禹海鑫 黃靜 吳晶 鐘勇 孫民琴

摘要 以國(guó)內(nèi)口岸已截獲的4種寇蛛為研究對(duì)象，應(yīng)用 PCR技術(shù)擴(kuò)增這4種寇蛛標(biāo)本的COⅠ序列，并與 GenBank 記錄的5種寇蛛COⅠ序列進(jìn)行比對(duì)，分析其序列特征，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：寇蛛屬不同種類間的遺傳差異顯著，可將該 COⅠ序列作為DNA條形碼，用于寇蛛屬不同種類的分子鑒定。

關(guān)鍵詞 寇蛛屬；DNA條形碼；分子鑒定；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào) S412? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）11-0089-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.019

Study on DNA Barcoding Identification Methods of Part Species of Latrodectus

YU Hai-xin1， HUANG Jing2， WU Jing3 et al

（1.Nantong Customs，Nantong，Jiangsu 226000;2.Research Center of GACC for International Inspection and Quarantine Standards and Technical Regulations，Beijing 100000;3.Nanjing Customs， Nanjing，Jiangsu 210000）

Abstract Four species of spiders intercepted at domestic ports were studied in this paper. The COⅠ sequences of which were amplified by PCR and compared with the COⅠ sequences of five species recorded in GenBank. And the sequence characteristics were analyzed and the phylogenetic tree was constructed.The results showed that there were significant genetic differences among different species of Latrodectus， and the COⅠ sequence could be used as a DNA barcode for molecular identification of different species of Latrodectus.

Key words Latrodectus;DNA barcode;Molecular identification;Phylogeny

基金項(xiàng)目 南京海關(guān)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022KJ21）。

作者簡(jiǎn)介 禹海鑫（1984—），男，河南泌陽(yáng)人，高級(jí)農(nóng)藝師，博士，從事植物檢疫、昆蟲分類和昆蟲分子化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。

收稿日期 2023-07-21；修回日期 2023-08-12

寇蛛屬（Latrodectus）隸屬于蛛形綱（Arachnida）蜘蛛目（Araneae）球蛛科（Theridiidae）［1］，是全世界毒性最強(qiáng)的蜘蛛類群之一，其多數(shù)種類均為入侵種類［2］。該屬在全球記錄共32 種，廣泛分布于非洲、澳洲、北美南部、南美、地中海、西亞、中亞、南亞和東南亞等國(guó)家和地區(qū)。目前，我國(guó)已知有 2 種本土分布的寇蛛屬蜘蛛，分別是華美寇蛛（Latrodectus elegans Thorell，1898）和間斑寇蛛［Latrodectus tredecimguttatus（Rossi，1790）］。華美寇蛛在國(guó)內(nèi)主要分布于四川、海南、臺(tái)灣和云南，間斑寇蛛在國(guó)內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)于新疆地區(qū)［2］。寇蛛以結(jié)網(wǎng)捕食各種昆蟲為主，偶爾也捕食馬陸、虱子和其他蜘蛛等，捕食時(shí)通過(guò)注入毒素控制獵物。全球范圍內(nèi)，已報(bào)道有多例該屬蜘蛛的人畜傷害事件，被咬傷后的中毒癥狀有傷口疼痛、惡心嘔吐、體溫升高和肌肉痙攣等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致昏迷和呼吸衰竭，甚至死亡［3-5］。

近些年，隨著我國(guó)各類產(chǎn)品、貨物、集裝箱等進(jìn)出口貿(mào)易的快速發(fā)展，毒蜘蛛等外來(lái)有害生物入侵形勢(shì)日益嚴(yán)峻，對(duì)我國(guó)生物安全和人們生命健康造成極大威脅。國(guó)內(nèi)曾在多個(gè)口岸截獲到寇蛛。如2018年11月杭州海關(guān)在一批進(jìn)口加拿大山核桃原木中截獲活體紅斑寇蛛［Latrodectus mactans（Fabricius，1775）］，2021年3月南通海關(guān)從進(jìn)境國(guó)際航行船舶中截獲21只活體幾何寇蛛（Latrodectus geometricus Koch）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至 2023 年上半年，我國(guó)口岸從進(jìn)境貨物、集裝箱及舊船舶中共截獲赤背寡婦蛛［Latrodectus hasselti （Thorell 1870）］、幾何寇蛛（L.geometricus）、 紅斑寇蛛（L.mactans）、間斑寇蛛［Latrodectus tredecimguttatus（Rossi，1790）］4種寇蛛屬蜘蛛［6］。此外，2019 年有文獻(xiàn)報(bào)道幾何寇蛛（L.geometricus）在我國(guó)海南已有發(fā)現(xiàn)［2］。鑒于其極強(qiáng)的入侵性及極大的危害性，寇蛛屬蜘蛛已引起我國(guó)海關(guān)的高度重視。2018 年我國(guó)發(fā)布的關(guān)于進(jìn)口澳大利亞鮮食葡萄植物檢疫要求中，已將赤背寡婦蛛（L.hasselti）列為不得攜帶的檢疫性有害生物名錄［7］。目前，國(guó)內(nèi)各口岸主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行蜘蛛種類鑒定，但由于寇蛛體色斑紋具多態(tài)性，且多截獲卵、幼蛛等蛛態(tài)，給形態(tài)鑒定造成極大困難。因此，探索利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行物種種類鑒定非常必要。其中，利用線粒體DNA（mtDNA）、28S、ITS和18S等為代表的DNA 條形碼進(jìn)行物種種類鑒定逐漸成為主流［8-9］。其中，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因（mtDNA CO I）由于結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，種間差異大，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定中。禹海鑫等［10］利用基于COⅠ基因序列片段的DNA條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)了白條天牛屬下 13 個(gè)種類的準(zhǔn)確高效鑒定。Rueda等［11］報(bào)道了哥倫比亞發(fā)現(xiàn)的2個(gè)寇蛛屬新種Latrodectus garbae sp.nov.和Latrodectus hurtadoi sp.nov.，不僅對(duì)兩者的形態(tài)特征進(jìn)行了描述，還利用CO I及16S對(duì)其進(jìn)行了DNA條形碼鑒定方法的研究，并探索了兩者與同屬其他種類的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

筆者對(duì)口岸截獲的4種寇蛛標(biāo)本進(jìn)行了收集，對(duì)其開(kāi)展COⅠ片段擴(kuò)增、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank下載的COⅠ序列對(duì)比研究，獲得上述序列的特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以探索寇蛛各種類分子鑒定方法，以期為農(nóng)林部門、科研院所、海關(guān)等部門開(kāi)展寇蛛研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本

標(biāo)本由南通海關(guān)綜合技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室提供，包括赤背寡婦蛛（L.hasselti）、幾何寇蛛（L.geometricus）、紅斑寇蛛（L.mactans）、間斑寇蛛（L.tredecimguttatus）共4種寇蛛，以上所有標(biāo)本均經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛛形學(xué)專家鑒定，標(biāo)本截獲來(lái)源和時(shí)間見(jiàn)表1。此外，由GenBank下載得到卡提波寇蛛（Latrodectus katipo Powell，1871）、昏寇蛛（Latrodectus hesperus Chamberlin & Ivie，1935）、智利胸寇蛛［Latrodectus thoracicus（Nicolet，1849）］、蒼白寇蛛（Latrodectus pallidus Pickard-Cambridge，1872）和斑寇蛛（Latrodectus variegatus Nicolet，1849）5種寇蛛，及棕櫚象甲［Rhynchophorus palmarum（L.）］1種昆蟲（作外群），總共6條COⅠ序列用作分析比對(duì)（表2）。

1.2 基因組DNA提取

該試驗(yàn)蜘蛛樣品基因組DNA是利用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織或細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒（北京金麥格）提取。提取方法是先將各浸泡于100%乙醇的待檢蜘蛛標(biāo)本組織（少于30 mg）沖洗完畢后，轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，置于MM 400球磨儀研磨30 s（30次/s），再以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。離心完畢后加入180 mL裂解緩沖液和20 mL Proteinase K，然后置于55 ℃水中進(jìn)行10 min溫浴。再加入200 mL無(wú)水乙醇、200 mL緩沖液、20 mL磁珠和500 mL Wash Buffer。最后加入20 μL Elution Buffer，靜置10 min后洗脫磁珠，得到樣品組織基因組DNA溶液［12］。

1.3 COⅠ片段擴(kuò)增和測(cè)序

利用ProFlexTM PCR儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行PCR。試驗(yàn)采用25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer、2.0 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）（日本TaKaRa公司）、上、下游引物（10 μmol/L）（南京金斯瑞）各0.5 μL，加滅菌水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性持續(xù)5 min，94 ℃下變性持續(xù)40 s，51.3 ℃退火溫度保持30 s，72 ℃下延長(zhǎng)至1 min，設(shè)32次循環(huán)，最后一步72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后送至南京金斯瑞進(jìn)行測(cè)序［7，12］。所用PCR引物為L(zhǎng)COⅠ和HCOⅠ［12］。LCOⅠ（序列方向5′—3′）：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCOⅠ（序列方向5′—3′）：TAA ACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA。

1.4 序列處理和分析

利用SeqMan分析軟件對(duì)各樣品COⅠ序列進(jìn)行拼接和手工校正［13］，再用Blast工具進(jìn)行序列相似性搜索，確認(rèn)其方向及可信度［14］。最后利用MEGA 5.20軟件［15］計(jì)算各種類的保守位點(diǎn)（conserved sites，C）、變異位點(diǎn)（variable sites，V）、轉(zhuǎn)換和顛換值及其比值（R）、遺傳距離等數(shù)值。最后，采用鄰接法，選用Kimura2-parameter遺傳距離模型，設(shè)置重復(fù)1 500次，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA凝膠電泳

PCR擴(kuò)增出了4種寇蛛標(biāo)本的COⅠ基因片段，如圖1所示，所有樣品在約658 bp的條帶處均有清晰且特異性良好的目的條帶，可滿足后續(xù)基因測(cè)序的需要。

2.2 COⅠ序列分析

2.2.1 COⅠ基因序列的組成、變異特征。

將所有序列導(dǎo)入MEGA 5.20軟件，剪切為等長(zhǎng)的片段（428 bp）。結(jié)果顯示：保守位點(diǎn)（C）、變異位點(diǎn)（V）、自裔位點(diǎn)（S）、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（PI）分別為296、132、45和87個(gè)。對(duì)所有位點(diǎn)堿基平均含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（表3），A平均含量24.8%，C為13.7%，G為20.7%，T為40.7%。A、G含量接近，A+T含量高達(dá)65.5%，高于G+C含量（34.4%），顯示出A+T堿基偏嗜性。

2.2.2 堿基替換規(guī)律。

所有序列各位點(diǎn)堿基替換規(guī)律由MEGA 5.20軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，位點(diǎn)轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)于T、C間，顛換主要出現(xiàn)于A、T間，且轉(zhuǎn)換多于顛換，總體轉(zhuǎn)換/顛換比值（R值）為1.32。密碼子各位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，其轉(zhuǎn)換與顛換主要發(fā)生于密碼子第3位點(diǎn)，且轉(zhuǎn)換與顛換值相當(dāng)（R=1.21）。第1、2位點(diǎn)的R值分別為1.98和0.27?？傮w或密碼子各位點(diǎn)R值均小于2，顯示該段序列的轉(zhuǎn)換與顛換尚未達(dá)到飽和，在系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建時(shí)要考慮轉(zhuǎn)換和顛換發(fā)生概率問(wèn)題（表4）。

2.2.3 遺傳距離。

基于Kimure 2-parameter模型，對(duì)上述9種寇蛛和1種昆蟲進(jìn)行遺傳距離分析，利用1 500次Bootstrap值進(jìn)行檢驗(yàn)［15］。結(jié)果顯示（表5），寇蛛屬內(nèi)各種類的遺傳距離數(shù)值位于0.060～0.531，其中哈氏寇蛛（L.hasselti）和卡提波寇蛛（L.kaptipo）的遺傳距離最小，為0.060，主要原因可能是哈氏寇蛛（L.hasselti）主要分布在東南亞至澳大利亞，且廣布于新西蘭，而卡提波寇蛛（L.kaptipo）主要分布在新西蘭，兩者的地理分布有較大部分的重疊，兩者間存在一定的基因交流，從而導(dǎo)致遺傳距離小，親緣關(guān)系較近。不隸屬于同一個(gè)綱的種類遺傳距離較遠(yuǎn)，數(shù)值一般在0.424～0.531，其中斑寇蛛（L.variegatus）和棕櫚象甲（R.palmarum）的距離最大，為0.531。該結(jié)果表明，同隸屬于寇蛛屬的多個(gè)種類間的遺傳距離較小，且其遺傳距離與地理分布之間存在密切關(guān)系；而隸屬于不同綱目的生物種類間遺傳差距大，呈現(xiàn)出較為明顯的遺傳差異性。

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

采用 MEGA 5.20分析軟件，選擇棕櫚象甲（R.palmarum）為外群，以寇蛛屬9種蜘蛛共9條COⅠ序列為靶標(biāo)，基于鄰接法（ Neighbor-Joining， NJ ） 探索分子系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，寇蛛屬各種類聚成一大支，外群的棕櫚象甲（R.palmarum）單獨(dú)成為一支?？苤雽偎鄣囊淮笾е?，間斑寇蛛（L.tredecimguttatus）、哈氏寇蛛（L.hasselti）與卡提波寇蛛（L.katipo）聚為一支，蒼白寇蛛（L.pallidus）與斑寇蛛（L.variegatus）聚為一支，昏寇蛛（L.hesperus）與紅斑寇蛛（L.mactans）聚為一支，這3支互為姊妹群，親緣關(guān)系較近。從局部來(lái)看，哈氏寇蛛（L.hasselti）與卡提波寇蛛（L.katipo）、蒼白寇蛛（L.pallidus）與斑寇蛛（L.variegatus）、昏寇蛛（L.hesperus）與紅斑寇蛛（L.mactans）各聚為一小支，且置信度均很高，說(shuō)明它們各自之間的親緣關(guān)系最近。參考上述蜘蛛的地理分布情況可以發(fā)現(xiàn)，哈氏寇蛛（L.hasselti）與卡提波寇蛛（L.katipo）均在新西蘭有分布，蒼白寇蛛（L.pallidus）與斑寇蛛（L.variegatus）均主要分布于南美洲，昏寇蛛（L.hesperus）與紅斑寇蛛（L.mactans）均主要分布于北美洲，可見(jiàn)地理分布有重疊的寇蛛種類，其遺傳距離更小，親緣關(guān)系也更近，地理分布與遺傳距離之間存在著一定關(guān)系。此外，智利胸寇蛛（L.thoracicus）和幾何寇蛛（L.geometricus ）由近及遠(yuǎn)又分別與上述大支聚在一起，說(shuō)明其親緣關(guān)系也由近及遠(yuǎn)。棕櫚象甲（R.palmarum）隸屬于昆蟲綱，其與上述蛛形綱寇蛛屬種類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，位于外群。結(jié)果顯示，寇蛛屬內(nèi)不同的種類間系統(tǒng)進(jìn)化差異較為明顯，可將該COⅠ序列作為DNA條形碼用于寇蛛屬分子鑒定。

3 結(jié)論與建議

一般而言，DNA條形碼須同時(shí)滿足每個(gè)物種均具獨(dú)特且又相對(duì)保守的DNA條形碼序列和該條形碼序列種間差異須遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其種內(nèi)差異這2個(gè)必要條件，才能用于物種分子鑒定［10］ 。由于線粒體COⅠ基因可同時(shí)滿足這2個(gè)條件，因此是常用于物種鑒定的DNA 條形碼，類似的還有 Cytb、18S、ITS、rbcL等［8-10］?；贑OⅠ基因序列片段的DNA條形碼也已在寇蛛屬蜘蛛研究中得以應(yīng)用。例如，Garb等系統(tǒng)研究了寇蛛屬蜘蛛生物地理學(xué)和入侵歷史，并利用基因條形碼COⅠ對(duì)其屬下各種類進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究［16］。

近些年，我國(guó)外貿(mào)進(jìn)出口規(guī)模保持強(qiáng)勁走勢(shì)，伴隨而至的外來(lái)有害生物入侵風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)加大。國(guó)內(nèi)各口岸從進(jìn)境棉花、廢紙、原木、集裝箱、舊航行船舶等中截獲寇蛛的頻率有所增大［6-7］。因該屬蜘蛛體色多變，且常以卵、卵囊、幼蛛等狀態(tài)出現(xiàn)，用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定存在較大困難。

該研究分析比對(duì)了口岸截獲的4種寇蛛屬蜘蛛COⅠ序列與 GenBank 獲取的同屬其他種類的COⅠ序列，結(jié)果表明該序列可以用于寇蛛屬各種類的鑒定。此外，該研究結(jié)果不僅對(duì)寇蛛屬COⅠ序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了擴(kuò)充，也為將DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用于口岸截獲蛛形綱動(dòng)物的種類鑒定提供了參考。該研究中還發(fā)現(xiàn)，由于各生物體的各種基因均含有不同的遺傳進(jìn)化信息，各基因也具有相異的遺傳進(jìn)化速率，因此，在口岸截獲蛛形綱動(dòng)物分子鑒定方法探索中，還應(yīng)注意結(jié)合多類DNA條形碼及多種類大數(shù)量蜘蛛標(biāo)本進(jìn)行研究，以期獲得更準(zhǔn)確的分子鑒定結(jié)果。

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