法，精密稱取葡萄糖干燥恒重，配制葡萄糖對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL），分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，充分渦旋混勻，冷卻至室溫。用2 mL蒸餾水代替對(duì)照品溶液，作空白對(duì)照，按上述方法操作。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=6.403 6x-0.042 0，R2=0.999 1。

1.7.2 生姜多糖含量計(jì)算。

按“1.7.1”中的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算供試液中葡萄糖的含量，按如下公式計(jì)算多糖含量：

D=（C×V×B）×0.9/M×100%

式中：C為測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，mg/mL；

V為提取液體積，mL；

B為稀釋倍數(shù)；

0.9為葡萄糖換算成多糖正交系數(shù)；

M為原料質(zhì)量，mg。

1.8 生姜多糖體外抗氧化作用研究

1.8.1 羥自由基清除能力測(cè)定。

參照王振斌等［25］的方法并加以修改進(jìn)行測(cè)定，吸取2.0 mL不同濃度生姜多糖溶液（1、2、3、4、5 mg/mL）依次加入FeSO4溶液（6 mmol/L）2.0 mL，水楊酸溶液（6 mmol/L）2.0 mL和過(guò)氧化氫溶液（6 mmol/L）2.0 mL，放置在37 ℃水浴鍋中30 min，在510 nm 處測(cè)定其吸光度（A1）。按上述同樣方法操作，用雙蒸水替代水楊酸溶液測(cè)定空白組吸光度（A0），用雙蒸水替代生姜多糖溶液測(cè)定空白對(duì)照組吸光度（A2）。按下列公式計(jì)算生姜多糖對(duì)羥自由基的清除率。

清除率%=［1－（A1-A2）/A0］×100%

1.8.2 還原力測(cè)定。

參照王振斌等［25］的方法并加以修改進(jìn)行測(cè)定，吸取1.0 mL不同濃度生姜多糖溶液（1、2、3、4、5 mg/mL），依次加入2.5 mL pH為6.6的磷酸緩沖液（0.2 mol/L），1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，50 ℃水浴20 min后，加入10%三氯乙酸2.5 mL，離心（3 000 r/min）10 min。取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL，0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，室溫下放置10 min等待反應(yīng)，在700 nm處測(cè)定吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，GraphPad PrismV 9.0軟件繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)生姜多糖提取的影響。

從圖1可知，液料比在1∶15～1∶25時(shí)，多糖的提取率呈上升趨勢(shì)，在1∶25時(shí)，多糖的提取率達(dá)到11.75%，但隨著液料比繼續(xù)增大，多糖的提取率呈下降趨勢(shì)。

2.1.2 勻漿時(shí)間對(duì)生姜多糖提取的影響。

從圖2可知，隨著生姜?jiǎng)驖{時(shí)間延長(zhǎng)，生姜多糖的提取率呈先增大后降低趨勢(shì)，勻漿時(shí)間5 min時(shí)，提取率可達(dá)到10.94%，但隨著勻漿時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，提取率降低，說(shuō)明隨著勻漿時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的溶出率增大，同時(shí)除多糖以外的物質(zhì)溶出，從而降低多糖提取率。

2.1.3 勻漿溫度對(duì)生姜多糖提取的影響。

由圖3可知，隨著勻漿溫度升高，生姜多糖提取率呈先增大后降低的趨勢(shì)，勻漿溫度在70 ℃時(shí)，提取率為11.29%，當(dāng)勻漿溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，多糖提取率也隨之降低。這說(shuō)明溫度升高加快分子效應(yīng)，加劇生姜的細(xì)胞壁破壞，促使多糖釋放，但溫度過(guò)高破壞多糖的結(jié)構(gòu)，不利于多糖溶出，降低提取率。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)生姜多糖提取的影響。

從圖4可知，在超聲時(shí)間為80 min時(shí)，多糖提取率最大，達(dá)12.22%，但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率降低。這說(shuō)明延長(zhǎng)超聲時(shí)間，多糖可以更好地溶入提取溶劑中，促進(jìn)多糖從生姜細(xì)胞壁中溶出，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)促使多糖降解，降低提取率。

2.1.5 超聲溫度對(duì)生姜多糖提取的影響。

從圖5可知，超聲溫度升高，生姜多糖提取率逐漸增大，超聲溫度在80 ℃時(shí)，生姜多糖提取率為12.45%。可見(jiàn)，較高溫度有利于多糖濃度提高。

2.1.6 超聲功率對(duì)生姜多糖提取的影響。

從圖6可知，超聲功率增大時(shí)，多糖的提取率逐漸增大，在100 W時(shí)，多糖提取率達(dá)到11.25%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，超聲功率（D）對(duì)生姜多糖提取的影響最大，其次依次是液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）。提取工藝最佳組合為A1B3C1D1，各因素對(duì)生姜多糖提取率的影響表現(xiàn)為D>A>B>C。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)生姜多糖的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，并根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)和儀器條件，得到最佳提取條件為料液比1∶20，勻漿時(shí)間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲時(shí)間80 min，超聲溫度80 ℃，超聲功率為100 W，稱取3份2 g生姜多糖粉末，在最優(yōu)工藝條件下試驗(yàn)，測(cè)得生姜多糖平均含量為43.62%，說(shuō)明該工藝組合較穩(wěn)定，可行性高。

2.4 生姜多糖體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 羥自由基清除能力。

由圖7可知，生姜多糖濃度在1～5 mg/mL，隨著多糖濃度增加，生姜多糖羥自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，清除率從38.05%升高到90.96%，說(shuō)明生姜多糖對(duì)羥自由基具有清除作用。但與VC相比，生姜多糖對(duì)羥自由基的清除能力仍有較大差距。

2.4.2 還原力。

從圖8可知，隨著生姜多糖濃度的升高，還原力逐漸升高，在5 mg/mL時(shí)，吸光度可達(dá)到2.155，但還原力仍弱于VC，VC在5 mg/mL時(shí)可達(dá)到2.565。

3 結(jié)論與討論

目前，生姜多糖的提取工藝主要有傳統(tǒng)水提法［26］、堿液提取法［27］、酶提取法［28］、超聲輔助提取法［29］、微波提取法［30］、超聲細(xì)胞研磨機(jī)提取［31］。該試驗(yàn)在單因素和正交試驗(yàn)提取生姜多糖工藝中，生姜多糖最佳提取工藝條件為液料比在1∶20，勻漿時(shí)間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲80 min，超聲溫度在80 ℃，超聲功率100 W，在該條件下生姜多糖得率為12.56%，生姜多糖含量為43.62%。相較于林敏等［32］采用超聲提取法和趙文竹等［33］采用傳統(tǒng)方法熱水提取法，將生姜多糖進(jìn)行濕法打漿后超聲輔助提取，可以大大提高生姜多糖提取率，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，有利于今后生姜多糖的應(yīng)用和發(fā)展。

機(jī)體一直與外界接觸，因輻射、紫外線、環(huán)境污染、化學(xué)藥物濫用和情緒問(wèn)題等因素［34］，使機(jī)體內(nèi)存在過(guò)量的自由基，產(chǎn)生癌癥、糖尿病、衰老、老年癡呆癥、帕金森病以及炎癥等疾?。?5-38］。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，天然化合產(chǎn)物有很好的抗氧化，可去除過(guò)量自由基，具有廣泛的應(yīng)用前景。中藥多糖作為抗氧化劑，是目前的研究熱點(diǎn)之一，多糖具有天然、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，有著較好的抗氧化作用［39-41］。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著生姜多糖濃度的增加，對(duì)羥自由基活性清除能力和還原力增強(qiáng)，生姜多糖具有較好的抗氧化作用。生姜多糖作為一種天然抗氧化劑，應(yīng)用于食品、水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑、保健品等方面，具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。該研究為生姜多糖的后續(xù)研究提供理論依據(jù)，其結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)成分、生物活性作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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