胡嬋娟 胡莉 吳志豪 戚俊峰

摘 要：本文針對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的迫切需求，深入分析了主要致病菌的特性，并探討了食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的多種方法及其面臨的挑戰(zhàn)。文章重點(diǎn)介紹了核酸擴(kuò)增、免疫分析、生物傳感等技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限，同時(shí)針對(duì)樣品基質(zhì)復(fù)雜性、低豐度致病菌的富集分離以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的穩(wěn)定性問題，提出了具體的技術(shù)改進(jìn)對(duì)策。通過優(yōu)化檢測(cè)技術(shù)，可顯著提升食源性致病菌檢測(cè)的靈敏度、特異性和操作便捷性，為食品安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：食源性致病菌；快速檢測(cè)；核酸擴(kuò)增

The Application of Fast Food Safety Detection Technology in the Detection of Foodborne Pathogens

HU Chanjuan1， HU Li1， WU Zhihao1， QI Junfeng1，2*

（1.School of Biological and Food Engineering， Huanghuai University， Zhumadian 463000， China; 2.Department of General Medicine， Affiliated Zhumadian Central Hospital of Huanghuai University， Zhumadian 463000， China）

Abstract： This article focuses on the urgent need for the detection of foodborne pathogens， analyzes in depth the characteristics of the main pathogens， and explores various methods and challenges of rapid food safety detection technology. The article focuses on the advantages and limitations of technologies such as nucleic acid amplification， immunoassay， and biosensing. At the same time， specific technical improvement measures are proposed to address the complexity of sample matrices， the enrichment and separation of low abundance pathogenic bacteria， and the stability of on-site rapid detection equipment. By optimizing detection techniques， the sensitivity， specificity， and operational convenience of detecting foodborne pathogens can be significantly improved， providing strong technical support for food safety supervision.

Keywords： foodborne pathogens; rapid detection; nucleic acid amplification

食源性疾病是由污染的食物或水引起的疾病，已成為全球公共衛(wèi)生的重大問題。食源性致病菌是導(dǎo)致食源性疾病的主要病原體，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的致病菌對(duì)預(yù)防控制食源性疾病至關(guān)重要。傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，難以滿足食品安全風(fēng)險(xiǎn)早期預(yù)警和快速反應(yīng)的需求[1]。本文在分析主要食源性致病菌特性的基礎(chǔ)上，概述了食品安全快速檢測(cè)技術(shù)（以下簡(jiǎn)稱快檢技術(shù)）的種類和特點(diǎn)，剖析了快檢技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用挑戰(zhàn)，并提出了提升快檢技術(shù)應(yīng)用效能的對(duì)策建議。

1 主要食源性致病菌及其特性

食品安全領(lǐng)域中，食源性致病菌的多樣性和復(fù)雜性給食品安全風(fēng)險(xiǎn)防控帶來巨大挑戰(zhàn)。食源性致病菌主要包括沙門氏菌、單增李斯特菌、致病性大腸桿菌、空腸彎曲菌等。這些致病菌在生理特性、致病機(jī)制、耐受力等方面存在顯著差異，導(dǎo)致檢測(cè)和控制的難度增大。①沙門氏菌是一類兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌，生長(zhǎng)溫度范圍廣，能在低溫或真空包裝等環(huán)境下存活，其中鼠傷寒沙門氏菌致死率在10%～15%[2]。②單增李斯特菌作為一種喜冷菌，在0～45 ℃條件下均能生長(zhǎng)，對(duì)熱處理耐受力強(qiáng)，且具有很強(qiáng)的黏附能力，容易形成生物被膜，增加了從食品加工設(shè)備上清除的難度。③大腸桿菌O157：H7等致病性大腸桿菌感染劑量低，產(chǎn)生的志賀樣毒素可引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥，如溶血性尿毒癥綜合征（Hemolytic Uremic Syndrome，HUS）。④空腸彎曲菌是一類重要的食源性致病菌，能夠在微氧或厭氧條件下生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性和侵襲力，在雞肉等禽類產(chǎn)品中廣泛存在。

2 食品安全快檢技術(shù)的種類及特點(diǎn)

近年來，食品安全快檢技術(shù)蓬勃發(fā)展，主要包括核酸擴(kuò)增技術(shù)、免疫分析技術(shù)、生物傳感技術(shù)等。①核酸擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP）等，通過特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但容易受到食品基質(zhì)中干擾物質(zhì)的影響。②免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）、膠體金免疫層析法等，利用抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快檢，但靈敏度和特異性相對(duì)較低[3]。③生物傳感技術(shù)，如表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）、石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）等，通過將生物分子固定在傳感器表面，根據(jù)生物分子與目標(biāo)物結(jié)合引起的信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)定性定量分析，靈敏度高、檢測(cè)速度快，但儀器設(shè)備相對(duì)昂貴。④基于微流控芯片、納米材料等新興技術(shù)的快速檢測(cè)方法也逐漸受到關(guān)注。例如，集成PCR、毛細(xì)管電泳等功能的微流控芯片可實(shí)現(xiàn)樣品制備、擴(kuò)增、分離、檢測(cè)的全流程自動(dòng)化，大大縮短檢測(cè)時(shí)間；而納米材料如碳納米管、金納米顆粒等，具有比表面積大、導(dǎo)電性好等特性，可用于構(gòu)建高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器。

總的來說，各類快檢技術(shù)在靈敏度、特異性、速度、成本等方面各有優(yōu)劣，需根據(jù)實(shí)際需求選擇合適的檢測(cè)方法，并不斷優(yōu)化改進(jìn)，以滿足食源性致病菌檢測(cè)的高效、快速、準(zhǔn)確的要求。

3 食源性致病菌快檢技術(shù)的應(yīng)用挑戰(zhàn)

3.1 樣品基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致的檢測(cè)干擾

食品基質(zhì)中存在大量的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等成分，這些成分可能會(huì)與檢測(cè)反應(yīng)發(fā)生非特異性結(jié)合或干擾，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降、假陽(yáng)性結(jié)果增加。以PCR檢測(cè)為例，食品基質(zhì)中的某些多酚類物質(zhì)，如花青素、單寧酸等，能夠與DNA聚合酶結(jié)合，抑制其活性，從而影響PCR擴(kuò)增效率；而基質(zhì)中游離的鎂離子，則可能影響退火溫度，導(dǎo)致引物發(fā)生非特異性結(jié)合[4]。免疫分析法同樣會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，例如，酪蛋白等食品蛋白可通過疏水作用吸附抗體，引起背景信號(hào)升高；而脂肪球表面的酪蛋白、乳球蛋白等，會(huì)對(duì)抗原-抗體反應(yīng)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。

3.2 低豐度致病菌的富集和分離難度大

食源性致病菌在食品中往往以低豐度形式存在，如何實(shí)現(xiàn)低豐度致病菌的有效富集和分離是食品快檢技術(shù)面臨的另一個(gè)難題。傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)法雖然可以提高致病菌的濃度，但耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要18～48 h，不利于食品安全的快速篩查。免疫磁性分離技術(shù)利用抗體修飾的磁性微球捕獲目標(biāo)菌，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成致病菌的分離富集，但存在抗體制備成本高、批間差異大等不足。此外，食品基質(zhì)中存在大量的背景菌群，它們與目標(biāo)致病菌在生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)需求等方面相似，容易產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，影響致病菌的富集效率。以大腸桿菌O157：H7為例，其在食品中的含量通常低于100 CFU·g-1，而假單胞菌等背景菌的濃度可在105～106 CFU·g-1，二者在選擇性增菌培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率相近，導(dǎo)致O157：H7的富集倍數(shù)受到限制[5]。又如，李斯特菌與某些乳酸菌在形態(tài)特征上十分相似，采用免疫磁性分離技術(shù)時(shí)容易發(fā)生交叉反應(yīng)，影響分離特異性。

3.3 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的穩(wěn)定性和可靠性不足

食品安全快速檢測(cè)的最終目的是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，然而現(xiàn)有的快速檢測(cè)設(shè)備在穩(wěn)定性和可靠性方面仍存在不足。相比于實(shí)驗(yàn)室條件下的精密儀器，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的性能往往受溫度波動(dòng)、濕度變化、振動(dòng)沖擊等因素的影響。以核酸擴(kuò)增檢測(cè)為例，PCR儀的溫度控制系統(tǒng)是影響擴(kuò)增效率和特異性的關(guān)鍵因素，而在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)條件下，環(huán)境溫度的劇烈波動(dòng)可能導(dǎo)致樣品溫度分布不均勻，引起擴(kuò)增產(chǎn)物量降低或非特異性擴(kuò)增。又如，免疫層析試紙條作為一種便攜式快速檢測(cè)工具，其檢測(cè)性能容易受到環(huán)境濕度的影響，在高濕條件下，樣品會(huì)在硝酸纖維素膜上發(fā)生橫向擴(kuò)散，降低檢測(cè)靈敏度。此外，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本限制等，很難像實(shí)驗(yàn)室儀器那樣設(shè)置多重質(zhì)控措施，在檢測(cè)過程中更容易受到各種干擾因素的影響，出現(xiàn)漏檢或誤判等問題。例如，某些膠體金免疫層析試劑盒在臨近克隆效期時(shí)，由于膠體金標(biāo)記抗體的解離，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

4 提高食源性致病菌快檢技術(shù)應(yīng)用效能的對(duì)策建議

4.1 開發(fā)高特異性抗體及核酸探針以減少基質(zhì)干擾

為了減少食品基質(zhì)對(duì)食源性致病菌快速檢測(cè)的干擾，開發(fā)高特異性抗體及核酸探針至關(guān)重要。①充分利用生物信息學(xué)手段，通過比對(duì)分析目標(biāo)致病菌與其他近緣菌種的基因組差異，篩選出特異性強(qiáng)、保守性高的核酸序列片段，作為設(shè)計(jì)PCR引物和探針的候選靶標(biāo)。以志賀氏痢疾桿菌為例，可針對(duì)其獨(dú)有的毒力基因如ipaH、virA等設(shè)計(jì)特異性引物，確保在復(fù)雜食品基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的精準(zhǔn)識(shí)別和定量檢測(cè)。在引物和探針設(shè)計(jì)優(yōu)化過程中，需綜合考慮堿基組成、長(zhǎng)度、Tm值（解鏈溫度）等多項(xiàng)參數(shù)，通過梯度PCR、熔解曲線分析等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行充分驗(yàn)證，確保檢測(cè)性能達(dá)到實(shí)際應(yīng)用要求。②在抗體制備方面，可采用噬菌體展示、雜交瘤細(xì)胞融合等技術(shù)手段，針對(duì)致病菌表面高度保守的抗原表位，如脂多糖、外膜蛋白等，制備出親和力高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體，用于開發(fā)新型免疫捕獲試劑盒。以金黃色葡萄球菌腸毒素為例，通過噬菌體展示技術(shù)，可快速篩選獲得能特異性識(shí)別腸毒素A型超抗原結(jié)構(gòu)域的高親和力抗體，將其用于毒素樣品的富集純化和快速檢測(cè)，有望降低食品基質(zhì)的非特異性干擾。

4.2 優(yōu)化致病菌富集培養(yǎng)基及免疫磁性分離技術(shù)

針對(duì)食品中低豐度致病菌的富集和分離難題，優(yōu)化致病菌富集培養(yǎng)基和免疫磁性分離技術(shù)是一項(xiàng)行之有效的策略。

在富集培養(yǎng)基優(yōu)化方面，可根據(jù)目標(biāo)致病菌的生長(zhǎng)特性，通過響應(yīng)面法等多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等關(guān)鍵成分的種類和含量配比，并調(diào)節(jié)pH值、滲透壓等理化條件，使培養(yǎng)基能最大限度地滿足目標(biāo)菌生長(zhǎng)繁殖需求，同時(shí)抑制背景菌生長(zhǎng)。例如，為提高沙門氏菌的富集效率，可在改良半固體Rappaport Vassiliadis（Modified Semi-Solid Rappaport Vassiliadis，MSRV）培養(yǎng)基中添加木糖醇和丙酮酸鈉，并將pH值調(diào)至5.2左右，既能促進(jìn)沙門氏菌的定向遷移，又能抑制大腸桿菌等其他腸桿菌的生長(zhǎng)。

在免疫磁性分離技術(shù)優(yōu)化方面，可通過合理設(shè)計(jì)抗體修飾方案，最大限度地提高磁珠表面抗體的密度和空間取向，從而增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)菌的捕獲能力。同時(shí)，優(yōu)化免疫反應(yīng)體系，如調(diào)整緩沖液組成、反應(yīng)溫度和時(shí)間等，可進(jìn)一步提升抗原抗體結(jié)合的特異性和親和力。以磁珠法分離副溶血性弧菌為例，采用Sulfo-SMCC偶聯(lián)劑將IgG抗體定向固定于磁珠表面，并在PBS緩沖體系中于37 ℃溫育30 min，可使磁珠的菌捕獲率由60%提升至90%及以上[2]。此外，引入多重免疫親和層析步驟，對(duì)磁珠捕獲的目標(biāo)菌進(jìn)行多輪洗滌和解吸附，有助于進(jìn)一步去除殘留基質(zhì)干擾，提高分離純度。

4.3 加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制

為保障食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的穩(wěn)定性和可靠性，加強(qiáng)檢測(cè)設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制至關(guān)重要。①制訂統(tǒng)一的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備技術(shù)規(guī)范和操作規(guī)程，明確設(shè)備性能指標(biāo)、使用環(huán)境要求、操作流程、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)等關(guān)鍵要素，確保不同檢測(cè)單位、不同操作人員能夠執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)一致的檢測(cè)方案。例如，在規(guī)范PCR類快速檢測(cè)設(shè)備時(shí)，可對(duì)核酸提取試劑盒的最低提取效率、DNA聚合酶的最低活性水平、引物探針的特異性、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)限等關(guān)鍵指標(biāo)提出量化要求，同時(shí)詳細(xì)規(guī)定樣品制備、加樣方式、擴(kuò)增程序設(shè)置、陰/陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置等具體操作步驟，最大限度減少人為因素導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。②建立科學(xué)完善的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備質(zhì)量控制體系，定期開展設(shè)備性能核查和結(jié)果比對(duì)驗(yàn)證，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正檢測(cè)偏差?？刹捎觅|(zhì)控環(huán)、陽(yáng)性質(zhì)控品、空白對(duì)照等多重質(zhì)控措施，評(píng)估設(shè)備的靈敏度、特異性、重復(fù)性等關(guān)鍵性能指標(biāo)，并通過能力驗(yàn)證、室間比對(duì)等方式，驗(yàn)證不同批次試劑盒、不同檢測(cè)平臺(tái)之間結(jié)果的一致性。以酶聯(lián)免疫膠體金快速檢測(cè)試紙為例，可選取不同濃度梯度的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品，評(píng)價(jià)試紙的檢測(cè)限和定量線性范圍，通過連續(xù)30 d的批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，考察試紙的批內(nèi)差異；同時(shí)采用平行雙人雙份檢測(cè)的方式，評(píng)估試紙的檢測(cè)偏倚，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。③現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制還應(yīng)與食品安全檢測(cè)的法律法規(guī)相銜接，將現(xiàn)場(chǎng)快檢結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的一致性作為考核快檢設(shè)備性能的重要指標(biāo)，嚴(yán)把快檢技術(shù)應(yīng)用關(guān)口。

5 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)食源性致病菌快檢技術(shù)的應(yīng)用挑戰(zhàn)進(jìn)行了深入探討，并提出了相應(yīng)的技術(shù)改進(jìn)對(duì)策。通過這些對(duì)策的實(shí)施，有望顯著提升檢測(cè)技術(shù)的靈敏度、特異性和操作便捷性。然而，食品安全檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是一個(gè)持續(xù)的過程，未來仍需在技術(shù)創(chuàng)新、設(shè)備優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)制定等方面進(jìn)行深入研究。此外，加強(qiáng)國(guó)際合作，共享研究成果，也是推動(dòng)食品安全檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的重要途徑。通過不斷的努力，期待能夠?qū)崿F(xiàn)更高效、更準(zhǔn)確的食源性致病菌檢測(cè)，為保障食品安全和公眾健康做出更大的貢獻(xiàn)。

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