謝海霞等

摘 要 對海南島南部三亞、瓊海、陵水等南繁水稻產區(qū)市縣的病毒病發(fā)生情況進行調查，同時根據(jù)國內外已報道的10種主要水稻病毒設計特異PCR檢測引物，對23個疑似水稻病毒樣品進行分子檢測，結果表明：海南南繁區(qū)水稻病毒病主要有2種，即由南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病和由水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）引起的水稻齒葉矮縮??；經分子檢測鑒定了6例南方水稻黑條矮縮病樣品和14例水稻齒葉矮縮病樣品，檢出2個交叉復合感染的樣品，2種病樣的檢出率分別為 26.09%和60.87%，其余8種水稻病毒均未檢測到。研究結果表明，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁水稻種植區(qū)域需重點防治的病害對象。

關鍵詞 南繁 ；水稻 ；黑條矮縮病 ；齒葉矮縮病 ；分子鑒定

分類號 S435.111.1

Abstract Circumstance of rice virus disease in southern Hainan island rice-planting areas including Sanya， Qionghai and Lingshui was investigated. Specific primers for 10 known rice virus species were designed for PCR tests. A total of 23 suspected virus-infected samples were tested. Molecular identification results showed that there were two major rice virus species existed in Hainan winter-breeding areas： southern rice black-streaked dwarf virus （SRBSDV） and rice ragged stunt virus （RRSV）. 6 SRBSDV-infected samples and 14 RRSV-infected samples were identified by PCR and sequencing methods. 2 samples were co-infected by both SRBSDV and RRSV. Infection rates of SRBSDV and RRSV were 26.09% and 60.87%， separately. The other 8 viruses were not detected. This study showed that SRBSDV and RRSV are key diseases in Hainan winter-breeding areas and should be carefully prevented.

Keywords Hainan winter-breeding areas ； rice ； SRBSDV ； RRSV ； molecular identification

中國已發(fā)現(xiàn)的水稻RNA病毒約有10種[1]，包括水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）、水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）、水稻矮縮病毒（rice dwarf virus，RDV）、水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）、水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）、水稻東格魯球狀病毒（rice tungro spherical virus，RTSV）、水稻黃矮病毒（rice yellow stunt virus，RYSV）和水稻黃斑駁病毒（rice yellow mottle virus，RYMV）。由水稻病毒引起的水稻病毒病已成為影響水稻生產的主要病害。20世紀50年代水稻黑條矮縮病首次在中國被報道，90年代后在中國南方水稻產區(qū)流行，近年來呈逐年加重的趨勢，造成嚴重的經濟損失[2-4]。其中，南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）是在廣東、海南等地新發(fā)現(xiàn)的一種水稻病毒，主要由白背飛虱（Sogatellafurcifera）以持久性方式傳播[5-6]。此外，水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）是危害水稻生產的一種世界性病害，在中國、日本、菲律賓和東南亞地區(qū)都有報道。

南繁是指每年9月至次年5月在海南省南部的三亞、樂東、陵水等地從事農作物品種選育、種子生產和種質鑒定等。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國有30個省（市、自治區(qū)）的550多家單位近5 000名科技人員云集于海南南繁區(qū)域開展育種工作。南繁育種區(qū)域聚集了豐富的水稻種質資源，為水稻品種選育提供了優(yōu)良的育種材料，已成為中國水稻育制種的“綠色基因庫”[7]。然而，由于南繁區(qū)水稻育種材料的匯聚和擴散，南繁區(qū)域也極易于成為水稻病毒病害傳播和擴散的源頭，對南繁水稻種業(yè)的健康發(fā)展構成了潛在的威脅。但目前尚未見關于南繁區(qū)水稻病毒病害的報道。鑒于此，本研究調查和鑒定了海南省三亞、陵水、瓊海等水稻種植區(qū)域的病毒為害情況，為防治和控制南繁區(qū)水稻病毒的為害和傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年1月，在海南島南繁區(qū)域（包括三亞、陵水、瓊海等縣市水稻產區(qū)）共采集23份水稻疑似病毒病害樣品（表1），每份樣品采集水稻葉片3～5片，編號和記錄后置于冰袋中保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據(jù)文獻報道獲得水稻病毒PCR檢測引物信息（表2），或通過GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢獲得水稻病毒的mRNA序列信息，利用Primer3軟件（http：//primer3.ut.ee/），采用默認參數(shù)設計獲得PCR檢測引物序列（表2）。

1.2.2 總RNA提取及反轉錄

采用Plant RNA Extraction kit試劑盒（TianGen Biotech）提取水稻葉片總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA的完整性，用RNA反轉錄試劑盒（Fermantas）將總RNA反轉錄得到cDNA，用作PCR反應的模板。

1.2.3 PCR檢測

分別用表2中的引物對反轉錄所得到的cDNA進行PCR擴增。反應體系如下：模板cDNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，Ex-Taq 0.25 μL，10× Buffer 2 μL，10 mmol/L 正反引物各0.5 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。PCR擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR結束后，取8 μL產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 克隆轉化

采用DNA回收試劑盒（Sangon）回收PCR產物，將其連接到pMD18-T載體上，12 h后將連接產物轉化大腸桿菌DH5α；12～16 h后，挑取平板上的單菌落接種于含有0.1%氨芐的LB培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)8 h，然后使用克隆載體通用引物M13-47和RV-M進行菌液PCR；反應結束后取8 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；挑取陽性克隆送上海Sangon公司測序。

1.2.5 序列測定和同源性比較

將測序結果去除低質量序列和污染序列后，登錄GenBank進行BLASTn比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.

cgi），通過序列相似性比較，判斷來源病毒物種名稱。

2 結果與分析

2.1 水稻總RNA的提取

經提取獲得23個水稻葉片樣品的總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，RNA主要集中于100、750、1 500 bp 三個條帶長度，RNA質量較好（OD260/OD280≈2.0），符合RT-PCR試驗的要求（圖1）。

2.2 RT-PCR檢測

獲得樣品總RNA后，經反轉錄獲得cDNA，利用所獲得的PCR引物（表2）對23個疑似病毒樣品依次進行RT-PCR檢測。結果顯示，除SRBSDV和RRSV檢測呈陽性以外，其它病毒引物檢測都為陰性（圖2，3）。

應用南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）引物檢測樣品時，其中NFR3、NFR7、NFR8、NFR9、NFR16、NFR19共6例樣品的檢測顯示為陽性，在600 bp目標區(qū)域有明顯的PCR產物條帶（圖2）。23例疑似病害樣品中，南方水稻黑條矮縮病毒檢出率為26.09%。而應用水稻齒葉矮縮病毒（RRSV）引物檢測樣品時，其中NFR2、NFR3、NFR4、NFR5、NFR9、NFR10、NFR12、NFR13、NFR14、 NFR15、NFR20、NFR21 、NFR22、NFR23共14例樣品的檢測顯示為陽性，在700 bp目標區(qū)域有明顯的PCR產物條帶（圖3）。23例疑似病害樣品中，水稻齒葉矮縮病毒檢出率達60.87%。檢測結果顯示，NFR3和NFR9 2例樣品在SRBSDV和RRSV引物檢測中均呈陽性，可能同時交叉感染這2種病毒（圖2，3）。

2.3 病毒序列鑒定

通過對PCR檢測為陽性的產物進行回收、克隆轉化和測序鑒定，獲得了PCR擴增產物的核苷酸序列信息，并將其與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLASTn比對（表3）。鑒定結果顯示，14例樣品為水稻齒葉矮縮病毒感染，6例樣品為南方水稻黑條矮縮病毒感染，其中NFR3和NFR9 2例樣品同時感染了上述2種病毒。結果表明，危害南繁區(qū)域水稻的水稻齒葉矮縮病毒為同一種（序列號：GQ329711.1），與此同時，可能存在多個危害南繁區(qū)域水稻的南方水稻黑條矮縮病毒變種。

3 討論

本研究基于已知的10種水稻RNA病毒設計了RT-PCR引物，對從南繁區(qū)采集的23個疑似病害樣品進行檢測，獲得南方水稻黑條矮縮病毒感染樣品6例、水稻齒葉矮縮病毒感染樣品14例，其中有2例是復合感染的樣品，沒有檢測到其余8種水稻病毒侵染的樣品。已知的10種水稻RNA病毒基因組均屬于雙鏈RNA（dsRNA）類型，在病毒感染的不同時期寄主體內的病毒dsRNA含量發(fā)生變化，因此在提取疑似病樣的總RNA時，難以獲得一些病毒dsRNA含量較低的RNA樣品，導致PCR檢測呈陰性。此外，除已報道的10種水稻RNA病毒以外，可能存在未知的病毒種類，由于缺少基因組信息，因此還無法通過PCR檢測到。

本研究結果顯示，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是中國南繁區(qū)域危害水稻的2種主要病毒。近年來，南方水稻黑條矮縮病毒已成為危害中國水稻生產的重要病毒，主要在以種植秈稻為主的長江以南地區(qū)為害水稻，在南方的13個省份均有報道，造成了嚴重的損失[15]。水稻黑條矮縮病毒主要在長江流域水稻種植區(qū)域發(fā)生為害，尤其在江蘇地區(qū)，水稻黑條矮縮病毒幾乎遍布全省[3]。據(jù)報道，這2種病毒可侵染常規(guī)粳稻、常規(guī)秈稻、雜交粳稻、雜交秈稻、常規(guī)糯稻等，生產中尚未見對這2種病毒高抗的水稻類型或品種[11，15-16]。據(jù)報道，由于水稻齒葉矮縮病毒病害發(fā)病率普遍較低，未廣泛流行，導致該病未得到重視。但是，該病近年在中國南方局部地區(qū)已造成比較嚴重的損失，有流行爆發(fā)的可能[16]。

鑒于中國海南南繁區(qū)域水稻育種材料來源廣泛且易于擴散的特殊性，亟待加強對水稻病毒的檢測和檢疫。本研究結果發(fā)現(xiàn)，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁區(qū)域目前需要重點防控的病害對象，南繁區(qū)域發(fā)現(xiàn)的南方水稻黑條矮縮病毒的多樣性較高，可能存在多個變種。鑒于病毒極易產生變異而導致防治困難的特點，建議南繁區(qū)域科研單位重點加強對上述2種病毒的檢疫和檢測，預防水稻病毒病的大規(guī)模為害。在本研究基礎上，筆者分別研發(fā)了用于快速檢測和鑒定南方水稻黑條矮縮病毒、水稻齒葉矮縮病毒的分子檢測試劑盒（待發(fā)表），為南繁區(qū)域水稻病毒的檢測和防疫提供技術支持。

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