袁邦群 胡錚瑢 王巧云 唐巍

摘 要：隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，動(dòng)源性農(nóng)產(chǎn)品中磺胺類獸藥抗菌增效劑的使用逐漸增多，其引發(fā)的殘留問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注。本文綜述動(dòng)源性農(nóng)產(chǎn)品中磺胺類抗菌增效劑殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，并提出未來(lái)研究的發(fā)展方向，以保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全。

關(guān)鍵詞：磺胺類；抗菌增效劑；檢測(cè)方法

Research Progress in Detection Methods of Sulfonamide Antibacterial Synergists Residues

YUAN Bangqun， HU Zhengrong， WANG Qiaoyun， TANG Wei

（Loudi Institute for Food and Drug Inspection and Testing， Loudi 417000， China）

Abstract： With the development of agricultural science and technology， the use of sulfonamide veterinary drug antibacterial synergists in dynamic agricultural products has gradually increased， and the residue problem caused by them has attracted widespread attention. In this paper， we summarize the research progress of the detection method of sulfonamide antimicrobial synergist residues in dynamic agricultural products， and put forward the development direction of future research to ensure the quality and food safety of agricultural products.

Keywords： sulfonamides; antibacterial synergists; detection methods

動(dòng)源性農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與供應(yīng)在滿足不斷增長(zhǎng)的食品消費(fèi)需求方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，防治細(xì)菌感染導(dǎo)致的疾病，農(nóng)戶在生產(chǎn)中廣泛使用抗菌藥物及抗菌增效劑?？咕鲂┡c抗菌藥物聯(lián)用能顯著提高藥物活性組分在動(dòng)物體內(nèi)的利用率，同時(shí)能降低藥物用量、增強(qiáng)藥物療效、降低細(xì)菌耐藥性[1-3]。

抗菌增效劑和其他類型的抗菌藥物聯(lián)用在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的需求不斷增加，其殘留問(wèn)題逐漸引起了社會(huì)關(guān)注。中國(guó)、美國(guó)、歐盟等國(guó)家和地區(qū)對(duì)食品抗菌增效劑的殘留量有著明確的規(guī)定，因此針對(duì)殘留的抗菌增效劑建立高效、便捷的檢測(cè)方法成為急需解決的問(wèn)題。目前，常見(jiàn)的抗菌增效劑的檢測(cè)方法有電化學(xué)法[4]、分光光度法[5]、膠體金免疫層析法[6]、酶聯(lián)免疫法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法[7]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）[9]以及高分辨質(zhì)譜等。本文對(duì)抗菌增效劑殘留檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中存在的問(wèn)題進(jìn)行分析，以期為磺胺類抗菌增效劑檢測(cè)方法的優(yōu)化和改進(jìn)提供參考。

1 磺胺類抗菌增效劑

目前磺胺類抗菌增效劑主要有甲氧芐啶（Trimethoprim）、二甲氧芐啶（Diaveridine）、三甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim）、二甲氧芐氨嘧啶（Diaveridine）、巴喹普林（Baquiloprim）和奧美普林（Ormetoprim）等（圖1）。

甲氧芐啶、二甲氧芐啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧芐氨嘧啶[10-12]等在獸醫(yī)臨床上常作為抗菌增效劑和其他藥物聯(lián)合使用，主要用于治療雞白痢、雞球蟲(chóng)病、兔球蟲(chóng)病、禽霍亂、羔羊痢疾、仔豬白痢以及呼吸道繼發(fā)性細(xì)菌性感染等疾病。巴喹普林[13]主要用于豬、牛等大型家畜的炎癥治療，具有與甲氧芐啶相似的廣譜抗菌活性，而消除半衰期有所延長(zhǎng)，能夠克服甲氧芐啶的協(xié)同性缺點(diǎn)。含有奧美普林的復(fù)方制劑主要在家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較多。近5年，沒(méi)有出現(xiàn)新的奧美普林和巴喹普林的制劑，目前國(guó)內(nèi)這兩種增效劑品種少，其主要在國(guó)外市場(chǎng)進(jìn)行使用和開(kāi)發(fā)。

2 磺胺類抗菌增效劑檢測(cè)方法

隨著科技的發(fā)展與進(jìn)步，針對(duì)抗菌增效劑的檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展，不同檢測(cè)方法對(duì)環(huán)境的需求不同，以下針對(duì)磺胺類抗菌增效劑的檢測(cè)方法的研究進(jìn)展展開(kāi)論述。

2.1 分光光度法

樊雪梅等[14]利用檸檬酸還原HAuCl4合成帶負(fù)電荷的Au納米粒子（AuNPs），在酸性條件下，合成的AuNPs被檸檬酸根離子包裹，帶有負(fù)電荷，呈酒紅色，與帶正電荷的甲氧芐啶聚合，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。在檸檬酸鈉-HCl緩沖溶液（pH=3.95）中，648 nm波長(zhǎng)處，吸光度與甲氧芐啶濃度在10～150 mg·L-1有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995 7，檢出限為3.5 mg·L-1，回收率在97.7%～104.1%。該方法操作簡(jiǎn)單，可用于食品樣品中三甲氧芐氨嘧啶殘留的測(cè)定。張桂枝等[5]在

288 nm波長(zhǎng)下，采用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定甲氧芐啶的含量，發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶平均回收率為97.09%。由此可見(jiàn)，分光光度法在抗菌增效劑中的檢測(cè)中具有簡(jiǎn)單快速、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 微生物法、免疫分析法

傳統(tǒng)微生物抑菌培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)食品的抗生素及增效劑的殘留，但相關(guān)研究也表明微生物法準(zhǔn)確性較差、檢測(cè)周期長(zhǎng)，常規(guī)微生物法無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)的需求。孫晶瑋等[15]采用嗜熱鏈球菌對(duì)生牛乳中青霉素及磺胺類抗生素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)青霉素鈉有較好的選擇性，檢出量達(dá)到

0.007 U·mL-1；對(duì)磺胺類抗生素的選擇性低，無(wú)法達(dá)到準(zhǔn)確判斷的目的。大量研究表明微生物法準(zhǔn)確性較差、檢測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)工作的需求。

因此，學(xué)者們提出采用免疫分析法檢測(cè)抗菌增效劑殘留。用于抗菌增效劑檢測(cè)的免疫分析法主要分為膠體金免疫層析法和酶免疫分析法等。邢維維等[16]將待測(cè)樣本與藥物的單克隆抗體及酶標(biāo)二抗充分混合，將甲氧芐啶抗原包被于不同的酶標(biāo)微孔內(nèi)，通過(guò)對(duì)配方進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)所建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法對(duì)豬肉中甲氧芐啶的檢出限達(dá)到10 μg·kg-1。該方法前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、重復(fù)性高，適用于豬肉中抗菌增效劑殘留量的檢測(cè)。HAN等[17]同樣采用ELISA試劑盒測(cè)定水中甲氧芐啶殘留量。甲氧芐啶與馬來(lái)酸酐反應(yīng)生成甲氧芐啶半抗原，經(jīng)一系列反應(yīng)制備甲氧芐啶抗原，然后用ELISA試劑盒測(cè)定甲氧芐啶在水中的檢出限（2.34 μg·kg-1），加標(biāo)回收率為60.5%～79.7%。李曉娜等[6]采用膠體金免疫層析法對(duì)牛奶中甲氧芐啶的含量進(jìn)行快速篩查。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)限為2 ng·L-1，檢測(cè)時(shí)間為6 min。該方法具有特異性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和檢測(cè)。

免疫學(xué)方法作為抗菌增效劑殘留檢測(cè)領(lǐng)域的重要手段，以其高度特異性和較短的分析時(shí)間受到重視。通過(guò)利用抗體與目標(biāo)抗菌增效劑的特異性結(jié)合，免疫學(xué)方法能夠提供準(zhǔn)確的定量和定性結(jié)果。其優(yōu)勢(shì)在于操作流程簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)畜禽產(chǎn)品中抗菌增效劑的批量、快速檢測(cè)，適用于需要迅速得到檢測(cè)結(jié)果的場(chǎng)景。然而，免疫學(xué)方法也存在一些不足，如檢測(cè)過(guò)程中可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)樣品中其他成分的誤檢；部分免疫學(xué)方法的適用范圍有限，無(wú)法涵蓋所有抗菌增效劑。未來(lái)，相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，免疫學(xué)方法將得到進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)于抗菌增效劑殘留的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要意義。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳作為一種高效分離技術(shù)，能夠快速、高效地分離不同的化合物，具有高分辨率、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能夠提高檢測(cè)效率。

GIBBONS等[18]建立了采用毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)同時(shí)分析未經(jīng)處理廢水中甲氧芐啶的方法。發(fā)現(xiàn)該方法的檢出限為1.6～68.7 μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)定量限為0.63～7.72 mg·L-1。徐建君等[7]采用毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法對(duì)基質(zhì)中甲氧芐啶進(jìn)行檢測(cè)，以4.0 mmol·L-1 HAc和10%甲醇（pH值4.0）為電泳介質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化條件下，甲氧芐啶峰形良好，出峰時(shí)間小于6 min，線性范圍為1.5～120.0 μg·mL-1，檢出限

0.5 μg·mL-1。毛細(xì)管電泳法具有檢測(cè)速度快、樣品使用量少、檢驗(yàn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度較低，不適用于痕量分析。

2.4 電化學(xué)法

電化學(xué)方法由于靈敏度高、響應(yīng)快、不需要昂貴的設(shè)備，且前處理簡(jiǎn)單，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境分析等領(lǐng)域。蘭天宇等[19]和趙文娟[4]分別以電活化玻碳電極和炭黑-Nafion修飾玻碳電極，運(yùn)用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法對(duì)甲氧芐啶進(jìn)行測(cè)定，研究了該修飾電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，在反應(yīng)體系中，電極對(duì)甲氧芐啶的電化學(xué)氧化反應(yīng)具有良好的催化作用，甲氧芐啶的氧化峰電流與濃度的線性關(guān)系良好。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，但是不適用于定量分析。

2.5 高效液相色譜法

高效液相色譜法是一種分離速度快且具備自動(dòng)化流程的檢測(cè)技術(shù)。BISWAS等[20]采用高效液相色譜和光電二極管陣列檢測(cè)器對(duì)牛肉中三甲氧芐氨嘧啶殘留進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)樣品的加標(biāo)回收率在75%～108%，相對(duì)偏差標(biāo)準(zhǔn)在1.34%～22.00%，方法檢測(cè)限和定量限分別為0.031 μg·g-1和

0.062 μg·g-1，批次內(nèi)和批次間變異系數(shù)均小于4%，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 9。卓國(guó)榮等[21]在240 nm波長(zhǎng)下，采用紫外雙波長(zhǎng)對(duì)雞血漿中甲氧芐啶殘留進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)空白基質(zhì)匹配的方式建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)在0.05～5.00 μg·mL-1線性關(guān)系良好（R大于0.999 9），檢測(cè)限為0.025 μg·mL-1，定量限為0.05 μg·mL-1。陳麗等[22]采用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中敵菌凈殘留量。在酸性條件下，用正己烷、乙酸乙酯和陽(yáng)離子交換小柱對(duì)堿性二氯甲烷進(jìn)行提取，經(jīng)濃縮后對(duì)濃縮液進(jìn)行凈化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在230 nm波長(zhǎng)下，敵菌凈線性范圍為0.01～25.00 g·mL-1，相關(guān)系數(shù)為0.999 86，樣品平均加標(biāo)回收率均大于87.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.73%～7.32%；方法的最低檢出限為0.01 mg·mL-1。何志成[23]通過(guò)液-液分配高效液相色譜法測(cè)定豬肉中甲氧芐啶殘留量，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引入的不確定度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)豬肉中甲氧芐啶含量為0.042 mg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.009 mg·kg-1。

2.6 液質(zhì)聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜法是用液相色譜法分離與用質(zhì)譜法定性相聯(lián)用的分析方法，具有靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

黃麗娟等[24]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS）法快速檢測(cè)鮮蛋及再制蛋中甲氧芐啶殘留。發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶在0.5～

50.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均高于

0.996 0，方法檢出限為0.2 mg·kg-1。李虹紅[25]采用基于QuEChERS 前處理法和UPLC-MS快速測(cè)定雞蛋中甲氧芐啶。結(jié)果表明，甲氧芐啶回收率在60.7%～119.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.50%～14.00%，檢出限為5 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，該方法極大地提高了甲氧芐啶殘留的檢測(cè)效率。徐維等[26]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞肉中二甲氧芐啶殘留，樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷脫脂，殘?jiān)昧鲃?dòng)相復(fù)溶后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，在0.5～100.0 ng·mL-1，

二甲氧芐啶有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.992；定量限為5 μg·kg-1，3個(gè)添加水平下的回收率為71.7%～

115.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～13.2%。蔣原等[27]利

用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜、蜂王漿等多種基質(zhì)中的三甲氧芐氨嘧啶等3種抗菌增效劑。3種物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.992。該方法的所有基質(zhì)定量限為5.0 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為63%～89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～6.9%。該方法具備良好的重現(xiàn)性和靈敏度，能達(dá)到檢驗(yàn)檢測(cè)要求。

2.7 高分辨質(zhì)譜法

高分辨質(zhì)譜法具有較高的靈敏度，檢出限和定量限穩(wěn)定，分析方法操作高效、準(zhǔn)確度高，易于普及。宋占騰等[28]采用混合模式吸附劑對(duì)基質(zhì)進(jìn)行凈化，建立了高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱高分辨率質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中二甲氧芐啶的分析方法。該方法采用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)物質(zhì)線性響應(yīng)良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回收率大于95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%；方法檢出限和定量限分別為

0.1 μg·kg-1和0.3 μg·kg-1。還有研究人員建立了超高效液相色譜-四極桿-高場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用和多功能雜質(zhì)吸附清洗同時(shí)分析鑒定雞蛋中6種磺胺類增強(qiáng)劑的方法。所有藥物的檢出限為0.01～

0.28 μg·kg-1，加樣回收率為82.4%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～14.9%，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995。該方法已被成功應(yīng)用于雞蛋樣品中抗菌增效劑的監(jiān)測(cè)[29]。

綜上，目前針對(duì)食品中磺胺類抗菌增效劑的檢測(cè)方法的研究較多，前文已針對(duì)部分研究進(jìn)行了總結(jié)。為方便相關(guān)人員參考，本文還針對(duì)國(guó)內(nèi)外磺胺類抗菌增效劑的其他研究進(jìn)展進(jìn)行了列舉，詳見(jiàn)表1。

3 檢測(cè)方法優(yōu)化與改進(jìn)

通過(guò)對(duì)抗菌增效劑檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)各種檢測(cè)方法都存在一定的局限性。熒光分光光度法選擇性差，難以排除雜質(zhì)干擾；微生物法僅能作為初篩方法使用，不能區(qū)分抗生素類別；電化學(xué)法和膠體金免疫法雖然檢測(cè)速度較快，但是不能定量分析。從大量研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，研究者多采用液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)抗菌增效劑殘留進(jìn)行測(cè)定，這兩種方法具有高效率和高準(zhǔn)確率。但是近年來(lái)，隨著待測(cè)樣品基質(zhì)越來(lái)越復(fù)雜，僅依靠保留時(shí)間進(jìn)行定性的液相色譜法的弊端逐漸顯現(xiàn)，如無(wú)法有效分離目標(biāo)物與雜質(zhì)，定性難度大；無(wú)法對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，導(dǎo)致該方法對(duì)于抗菌增效劑的檢測(cè)存在一定的局限性。

目前檢測(cè)抗菌增效劑殘留量的方法主要為高效液相色譜-質(zhì)譜法。在抗菌增效劑殘留檢測(cè)中，提高檢測(cè)靈敏度是關(guān)鍵的研究目標(biāo)之一，能夠確保在極低濃度下準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)到目標(biāo)物質(zhì)。為提高抗菌增效劑殘留檢測(cè)的靈敏度，升級(jí)和更新檢測(cè)儀器極為重要。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的成熟，大量研究人員開(kāi)始采用以靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜技術(shù)和飛行時(shí)間質(zhì)譜為主的高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析，以便建立高分辨率、檢測(cè)范圍廣的抗菌增效劑篩選方法。這些儀器能夠更準(zhǔn)確、更快速地檢測(cè)到低濃度的抗菌增效劑殘留，能滿足人們對(duì)食品安全的更高要求。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，抗菌增效劑的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，關(guān)于動(dòng)源性農(nóng)產(chǎn)品抗菌增效劑殘留檢測(cè)方法的研究已取得了顯著的進(jìn)展。但食品樣品種類繁多，抗菌增效劑使用范圍較廣，且?guī)в絮r明的個(gè)體性，因此要針對(duì)不同的檢測(cè)對(duì)象選擇合適的處理方法與檢測(cè)方法。本文對(duì)抗菌增效劑殘留相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行概述，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)方法已經(jīng)從最開(kāi)始的初始篩選轉(zhuǎn)變?yōu)闇?zhǔn)確定量。目前，檢測(cè)動(dòng)源性農(nóng)產(chǎn)品中抗菌增效劑的主要方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法有著較高的靈敏性和準(zhǔn)確度。同時(shí)隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，飛行時(shí)間質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜技術(shù)等高分辨率質(zhì)譜已經(jīng)被越來(lái)越多的研究人員用于微量分析和痕量分析，以建立分辨率更高、檢測(cè)范圍更廣的抗菌增效劑殘留篩選方法。

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