張宗豪　李玉玲

摘要：在冬蟲夏草真菌培養(yǎng)過程中，菌株SH-1菌絲產(chǎn)生粉紅色變化的現(xiàn)象，粉紅菌株ZH-1與正常菌株SH形態(tài)存在很大差異。菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1的ITS序列比對鑒定結(jié)果表明，11株SH-1和2株ZH-1都能擴增出條帶，條帶清晰且穩(wěn)定，分布在500～750 bp范圍內(nèi)，13株菌株在GenBank中應(yīng)用Blast比對都與Paecilomyces sp. Cs-4（EU328187）的相似性達到了100%。用3種方法對13株菌株ITS序列與分離自冬蟲夏草的32株真菌ITS序列（下載自GenBank）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，3種方法都顯示13株菌株與蝙蝠蛾擬青霉分為1支，可以確定粉紅菌株ZH-1與正常菌株SH-1為同一個種，即蝙蝠蛾擬青霉。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；分子鑒定；粉紅變化；ITS序列；系統(tǒng)進化樹

中圖分類號： S567.3+50.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0059-05

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis （BerK.） Sacc.]屬真菌界（Fungi）子囊菌綱（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲夏草屬（Cordyceps）的冬蟲夏草菌（Cordyceps sinenss）寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，《中華人民共和國藥典》對其功用的描述是：“補肺益腎，止血化痰。用于久咳虛喘，陽痿遺精，腰膝酸痛”。冬蟲夏草主要分布在我國的青海、西藏、四川、甘肅等?。▍^(qū)）海拔3 000～5 000 m的部分地區(qū)，冬蟲夏草是主產(chǎn)區(qū)群眾經(jīng)濟財源的重要組成部分[2]。近年來冬蟲夏草采挖嚴重過度，使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭，野生冬蟲夏草生產(chǎn)面積正在逐年縮小，產(chǎn)量也隨之大降[3]。

冬蟲夏草人工培育的菌絲體成分、含量與天然冬蟲夏草非常相似，是天然冬蟲夏草最適替代品[4-6]。在本實驗室靜止培育冬蟲夏草菌株SH-1的過程中，發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)瓶內(nèi)菌絲體生長到一定時期，從中間開始轉(zhuǎn)化成粉紅色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面變成有張力、有韌性的光滑表面，富含水分，周圍又形成多層毛刺狀結(jié)構(gòu)，生長瓶內(nèi)培養(yǎng)物往往形成一個整體，周圍與瓶壁緊密結(jié)合，培養(yǎng)物顏色鮮艷，整體呈果凍狀。把產(chǎn)生變化后的粉紅色菌株編號為ZH-1。

基因序列在生物進化過程中的改變速率是一定的，目前對真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究的基礎(chǔ)方法之一是對菌體的某一段DNA序列進行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)樹，以此探討它們的系統(tǒng)演化關(guān)系。本研究利用ITS1-5.8S-ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來驗證正常菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1的親緣關(guān)系，為探討產(chǎn)生粉紅菌株的機理提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器、試劑

（1）供試菌種：冬蟲夏草菌由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院純化培養(yǎng)，編號為SH-1，由SH-1轉(zhuǎn)變來的粉紅菌株編號 ZH-1，保存于筆者所在研究室。（2）主要儀器：組培瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、多功能光照培養(yǎng)箱、FA1004電子分析天平。（3）分離用固體培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，牛肉膏3 g，自來水補足至 1 000 mL，自然pH值。（4）培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基：每200 mL溶液中含馬鈴薯20 g，胡蘿卜10 g，氮源A 45 mL，氮源B 5 g，葡萄糖8 g，MgSO4 0.1 g，K2HPO4 0.4 g。

1.2 方法

1.2.1 總基因組DNA的提取 （1）樣品的處理：取新鮮樣品100 mg，用適量的液氮重復(fù)研磨3次，并加入溶液A 200 μL，用玻璃研磨器適當(dāng)研磨，加入20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩5 min。干品須在烘箱中干燥2 h，取50 mg進行上述操作。（2）加入20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55 ℃水浴消化30 min。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，12 000 r/min離心2 min。將上清轉(zhuǎn)移到1個新的離心管中，如有沉淀，可再次離心。（3）在上清中加入200 μL溶液B，充分混勻，如出現(xiàn)白色沉淀，可于55 ℃水浴5 min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)試驗；如溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能導(dǎo)致提取的DNA量少而不純，還有可能導(dǎo)致上柱后堵柱子，可增加消化時間。（4）再加入200 μL無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，放置 2 min。（5）12 000 r/min離心1 min，去除廢液，將吸附柱放入收集管中。（6）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12 000 r/min 離心1 min，去除廢液，將吸附柱放入收集管中。（7）向吸附柱中加入500 mL漂洗液，12 000 r/min離心 1 min，去除廢液，將吸附柱放入收集管中。（8）12 000 r/min離心2 min，將吸附柱置于室溫或50 ℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)試驗，比如酶切、PCR等。（9）將吸附柱放入1個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50～200 μL經(jīng)65 ℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5 min，12 000 r/min離心1 min。（10）離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min 離心2 min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。

1.2.2 ITS rDNA片段PCR擴增 利用真菌通用引物ITS4/5，以提取的總基因組DNA為模板，把dNTP、buffer、引物、無菌蒸餾水及聚合酶混勻后放入PCR儀擴增。初始變性溫度為94 ℃，退火溫度為40 ℃，共35個循環(huán)，獲得產(chǎn)物是ITS4/5 rDNA片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳純化后測序。引物[7]序列如下：ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載冬蟲夏草及蟲草屬相關(guān)菌株的ITS序列（表1）。2株ZH-1、11株SH-1與32個從GenBank得到的相似序列文件經(jīng)ClustalX 2.0軟件掐頭去尾編輯后，由BioEdit 7.0軟件轉(zhuǎn)換為Fasta格式，再由MEGA 6.0軟件進行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次Bootstrap檢驗[8]。發(fā)育樹構(gòu)建方法有鄰位相連法（neighbor-joining methods）、最大簡約法（maximum parsimony methods）和最大似然法（maximum likelihood methods）[9-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增電泳結(jié)果

使用真菌DNA基因組提取試劑盒提取2株粉紅菌株WRF-11、WRF-12和11株SH-1菌株的DNA，其ITS PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均能擴增出目的條帶，條帶清晰且穩(wěn)定，擴增產(chǎn)物大小均在500～750 bp之間（圖1）。

2.2 ITS序列測序和比對結(jié)果

從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和各比對指標確定距離與同源性（表2至表5），可以看出粉紅菌株ZH-1和菌株SH-1在GenBank中的相似序列都較多，最具鑒定意義的序列是Paecilomyces sp. Cs-4（EU328187.1），同源性達到了最高（Blast中max ident都為100%）；與其他蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyces hepiali（EF555097、AF461743、KF297209）的相似性也在99%，可以認定菌株SH-1、粉紅菌株ZH-1在分類學(xué)上與Paecilomyces sp. Cs-4菌株是同種的，屬于擬青霉屬真菌蝙蝠蛾擬青霉。

3 討論

利用分子生物學(xué)手段鑒定真菌的類別，首要的前提是樣本的保存和提取質(zhì)量好的真菌DNA。由于冬蟲夏草人工培育階段的菌株SH-1和ZH-1有性孢子獲取困難，對鑒定是否是同一個種有一定的難度，所以選擇比較容易的真菌菌絲提取DNA。提取過程中發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周左右，菌絲體DNA的產(chǎn)量較高，對后期檢測比較有利。

對2株ZH-1菌株和11株SH-1菌株的DNA分析中發(fā)現(xiàn)，雖然ZH-1菌株和SH-1菌株以及SH-1菌株之間在液體培養(yǎng)時形態(tài)上有或多或少的差別，但是在分子水平上13個菌株的ITS保守序列差異極小，可以確定為同一個種。表明真菌存在形態(tài)多樣性，在特定的環(huán)境中，真菌在形態(tài)和成分上會發(fā)生變化，但在遺傳上沒有太大變化。那么菌種變化的幅度有多大，需要經(jīng)過多少時間、傳多少代會失去活力變成另外一種形態(tài)？是不是菌種形態(tài)的變化也是一種生存策略，而不是因為退化老化？是不是存在菌株間的雜交引起的變化，或者是病害引起的變化？這些問題有待進一步研究。

2種性狀的冬蟲夏草菌株在同樣的培養(yǎng)條件下，生長量是不一樣的。前期（5～7 d內(nèi)）菌株SH-1開始生長，菌絲體附著在瓶壁向內(nèi)開始延伸，在菌絲體形成的平面中央閉合形成菌蓋，并向上、下2個面繼續(xù)生長。中期（7～26 d）一小部分正常菌絲尚未形成閉合狀菌蓋時，浸入到液體內(nèi)的菌絲體由白色絨毛狀變成透明狀，再變?yōu)榉奂t狀，這種菌絲體沿著從中心到瓶壁的方向把正常菌絲逐漸變成為粉紅菌絲；一小部分正常菌絲形成菌蓋后，由中部某一個點上發(fā)生這種變化，但大部分能夠正常生長。后期（26～60 d）已轉(zhuǎn)變成粉紅色的菌株ZH-1在外力破壞其生長環(huán)境時，如搖床等，部分可重新轉(zhuǎn)變?yōu)闉榫闟H-1生長，而未變化的菌株SH-1很少會出現(xiàn)粉紅變化。同一種菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變是否跟環(huán)境脅迫有關(guān)聯(lián)、是否與冬蟲夏草形成過程中多菌聯(lián)合侵染有關(guān)聯(lián)，這些問題還有待進一步觀察。

參考文獻：

[1]梁宗琦. 中國真菌志：第三十二卷 冬蟲夏草屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，1991：9-10.

[2]章力建，李 兵，胡育驕. 中國冬蟲夏草資源管理概況[J]. 中國草地學(xué)報，2010，32（增刊1）：1-5.

[3]劉錫琎，郭英蘭，俞永信，等. 冬蟲夏草菌無性階段的分離和鑒定[J]. 菌物學(xué)報，1989，8（1）：35-40.

[4]陳慶濤，肖生榮，施至用. 中國擬青霉新種及其與蟲草的關(guān)系[J]. 真菌學(xué)報，1984，1（1）：9-13.

[5]俞永信. 人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究[J]. 菌物研究，2004（2）：42-46.

[6]劉作易. 蟲草屬及其無性型關(guān)系研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，1999：1-180.

[7]朱佳石，郭英蘭，姚藝桑，等. 冬蟲夏草和中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉DNA共存及競爭增殖力，化學(xué)成分變化[J]. 菌物研究，2007，5（4）：214-224.

[8]何蘇琴，王三喜，羅進倉，等. 冬蟲夏草成熟過程中中國被毛孢形態(tài)學(xué)再研究[J]. 微生物通報，2011，38（11）：1730-1738.

[9]Zhu J S，Halpern G M，Jones K. The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine：Cordyceps sinensis：part Ⅰ[J]. Journal of Alternative and Complementary Medicine，1998，4（3）：289-303.

[10]Chen J，Zhang W，Lu T，et al. Morphological and genetic characterization of a cultivated Cordyceps sinensis fungus and its polysaccharide component possessing antioxidant property in H22 tumor-bearing mice[J]. Life Sciences，2006，78（23）：2742-2748.

[11]Xiao W，Yang J L，Zhu P，et al. Non-support of species complex hypothesis of Cordyceps sinensis by targeted rDNA-ITS sequence analysis[J]. Mycosystema，2009，28（6）：724-730.

[12]Ni L Q，Yao Y S，Gao L，et al. Density-weighted algorithms forsimilarity computation and cluster tree construction in the RAPD analysis of natural Cordyceps sinensis[J]. American Journal of Biomedical Sciences，2014，6（2）：82-104.

[13]李增智，黃 勃，李春如，等. 確證冬蟲夏草無性型的分子生物學(xué)證據(jù)[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19（1）：60.

[14]Zhang Y J，Li E W，Wang C S，et al. Ophiocordyceps sinensis，the flagship fungus of China：terminology，life strategy and ecology[J]. Mycology，2012，3（1）：2-10.