焦憲軍 董桂花

摘 要：本文詳細(xì)探討了聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、核酸適配體以及CRISPR-Cas系統(tǒng)等分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用，總結(jié)出這些技術(shù)的具有檢測(cè)敏感度高、特異性好、檢測(cè)時(shí)間短，以及能夠擴(kuò)大檢測(cè)范圍等優(yōu)勢(shì)，可為食品安全檢測(cè)提供高效、靈活的工具。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；食品；微生物檢測(cè)

Application of Molecular Biology Techniques in Food Microbial Detection

JIAO Xianjun， DONG Guihua

（Department of Microbiology， Zhangqiu Center for Disease Control and Prevention， Jinan 250200， China）

Abstract： In this paper， the application of molecular biology techniques such as polymerase chain reaction， real-time polymerase chain reaction， amplified fragment length polymorphism analysis， aptamers and CRISPR-Cas systems in the detection of food microorganisms is discussed in detail， and it is concluded that these technologies have the advantages of high detection sensitivity， good specificity， short detection time， and can expand the detection range， which can provide efficient and flexible tools for food safety detection.

Keywords： molecular biology; food; microbial detection

近年來，食品安全問題日益突出，已受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法已逐漸無法滿足快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。分子生物學(xué)技術(shù)以其高特異性、檢測(cè)快速、應(yīng)用范圍廣泛的特點(diǎn)，逐漸成為食品微生物檢測(cè)的重要工具。這些技術(shù)通過直接分析微生物的遺傳物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，不僅能夠提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，還適用于各種復(fù)雜的食品樣本[1]。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)

1.1 高特異性

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法如培養(yǎng)和生化測(cè)試雖然被廣泛使用，但通常面臨靈敏度和特異性不足的問題，無法準(zhǔn)確快速地識(shí)別特定微生物。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，特別是針對(duì)微生物核酸的檢測(cè)，極大地提高了食品微生物檢測(cè)的特異性。分子生物學(xué)技術(shù)憑借靶向微生物的遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)，通過利用微生物基因序列的獨(dú)特性，可以精確地區(qū)分不同種類的微生物，甚至在物種層面上進(jìn)行區(qū)分。

通過設(shè)計(jì)特異性極高的引物和探針，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）可以特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)微生物的特定DNA序列，從而確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，這種高特異性識(shí)別不僅提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率，還降低了交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，是傳統(tǒng)方法難以比擬的[2]。除此之外，分子技術(shù)還能夠準(zhǔn)確識(shí)別復(fù)雜樣本中健康風(fēng)險(xiǎn)較高的病原體，通過特異的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)對(duì)每一種病原體的精確檢測(cè)，能夠有效避免誤診和漏診的問題。

1.2 檢測(cè)快速

分子生物學(xué)技術(shù)中，PCR技術(shù)及其變體如實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），能夠在幾小時(shí)內(nèi)完成微生物的檢測(cè)和定量。這種技術(shù)的快速性主要源于其直接針對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析，省去了傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中耗時(shí)較長(zhǎng)的孵化步驟。qPCR技術(shù)通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化，能夠即時(shí)提供關(guān)于微生物數(shù)量的精確信息，這對(duì)于快速識(shí)別食品中的病原體和保證公共衛(wèi)生安全尤為快捷。

分子生物學(xué)技術(shù)的自動(dòng)化程度高，可以通過現(xiàn)代化的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，如自動(dòng)化PCR儀器，進(jìn)一步加快檢測(cè)過程。自動(dòng)化設(shè)備減少了人工操作的需求，提高了檢測(cè)的一致性和重復(fù)性，同時(shí)縮短了樣品處理和分析的時(shí)間。在食品安全事件的緊急處理中，這種高效的工作流程極大地提升了食品安全管理的實(shí)時(shí)性和有效性。

1.3 應(yīng)用范圍廣泛

分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是應(yīng)用范圍廣泛。分子生物學(xué)不受樣本類型的限制，可以在固體、液體以及半固體食品中進(jìn)行微生物檢測(cè)，覆蓋了肉制品、乳制品、海產(chǎn)品、飲料以及預(yù)制食品等多種食品類別。

分子生物學(xué)技術(shù)在各種食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與其高度的靈活性密不可分。分子生物學(xué)技術(shù)的靈活性表現(xiàn)在其能夠與其他技術(shù)如次世代測(cè)序（Next-Generation Sequencing，NGS）和基因編輯工具（如CRISPR-Cas系統(tǒng)）結(jié)合使用。這種結(jié)合不僅可以用于檢測(cè)已知的食品病原體，還可以探索未知的微生物種類，能夠拓展食品微生物安全領(lǐng)域的研究深度和廣度。例如，通過NGS可以對(duì)食品樣品中的微生物群落進(jìn)行全面分析，識(shí)別出所有存在的微生物種類，包括那些未被標(biāo)準(zhǔn)方法檢出的微生物。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR是一種革命性的分子生物學(xué)技術(shù)，自發(fā)明以來，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)及生物學(xué)研究領(lǐng)域，并在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色。PCR技術(shù)的核心在于能夠從混合的DNA樣本中，快速、準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出微量的特定DNA片段，能夠檢測(cè)極少量的微生物DNA[3]。

在食品微生物檢測(cè)中，PCR技術(shù)主要被用來識(shí)別和量化食品樣品中的病原體。通過設(shè)計(jì)特定于目標(biāo)微生物的引物，PCR能夠特異性地?cái)U(kuò)增相關(guān)遺傳標(biāo)記，從而確認(rèn)其存在。這種方法不僅對(duì)常見的細(xì)菌如沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等具有高度的敏感性，還能檢測(cè)到那些難以用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)到的微生物，如某些病毒和原核生物。

在食品微生物檢測(cè)中，PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)可能需要幾天到幾周才能得到結(jié)果，而PCR技術(shù)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，大大加快了食品安全檢測(cè)的響應(yīng)時(shí)間。此外，PCR技術(shù)還具備高度的靈活性，可以適應(yīng)不同類型的檢測(cè)需求，可通過多重PCR同時(shí)檢測(cè)食品中的多種病原體。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qPCR是PCR技術(shù)的一個(gè)先進(jìn)變體，在食品微生物檢測(cè)中能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)。qPCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上引入熒光化學(xué)物質(zhì)，以達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程的目標(biāo)，同時(shí)通過擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化情況可對(duì)初始模板量進(jìn)行定量分析，為食品安全監(jiān)測(cè)提供了更深入的數(shù)據(jù)支持[4]。

在食品安全領(lǐng)域，qPCR技術(shù)的應(yīng)用主要集中在對(duì)食品中病原體的快速識(shí)別和數(shù)量評(píng)估上。通過使用特定的熒光標(biāo)記探針或熒光染料，qPCR能夠通過在DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)DNA序列，從而實(shí)時(shí)追蹤擴(kuò)增過程。這種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不僅提高了檢測(cè)的特異性，還大幅提升了檢測(cè)的靈敏度，即使在非常低的微生物負(fù)荷下也能進(jìn)行有效檢測(cè)。此外，qPCR技術(shù)還具有高度自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化能力，極大地減少了人為操作的誤差，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和重復(fù)性。這種高效率和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)使qPCR成為食品生產(chǎn)和加工過程中重要的質(zhì)量控制工具。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一種強(qiáng)大的分子標(biāo)記技術(shù)，通過檢測(cè)DNA中的多態(tài)性來區(qū)分不同微生物種類或菌株。在食品微生物檢測(cè)中，AFLP提供了一種高分辨率的遺傳指紋技術(shù)，能夠精確識(shí)別和區(qū)分食品中的微生物群體，在食品安全溯源和微生物多樣性研究中尤為重要。

AFLP技術(shù)的核心是利用特定的酶對(duì)DNA樣本進(jìn)行消化，隨后選擇性地?cái)U(kuò)增部分片段，形成獨(dú)特的DNA指紋圖譜。應(yīng)用過程中不需要預(yù)先了解DNA序列信息，適用于還未被充分研究的微生物群體。在食品微生物檢測(cè)中，AFLP能夠區(qū)分表型相似但基因型不同的微生物菌株，為識(shí)別特定的病原體或評(píng)估微生物群體的遺傳多樣性提供了強(qiáng)有力的工具。

在實(shí)際應(yīng)用中，AFLP技術(shù)尤其適用于復(fù)雜食品樣品中的微生物分析。例如，在食品暴發(fā)性疫情追蹤中，通過比較不同樣品中的微生物AFLP圖譜，可以識(shí)別出疫情源頭或傳播途徑中的特定微生物菌株，這對(duì)于控制和預(yù)防食品安全事件具有重要價(jià)值。AFLP技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用不僅限于病原體識(shí)別，還可用于探索食品中益生菌的多樣性和穩(wěn)定性，這對(duì)于開發(fā)和評(píng)估功能性食品特別重要。通過分析食品中益生菌的遺傳多樣性，可以優(yōu)化菌株的選擇和培養(yǎng)條件，從而提高食品的健康價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

2.4 核酸適配體

核酸適配體（Aptamers）是一種單鏈核酸分子，通過體外化學(xué)合成獲得，能特異性地結(jié)合到目標(biāo)分子。在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，適配體技術(shù)因其高度的特異性和穩(wěn)定性，被用作識(shí)別和捕捉特定微生物的生物識(shí)別元件。

適配體的選擇過程稱為體外適配體生成技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX），通過這一技術(shù)可以篩選出與目標(biāo)微生物表面抗原特異性結(jié)合的適配體，適配體具有高親和力和高特異性，使得它們?cè)跈z測(cè)食品中的病原體時(shí)能夠提供極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。適配體可用于直接檢測(cè)微生物，或用于增強(qiáng)其他檢測(cè)技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和PCR的性能，通過提供一種直接且快速的檢測(cè)手段來改善傳統(tǒng)方法的靈敏度和特異性。適配體還被用于構(gòu)建各種傳感器和檢測(cè)平臺(tái)，如適配體功能化的納米粒子、電化學(xué)傳感器和熒光標(biāo)記系統(tǒng)，這些高度定制的檢測(cè)系統(tǒng)能夠在復(fù)雜的食品樣本中快速識(shí)別出微生物污染物，甚至在沒有顯著表型差異的微生物菌株之間進(jìn)行區(qū)分。此外，適配體合成過程不依賴于生物體系，可以在沒有生物安全隱患的情況下進(jìn)行大量生產(chǎn)，并且這些適配體通常具有很好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，適合在不同的環(huán)境條件下使用。這些優(yōu)勢(shì)使其成為食品加工和儲(chǔ)存過程中理想的微生物監(jiān)測(cè)工具。

2.5 CRISPR-Cas系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種先進(jìn)的基因編輯技術(shù)，近年來在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域展示出了巨大的應(yīng)用潛力。其核心機(jī)制是基于一種能夠精確識(shí)別并切割特定DNA序列的蛋白質(zhì)，該屬性使得CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅在基因療法和生物工程中被廣泛研究，還被應(yīng)用于快速、高效的病原體檢測(cè)中。

在食品安全監(jiān)測(cè)過程中，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以針對(duì)特定食品病原體的遺傳標(biāo)記進(jìn)行識(shí)別，一旦識(shí)別到這些標(biāo)記，Cas蛋白將特異性地切割這些DNA片段，通過后續(xù)的信號(hào)放大，這種變化可以被快速檢測(cè)出來，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的快速識(shí)別[5]。在這個(gè)過程中，CRISPR-Cas系統(tǒng)表現(xiàn)出了高度的特異性和靈敏性，即使在復(fù)雜的食品樣本中也能有效工作。CRISPR-Cas技術(shù)的另一大優(yōu)勢(shì)是其靈活性和可擴(kuò)展性。研究人員可以通過設(shè)計(jì)不同導(dǎo)向RNA（gRNA）實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的檢測(cè)，這使得CRISPR-Cas系統(tǒng)可以在單一平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的同時(shí)檢測(cè)，極大地提高了食品安全檢測(cè)的效率和覆蓋范圍。

隨著科技的進(jìn)步，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以結(jié)合現(xiàn)代微流控技術(shù)和便攜式設(shè)備，開發(fā)出新型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)工具，極大地簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，使得在采集點(diǎn)如農(nóng)場(chǎng)、加工廠直接進(jìn)行快速檢測(cè)成為可能。這對(duì)于提高食品供應(yīng)鏈的監(jiān)控效率和及時(shí)應(yīng)對(duì)食品安全事件具有重要意義。

3 結(jié)語

分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新不僅提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，還拓寬了檢測(cè)范圍，有效解決了復(fù)雜食品樣本中的微生物檢測(cè)難題。從PCR技術(shù)到CRISPR-Cas系統(tǒng)，這些技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。未來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和優(yōu)化，其在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用將更加廣泛和深入。為了最大限度地發(fā)揮出這些技術(shù)的潛力，建議進(jìn)一步研究其在實(shí)際食品檢測(cè)中的應(yīng)用效果，并探索其與其他生物技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的可能，以提供更全面、更高效的食品安全解決方案。

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