王天鈺+季欣怡+章熙東

摘 要 以鯽魚的肌肉、卵和鰓的新鮮冷凍樣品為實驗材料，比較用傳統(tǒng)方法和試劑盒法提取DNA的濃度和純度。結果表明：從以上三種動物不同樣品組織中均能提取到比較純凈完整的基因組DNA（A260/A280在1.8～2.0之間），而且從魚卵、魚鰓中提取的全基因組DNA濃度優(yōu)于肌肉，能夠更好的適用于后續(xù)的分子生物學試驗研究。傳統(tǒng)提取法DNA含量顯著高于試劑盒法。

關鍵詞 動物 基因組DNA 提取

中圖分類號 Q-331 文獻標志碼 B

1 問題的提出

在蘇教版生物必修2教材中安排了“DNA粗提取和鑒定”實驗，以此加深學生對DNA這種細胞內(nèi)重要有機物的了解。通過雞血或香蕉細胞中DNA的粗提取實踐，提取到了較多的絮狀物。但對絮狀物中DNA的含量是多少，老師并為對此做出講解，由此激發(fā)了我們繼續(xù)的探究欲望，因此繼續(xù)進行DNA的細提取和DNA純度檢測實驗。

2 問題的解決

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，把P（蛋白質(zhì)）除去，再除去細胞中的糖、RNA及無機離子等，從中分離出DNA。制備高純度的DNA溶液是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200 kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗（如PCR）打下基礎。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布和含量不同，要選擇合適的材料和方法提取DNA。DNA的提取方法有多種，比如SDS-蛋白酶K消化法、CTAB法和試劑盒法等。

2.1 實驗準備

實驗材料：鯽魚（三種組織：魚卵、鰓、肌肉）

實驗方法：傳統(tǒng)方法和試劑盒法

實驗目的：篩選出選取哪一種組織和方法更適合在中學中開展DNA的細提取實驗。

2.2 實驗試劑

DNA提取試劑：ACL細胞裂解液；蛋白酶K；酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；Tris飽和酚；無水乙醇；體積分數(shù)為75%的乙醇溶液；雙蒸水。

細胞/組織基因DNA提取試劑盒（離心柱型，#GK0122）。

2.3 實驗儀器

分析天平；高速離心機（H1202轉頭）；微量移液器；恒溫水浴鍋；高壓蒸汽滅菌鍋；純水儀。

超微量DNA分析儀：2000C分光光度計。

2.4 實驗操作

2.4.1 傳統(tǒng)方法

（1） 取動物組織（如魚的肌肉）約0.15 g于1.5 mL離心管中。

（2） 加入400 μL的ACL細胞裂解液，將組織剪碎成末，加入蛋白酶K 15 μL，置于55℃水浴消化4 h左右。

（3） 加等體積的Tris-飽和酚（500 μL），混勻4-5 min，12 000 rpm離心5 min（室溫）。

（4） 取上清，放入新1.5 mL離心管中，加等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混勻2 min，12 000 rpm離心5 min。

（5） 取上清，放入2.0 mL離心管中，加2倍體積的-20 ℃無水乙醇，充分混勻后，-20 ℃放置2 h。

（6） 12 000 rpm離心10 min，棄去上清液（緩慢倒掉即可）。

（7） 加入1 mL 75%的乙醇，洗滌1次，12 000 rpm離心2 min，棄乙醇（緩慢倒掉即可）。

（8） 將離心管倒置干燥30 min。

（9） 加100 μL的雙蒸水溶解DNA，輕彈管壁，65℃溫浴30 min。

2.4.2 試劑盒法（詳見試劑盒操作說明書）

2.4.3 DNA的濃度和純度檢測

DNA的純度由260 nm和280 nm處的光吸收（即A260/A280）的比值決定。取DNA溶液1μL，用超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度，每個樣品重復測定3次。

2.5 實驗結果

DNA用無菌水溶解后在2000C分光光度計上測上述實驗提取到的DNA純度和濃度。結果如表1所示。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，從以上三種動物不同樣品組織中均能提取到比較純凈完整的基因組DNA（A260/A280在1.8～2.00之間），而且從魚卵、魚鰓中提取的全基因組DNA濃度優(yōu)于肌肉，能夠較好地適用于后續(xù)的分子生物學試驗研究。

2.6 實驗結論

（1） 實驗所提取到的全基因組DNA包括線粒體中的DNA和細胞核中的DNA。由于魚卵的細胞小于體細胞，因此同樣重量的魚卵中所含的細胞個數(shù)高于魚肉細胞的個數(shù)，再加上魚卵細胞要不斷分裂和生長需要消耗較多的能量，因此全基因組DNA的含量高于肌肉細胞。

實驗結果顯示從魚鰓中提取的全基因組DNA含量高于魚肉細胞。查閱資料后推測鰓是魚類的呼吸器官，同時還具有排泄氮代謝廢物和參與滲透壓調(diào)節(jié)的功能，尤其是通過主動運輸?shù)淖饔脜⑴c滲透壓的調(diào)節(jié)，因此鰓中的線粒體含量較高。另外，鰓中的血管壁很薄，只有單層上皮細胞。而魚肉細胞大都是肌肉細胞，肌細胞是多核細胞，但是肌原纖維的含量非常高。

（2） 通過對實驗數(shù)據(jù)的綜合分析，得出結論：從實驗取材的易得性來看，鯽魚魚鰓更適合用于開展本實驗。傳統(tǒng)方法和試劑盒法均能提取到較高純度和濃度的DNA，但考慮到中學生實驗開展的時間安排，試劑盒法為首選。

2.7 實驗反思

為了順利開展探究實驗，需要注意實驗材料的選擇。高中教材中選擇的雞血本應是一種理想材料，但對于學生而言該試驗材料難以獲得、保存條件要求高，實驗室的既有設備不能很好地滿足這些需求。相比之下，鯽魚是人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N常見的食材來源，且動物細胞較植物細胞少了細胞壁，更易于釋放細胞中的DNA。鯽魚的肌肉、卵、鰓組織材料較易獲取，且來源豐富，取材后分裝于干凈塑料袋在冰箱中冷凍保存即可，有利于實驗的開展。

DNA的提取是分子生物學的基本實驗，而分子實驗作為生物學各領域都通用且不可或缺的的分析方法，在高中、大學甚至更高層次的學習都會涉及，因此為我們實驗的開展提供了豐富的文獻資源。我們對查閱到的相關實驗方法做了相應的筆記，分析各個試劑的作用，不同方法的利弊，從而各取所長，科學選材，并設計出自己的較優(yōu)實驗方案。

在細提取操作之前，我們實驗組成員先進行了高中教材中關于DNA粗提取和鑒定的實驗，用到的材料有書本中建議的雞血和香蕉，并對提取到的絮狀物進行了二苯胺的鑒定，觀察到了與教材描述一致的淡藍色溶液的實驗現(xiàn)象。通過對教材實驗的不斷重復，我們充分了解了提取和鑒定DNA的原理，為細提取試驗中試劑的選擇和使用奠定了理論基礎。

在細提取實驗中，由于裂解酶等的使用耗時較長（傳統(tǒng)耗時近8 h，試劑盒近3 h），要如何有序進行是我們實驗小組必須考慮的問題，計算好每步的時間節(jié)點，在不耽誤正常上課的同時完成實驗是非常有必要的。因此在實驗的前一天就要精心安排好何時做何事，抓緊課間和午休，做到有條不紊，保證實驗的有序進行。

另外，實驗操作中總會遇到各式問題，這就要求我們學會自己分析和解決。比如在起初實驗用移液槍吸取蛋白酶K時，1 mL的蛋白酶K預計可以用66次（每次吸取15 μL），結果10次就用完了，那么問題究竟出現(xiàn)在哪里？大家仔細回憶每次操作，都是按要求調(diào)整了移液槍的容量刻度（15 μL），按道理應該沒有差錯的。后來我們把所有先前在進行該步驟時用到的移液槍刻度調(diào)至15 μL，吸取清水并測量體積，結果有一位成員所取清水遠多于其余成員。觀察后發(fā)現(xiàn)，問題出現(xiàn)在選用的移液槍規(guī)格上。該同學所選用的量程為100～500 μL的移液槍顯示刻度也可以調(diào)至15 μL，但取出的卻仍是量程所規(guī)定最少的100 μL。我們總結這個問題，移液槍所取試劑體積是由槍內(nèi)彈簧決定的，量程較大者內(nèi)裝彈簧的形變程度也是有限的，所以選取移液槍之前一定要仔細檢查量程是否符合要求。這同時也提醒我們，移液槍用完后要調(diào)至最大量程防止彈簧因長時間壓縮而產(chǎn)生范性形變。

參考文獻：

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