吳九玲

摘 要：相較于GB 4789.35—2016版本《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》，

GB 4789.35—2023版本新標(biāo)準(zhǔn)在乳酸菌的定義、設(shè)備與材料、樣品制備、培養(yǎng)條件、選做方法等方面均進(jìn)行了較大的修改。乳酸菌檢驗過程中，稀釋液的制備、包埋產(chǎn)品的樣品前處理、厭氧培養(yǎng)實施等環(huán)節(jié)均存在一定難度，檢驗時需根據(jù)實際情況選擇合適的實施方案。有必要對乳酸菌檢驗人員進(jìn)行及時的培訓(xùn)，以保證新標(biāo)準(zhǔn)的順利實施。

關(guān)鍵詞：乳酸菌檢驗；國家標(biāo)準(zhǔn)；樣品制備；培養(yǎng)條件

Comparison of New and Old Standards and Analysis of Operational Difficulties in GB 4789.35 National Standard for Food Safety， Microbiological Examination of Food for Lactic Acid Bacteria Testing

WU Jiuling

（Shenzhen City Vocational College， Shenzhen 518116， China）

Abstract： Compared with GB 4789.35—2016， the new standard of GB 4789.35—2023 has made major modifications in the definition of lactic acid bacteria， equipment and materials， sample preparation， culture conditions， selection methods， etc. In the process of lactic acid bacteria testing， there are certain difficulties in the preparation of diluents， sample pre-processing of embedded products， and implementation of anaerobic culture. During testing， it is necessary to choose an appropriate implementation plan based on the actual situation. It is necessary to provide timely training for lactic acid bacteria inspection personnel to ensure the smooth implementation of the new standards.

Keywords： lactic acid bacteria testing; national standards; sample preparation; culture condition

2023年9月6日，國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合印發(fā)2023年第6號公告，公告明確《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2023）（簡稱新標(biāo)準(zhǔn)）將替代GB 4789.35—2016（簡稱舊標(biāo)準(zhǔn)），新標(biāo)準(zhǔn)于2024年3月6日起正式實施。

新標(biāo)準(zhǔn)較舊標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)，其中變化最大的部分是新增實時熒光PCR方法作為選做方法，為乳酸菌的鑒定提供了新的檢測依據(jù)。乳酸菌檢驗人員有必要了解GB 4789.35—2023標(biāo)準(zhǔn)的變化之處、化解檢驗操作中的疑難環(huán)節(jié)，以保證新標(biāo)準(zhǔn)的順利實施。

1 GB 4789.35—2023標(biāo)準(zhǔn)解讀

和GB 4789.35—2016比較，GB 4789.35—2023版本《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》的具體變化如下。

1.1 修改了“2.1乳酸菌的定義”

GB 4789.35—2023參照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步完善了乳酸菌定義，在乳酸菌的定義中增加了對乳酸菌生化現(xiàn)象的描述。舊標(biāo)準(zhǔn)只是描述了乳酸菌是一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。新標(biāo)準(zhǔn)則增加了對乳酸菌生化現(xiàn)象的描述：不能液化明膠、不產(chǎn)生吲哚、革蘭氏陽性、無運動、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細(xì)胞色素氧化酶陰性反應(yīng)的細(xì)菌。

1.2 修改了“3設(shè)備與材料”

（1）增加樣品處理、培養(yǎng)所用的設(shè)備和材料：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋或能夠提供同等厭氧效果的裝置、渦旋混勻儀、恒溫水浴鍋或金屬浴。

（2）增加實時熒光PCR法的設(shè)備和材料：實時定量PCR儀、離心機(jī)、微量移液器和滅菌吸頭、PCR管等。

（3）電子天平精度由0.01 g改為0.001 g。

（4）冰箱溫度范圍由2～5 ℃改為2～8 ℃。

1.3 修改了“4培養(yǎng)基和試劑”

（1）針對現(xiàn)有稀釋液對某些乳酸菌計數(shù)結(jié)果偏低的情況，修改了樣品前處理時所用稀釋液成分和溫度。新標(biāo)準(zhǔn)用稀釋液替代舊標(biāo)準(zhǔn)的生理鹽水，稀釋液主要成分為0.85% NaCl和1.5%胰蛋白胨，經(jīng)驗證，稀釋液“生理鹽水+1.5%胰蛋白胨（37 ℃預(yù)熱）”在乳酸菌檢驗中，計數(shù)結(jié)果優(yōu)于其他稀釋液，更有利于乳酸菌的復(fù)蘇。

（2）修改MRS瓊脂培養(yǎng)基和MC瓊脂培養(yǎng)基部分成分含量。

（3）增加實時熒光PCR法的試劑：DNA提取液、10×PCR緩沖液、dNTPs、Tap DNA聚合酶、7種乳酸菌引物探針和滅菌去離子水等。

1.4 修改了“6.1樣品制備”

（1）增加稀釋液在試驗前應(yīng)在36 ℃±1 ℃條件下充分預(yù)熱15～30 min的操作。

（2）液體樣品處理步驟中，增加拍擊式均質(zhì)器拍打的操作。

（3）增加“6.16經(jīng)特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌食品樣品應(yīng)在相應(yīng)技術(shù)/工藝要求下進(jìn)行有效前處理”的操作。特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌食品樣品經(jīng)過有效前處理，其乳酸菌檢驗結(jié)果會更加準(zhǔn)確。

1.5 修改了“6.3.2、6.3.3、6.3.4中的培養(yǎng)條件”

（1）新標(biāo)準(zhǔn)要求傾注的培養(yǎng)基溫度在48～50 ℃，傾注的量在15～20 mL，與舊標(biāo)準(zhǔn)相比更方便實驗操作。

（2）舊標(biāo)準(zhǔn)雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳桿菌統(tǒng)一選擇36 ℃±1 ℃培養(yǎng)72 h±2 h，而新標(biāo)準(zhǔn)則根據(jù)這3種菌的生長特性，選擇36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h，若菌落無生長或生長較小可選擇延長培養(yǎng)至72 h。

1.6 修改了“6.4菌落計數(shù)、6.5結(jié)果的表述、6.6菌落數(shù)的報告”

舊標(biāo)準(zhǔn)“6.3菌落計數(shù)、6.4結(jié)果的表述、6.5菌落數(shù)的報告”分別對菌落計數(shù)的規(guī)則、結(jié)果的表述方法、菌落數(shù)的報告規(guī)則進(jìn)行了詳細(xì)的說明；新標(biāo)準(zhǔn)由于GB 4789.2—2022結(jié)果計數(shù)及報告很詳盡清晰，直接引用了GB 4789.2—2022中相關(guān)內(nèi)容，可避免重復(fù)，使得新標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容更加簡潔。

1.7 增加了“8.2第二法 實時熒光PCR法鑒定”作為選做方法

舊標(biāo)準(zhǔn)中“8乳酸菌的鑒定（可選做）”只有生化鑒定方法，新標(biāo)準(zhǔn)增加了“8.2第二法 實時熒光PCR法鑒定”，可鑒定常見的干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌，有較高的準(zhǔn)確性和特異性[1]，且檢出限低于0.1 ng·μL-1，可以根據(jù)需求選擇適宜的檢測方法。

2 GB 4789.35—2023操作疑難解析

根據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行檢驗操作，乳酸菌檢驗過程有很多步驟存在一定的疑難點，需要根據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)修訂的目的進(jìn)行分析并落實。

2.1 稀釋液的準(zhǔn)備

6.1.2規(guī)定稀釋液在試驗前應(yīng)在36 ℃±1 ℃條件下充分預(yù)熱15～30 min，目的是促進(jìn)乳酸菌的復(fù)蘇，同時滿足“樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序”。在實際操作中，常用的解決辦法有2種：①將提前滅菌好的稀釋液置于36 ℃±℃水浴鍋內(nèi)保溫，要求水浴鍋保溫期間不得污染稀釋液，從水浴鍋內(nèi)取出稀釋液后要及時對稀釋液外包裝進(jìn)行消毒，且恒溫水浴鍋離接種操作臺不得太遠(yuǎn)，以防止稀釋液從培養(yǎng)箱取出后迅速降溫；②將提前滅菌好的稀釋液置于36 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保溫，該方法操作簡單，但也要求恒溫培養(yǎng)箱離接種臺距離近，以防止稀釋液從培養(yǎng)箱取出后迅速降溫。具體選擇哪一種方法應(yīng)根據(jù)實驗室條件確定。

2.2 特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌樣品的前處理

特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌樣品的前處理要求簡單可行，盡可能減少對乳酸菌的影響。目前，乳酸菌包埋技術(shù)有很多，傳統(tǒng)的包埋技術(shù)主要包括擠壓法、冷凍干燥法和噴霧干燥法，前沿的包埋技術(shù)有乳化法、復(fù)合凝聚法和多層包埋技術(shù)等[2]。

（1）擠壓法處理的乳酸菌產(chǎn)品是將微生物與海藻酸鈉溶液混合制成菌懸液，然后采用擠壓方式將微生物懸濁液以液滴的形式注射到氯化鈣溶液中，形成含有微生物的不溶性微粒[3]。擠壓法處理的乳酸菌產(chǎn)品菌活性保持較好，做乳酸菌檢驗時只需適當(dāng)?shù)乃苄韵♂寗┤芙饧纯伞?/p>

（2）冷凍干燥法處理的乳酸菌產(chǎn)品通常使用的冷凍保護(hù)劑有滲透型保護(hù)劑（如甘油）、半滲透保護(hù)劑（如蔗糖、海藻糖）、非滲透保護(hù)劑（如乳清蛋白、脫脂乳）等[4]。因此，冷凍干燥法處理的乳酸菌產(chǎn)品前處理只需要適當(dāng)?shù)乃苄韵♂寗┤芙饧纯伞＠鋬龈稍锓ㄌ幚淼娜樗峋a(chǎn)品中乳酸菌細(xì)胞活力下降[5]，因此在樣品溶解、稀釋過程中需要提供適當(dāng)?shù)臈l件恢復(fù)菌活力。

（3）噴霧干燥法處理的乳酸菌產(chǎn)品一般是將乳化液與乳酸菌濃縮液低溫混合，分散均勻形成乳化液，通過霧化裝置霧化成微小液滴，進(jìn)一步受熱干燥固化形成粉狀微膠囊[6]。由于處理溫度普遍較高，因此噴霧干燥法處理的乳酸菌產(chǎn)品前處理時需要選擇合適的乳化劑乳化溶解，同時需要在樣品處理時提供適當(dāng)?shù)臈l件恢復(fù)菌活力。

不同包埋技術(shù)處理的乳酸菌產(chǎn)品需要不同的樣品前處理方法。因此，在處理特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌樣品之前，需要詳細(xì)了解含乳酸菌樣品的生產(chǎn)工藝，選擇適當(dāng)類型的稀釋劑，要控制樣品處理溫度和時間，應(yīng)盡可能減少對乳酸菌的損傷并使細(xì)胞活力得到最大限度的恢復(fù)，但要避免樣品中的乳酸菌在樣品前處理時發(fā)生增殖。

2.3 雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳桿菌的培養(yǎng)

新標(biāo)準(zhǔn)對乳酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了修訂，根據(jù)雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳桿菌3種菌的生長特性，選擇36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h，必要時可培養(yǎng)至72 h，和舊標(biāo)準(zhǔn)相比節(jié)省了出報告的時間。根據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，雙歧桿菌、乳桿菌需要厭氧培養(yǎng)，而厭氧培養(yǎng)方法的選擇直接影響培養(yǎng)結(jié)果及報告。目前常見的厭氧培養(yǎng)是通過厭氧培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)罐、厭氧袋、Hungate管、厭氧工作站等設(shè)施、設(shè)備提供厭氧培養(yǎng)環(huán)境。

（1）厭氧培養(yǎng)箱法。厭氧培養(yǎng)箱法是在恒溫培養(yǎng)箱的基礎(chǔ)上增加氣體置換裝置進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的方法。在箱體內(nèi)使用預(yù)制無氧混合氣進(jìn)行洗吹，達(dá)到降低氧濃度的目的。厭氧培養(yǎng)箱容量較大，使用方便，操作方法類同于恒溫培養(yǎng)箱，待環(huán)境生成后，可根據(jù)需求放入培養(yǎng)皿、均質(zhì)袋、增菌瓶、三角瓶等。厭氧培養(yǎng)箱的缺點是維護(hù)成本高，密封件和氧傳感器容易老化，需定期檢查、更換；設(shè)備投入大，使用成本高，需要頻繁更換氣瓶，培養(yǎng)陽性率低；靈活性差，環(huán)境生成時間長，不能隨開隨用；同時僅能生成一種氣體環(huán)境和溫度，不能滿足日常實驗的多樣化需求。厭氧培養(yǎng)箱適用于單一乳酸菌品種、厭氧培養(yǎng)量較大的工作場景。

（2）厭氧培養(yǎng)罐法。厭氧培養(yǎng)罐法是用物理、化學(xué)方法使缸內(nèi)生成厭氧環(huán)境，從而進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)的方法。厭氧罐法又分為抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。抽氣換氣法通過反復(fù)抽氣、充氣的方法可迅速建立厭氧環(huán)境，罐中需放入冷催化劑鈀粒和美藍(lán)指示管。氣體發(fā)生袋是由錫箔密封包裝，其中含有2種藥片，一種遇水放出二氧化碳，另一種可釋放氫，厭氧罐內(nèi)需有鈀粒、指示劑，密封后1 h左右罐中的O2含量可低于1%。

（3）厭氧袋法。厭氧袋法是運用化學(xué)法消耗容器中的氧氣生成二氧化碳和水，配套密封盒或密封袋使用的一次性厭氧培養(yǎng)方法。厭氧袋法的優(yōu)點是購買門檻低、拆包即用，缺點是容量有限、耗材費用高。厭氧袋法可用于臨時應(yīng)急，常年大量使用時建議選擇參數(shù)可控、結(jié)果可溯源的設(shè)備類產(chǎn)品。

（4）Hungate管法。Hungate管法是一種可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離與活菌培養(yǎng)計數(shù)的厭氧培養(yǎng)方法。Hungate管分螺紋型和鋁封型，螺紋型由玻璃培養(yǎng)管、丁基橡膠塞以及旋蓋組成；鋁封型由玻璃培養(yǎng)管、丁基橡膠塞以及鋁封蓋組成，需配套封蓋器。采用Hungate管法進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時可通過針孔注射器抽取真空，橡膠塞可多次被穿孔并保持密封。該法優(yōu)點在于培養(yǎng)基可以在厭氧管內(nèi)壁上形成一層均勻透明的薄層，菌落可以生長在培養(yǎng)基內(nèi)部或表面，同平板涂布法相比，與氧氣接觸的機(jī)會大大減少。

（5）厭氧工作站法。厭氧工作站法是利用厭氧工作站進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的方法。厭氧工作站的氣體置換原理與厭氧培養(yǎng)箱的氣體置換原理相同，可以對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度進(jìn)行控制。箱體一般由高透明亞克力板拼接而成，前面板設(shè)置手套，可供實驗人員將手伸入進(jìn)行操作，滿足厭氧環(huán)境下進(jìn)行分離、接種等操作的需求。厭氧工作站最大的優(yōu)勢是厭氧環(huán)境下在線操作。其缺點是維護(hù)成本高，相比厭氧培養(yǎng)箱，密封件更復(fù)雜，需專業(yè)人員上門維護(hù)；維護(hù)量及成本加??；靈活性差，不具備隨開隨用的功能，亦無法同時生成不同的培養(yǎng)環(huán)境，不能滿足多樣化需求；培養(yǎng)時設(shè)備24 h待機(jī)，達(dá)到設(shè)定環(huán)境后也需要耗氣等。厭氧工作站的投入是目前厭氧培養(yǎng)中最高的，更適用于科研。

在進(jìn)行乳酸菌檢驗時可根據(jù)檢驗實際情況選擇厭氧培養(yǎng)方法，常規(guī)檢驗量非常大時推薦厭氧培養(yǎng)箱，進(jìn)行科研工作、經(jīng)濟(jì)允許的情況下可采用厭氧工作站，其他情況下可選擇厭氧培養(yǎng)罐、厭氧袋、Hungate管等方法。

3 結(jié)語

GB 4789.35—2023新標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)、規(guī)范、準(zhǔn)確，也更有可操作性。有必要對相關(guān)檢驗人員進(jìn)行及時的培訓(xùn)，使其了解標(biāo)準(zhǔn)修改內(nèi)容，能對新標(biāo)準(zhǔn)的檢驗疑難環(huán)節(jié)進(jìn)行分析并根據(jù)實際情況進(jìn)行方案選擇，以保證新標(biāo)準(zhǔn)能順利實施。

參考文獻(xiàn)

[1]趙文靜，李妍，高鵬飛，等.實時熒光定量PCR技術(shù)在乳酸菌定量檢測中的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，26（4）：255-235.

[2]陳臣，張曉叢，袁海彬，等.益生菌包埋前沿技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報，2023，23（1）：384-396.

[3]張慧娟，郝一銘，王靜，等.微生物包埋技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（1）：381-386.

[4]苗維娜，趙亮.冷凍干燥影響乳酸菌發(fā)酵活力機(jī)制的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2022，43（21）：36-44.

[5]李明慧，尚一娜，霍麒文，等.真空冷凍干燥對乳酸菌損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2018，19（39）：273-279.

[6]劉仁杰，李哲，毛思凝，等.乳酸菌微膠囊包埋技術(shù)與常用壁材的研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2019，35（9）：

211-215.