安碩++王思琦

[摘 ?要]DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，因此DNA的提取液是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作之一。基因組DNA提取應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性并且排除其他分子的污染，使下游實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。不同植物的組成成分不同，同一植物個(gè)體的不同發(fā)育時(shí)期其組織細(xì)胞中的組成成分也不同，需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。

[關(guān)鍵詞]基因組，DNA，提取

中圖分類號(hào)：TD327.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）24-0261-01

基因組（Genome）是一個(gè)細(xì)胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，包括全套基因和間隔序列?？墒腔蚪M測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個(gè)基因組序列的很小一部分。因此，基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。說(shuō)的更確切些，核基因組是單倍體細(xì)胞核內(nèi)的全部 DNA分子。線粒體基因組則是一個(gè)線粒體所包含的全部DNA分子。葉綠體基因組則是一個(gè)葉綠體所包含的全部DNA分子。

基因組DNA提取應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核算結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ);應(yīng)排除其他分子如蛋白、多糖、脂類、有機(jī)溶劑等的污染，使下游實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。植物多樣性豐富，不同植物中的水分、多糖和酚類物質(zhì)含量差別較大，尤其是植物組織中的多糖和酚類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)有較大的影響，提取時(shí)應(yīng)注意去除。因?yàn)橹参锝M織細(xì)胞內(nèi)外的組成成分復(fù)雜多樣，所以使得植物基因組DNA的提取相對(duì)于動(dòng)物等其他生物材料來(lái)說(shuō)更為繁瑣、困難。不同植物的組成成分不同，同一植物個(gè)體的不同發(fā)育時(shí)期的組織細(xì)胞中的組成成分也不同，需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。常用的制備植物基因組的方法有很多，常用到的方法有CTAB法等;對(duì)于植物基因組DNA的分離純化可以選擇已經(jīng)商品化的試劑盒（本實(shí)驗(yàn)采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒）。

目前，以人類基因組課題為契機(jī)，發(fā)達(dá)國(guó)家及部分發(fā)展中國(guó)家均在不遺余力地推進(jìn)基因組科學(xué)的發(fā)展。對(duì)某些原生動(dòng)物和真菌等小型基因組的分析已經(jīng)取得重大突破，整個(gè)研究領(lǐng)域正迎來(lái)后基因組科學(xué)（post-genome？science）時(shí)代。然而，植物基因組分析特別

是木本植物基因組分析起步較晚，現(xiàn)階段主要還是圍繞擬南芥（Arabidopsis？thaliana）、水稻（Oryza？sativa）和玉米（Zea？mays）等草本模式植物展開(kāi)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

植物種類繁多，一般情況下選用健康的嫩葉（或幼芽）為宜。健康的嫩葉（或幼芽）不僅含有較少的代謝產(chǎn)物，而且細(xì)胞數(shù)量更多。通常情況下，在采集健康的嫩葉（或幼芽）之前將植物置于暗處一日為宜，這樣可以有效地減少代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果所采集的植物材料不能立刻用于基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)，可以將樣品保存于4℃冰箱中24h，超過(guò)24h時(shí)應(yīng)置于-80℃中保存。注意樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，以防止提取的DNA講解。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

植物基因組DNA提取試劑盒、液氮、β-巰基乙醇、苯酚、氯仿、無(wú)水乙醇

研缽（需預(yù)冷）、移液器、1.5mL離心管（需滅菌）、低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、4℃冰箱、-80℃冰箱、電泳儀

3 操作步驟

①取健康的植物嫩葉（或幼芽）適量（約0.1g）置研缽中，于加入液氮迅速充分研磨至粉末狀。

②將研磨成粉末的樣品加到700uL 65℃預(yù)熱緩沖液GP1（預(yù)先加入β-巰基乙醇）的離心管中，65℃水浴20min。

③加入700uL氯仿，充分混合均勻，置于低溫高速離心機(jī)中，4℃、10000rpm下離心5min。

④將上層水相（約取400uL）轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入700uL緩沖液GP2，充分混合均勻。

⑤將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，4℃、10000rpm離心30s，低調(diào)廢液。

⑥加入500uL去蛋白液GD，13000rpm離心30s，棄掉廢液。

⑦加入700uL漂洗液GW，13000rpm離心30s，棄掉廢液。

⑧加入500uL漂洗液GW，13000rpm離心30s，棄掉廢液。

⑨ 再次13000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘。

⑩將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈離心管中，加50-200uL（干重組織加30-50uL）洗脫緩沖液TE室溫置于2-5min，12000rpm離心30s。

11離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2min，13000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量植物基因組DNA。

4 基因組DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題

①基因組DNA的得率較低或無(wú)基因組DNA

②提取的基因組DNA有降解

③提取的基因組DNA中有RNA的污染

④提取的基因組DNA不能順利進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

5 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度與純度

DNA在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/mL雙鏈DNA。一般用OD260/OD280值檢測(cè)DNA樣品的純度：正常OD260/OD280值約為1.7-1.9，說(shuō)明DNA純度較好;小于1.7可能有蛋白質(zhì)污染;大于2.0，說(shuō)明有RNA污染或者DNA已經(jīng)降解。注意：因?yàn)閜H值和離子會(huì)影響光吸收值，因此注意洗脫時(shí)不適用洗脫緩沖液，而使用去離子水，OD260/OD280值可能會(huì)略微偏低，但并不表示純度低。

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