候吉超 姜蕾 宋晶晶 王月麗 程秀峰

摘 要：本研究利用單因素實驗和均勻設(shè)計從5種乳酸菌（保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、乳雙歧桿菌）中篩選合適的菌種，并優(yōu)化其比例用于生產(chǎn)石榴酵素，利用正交實驗優(yōu)化石榴酵素發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，復(fù)合菌中菌種組成及其質(zhì)量比例為植物乳桿菌∶乳酸片球菌∶乳雙歧桿菌=1.625∶1.250∶1.100，最佳發(fā)酵條件為白砂糖添加量13%，發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度38 ℃，菌種添加量3%，在該條件下發(fā)酵的石榴酵素顏色鮮紅，口感微甜，風(fēng)味獨特。

關(guān)鍵詞：石榴；酵素；復(fù)合菌；均勻?qū)嶒?/p>

Optimization of Process Conditions for Multi-Microbial Fermentation of Pomegranate Fermentation Juice

HOU Jichao， JIANG Lei， SONG Jingjing， WANG Yueli， CHENG Xiufeng

（College of Life and Geographic Sciences， Kashi University， Kashi 844000， China）

Abstract： In this study， the suitable strains from 5 lactic acid bacteria （Lactobacillus bulgaricus， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus， Lactobacillus lactis， Bifidobacterium lactis） and their ratios were screened and optimised for the fermentation of pomegranate enzyme using a one-way experiment and a homogeneous design and the fermentation process of pomegranate enzyme was optimised using orthogonal test. The results showed that the ratios of composite bacteria （Lactobacillus plantarum， Lactobacillus lactis， Bifidobacterium lactis ） were

1.625∶1.250∶1.100， and the optimal fermentation conditions were as follows： 13% sugar addition， 36 h fermentation time， 38 ℃ fermentation temperature， and 3% bacterial species addition， and the pomegranate enzyme fermented under the conditions had a bright red colour， a slightly sweet texture， and a unique flavour.

Keywords： pomegranate; fermentation juice; compound microbial agent; uniform experiment

石榴（Punica granatum L.），是千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）落葉喬木[1]，其果實酸甜可口、鮮艷美觀，富含維生素、氨基酸、黃酮等多酚類物質(zhì)及必需微量元素，具有抗氧化、防止動脈硬化與細胞癌變、降低血脂、預(yù)防血糖升高等功效[2-3]。酵素是以水果、蔬菜為原料，利用益生菌發(fā)酵生產(chǎn)的，其含有豐富的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[4]。果蔬酵素中含有多種功能性成分，具有抗衰老、抗氧化、護肝、美容養(yǎng)顏等功效[5]。

本研究采用喀什當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的水果——石榴為原料，用乳酸菌對石榴皮、石榴籽、石榴汁進行發(fā)酵，開發(fā)出一款營養(yǎng)價值豐富的石榴酵素飲料。本研究利用單因素和均勻?qū)嶒瀸?種乳酸菌進行篩選，并利用正交實驗對石榴酵素生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，為后期石榴酵素的功能特性和風(fēng)味特性研究以及中試生產(chǎn)提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴、白砂糖、果膠酶本地購買；保加利亞乳桿菌HH-LB57、嗜酸乳桿菌HH-LA26、乳酸片球菌HH-PA29、植物乳桿菌HH-LP56、乳雙歧桿菌HH-BA68購自陜西云奇生物科技有限公司；無水乙醇（AR）、碳酸鈉、福林酚、氫氧化鈉、沒食子酸均由實驗室提供。

PHSJ-4F pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）、JA2003N電子天平（上海諾萱科學(xué)儀器有限公司）、721G分光光度計（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、5804R多功能臺式離心機（北京宏達恒業(yè)科技有限公司）、DHG-9140A型恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 總酚及總酸含量測定

總酚含量測定依據(jù)《刺梨及其制品中總酚含量的測定》（T/GZCX 020—2022）[6]?？偹岷繙y定依據(jù)《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB 12456—2021）[7]。

1.2.2 發(fā)酵菌種篩選

取1 g菌粉溶于1 mL無菌水中，35～40 ℃下保溫20 min。將石榴與無菌水按7∶3的質(zhì)量比混合粉碎勻漿后，以100 mL漿液為基準，使用5種活化后的乳酸菌分別在37 ℃密閉發(fā)酵36 h，測定總酚含量、pH值、總酸含量，初步篩選菌種。選用不同添加量（0.2%～2.5%）的初篩菌種對石榴漿液分別

在37 ℃密閉發(fā)酵36 h，通過感官評價選出最佳添加量范圍，為均勻?qū)嶒炋峁┗A(chǔ)。

1.2.3 均勻?qū)嶒灤_定復(fù)合菌種接種比例

本研究選擇1.2.2中初步篩選得到的植物乳桿菌、乳酸片球菌、乳雙歧桿菌為考察因素，采用3因素8水平[U8（83）]的均勻?qū)嶒?，對菌種比例進行優(yōu)化實驗，均勻設(shè)計因素水平表如表1所示，同時利用均勻設(shè)計表（表2）、均勻設(shè)計使用表（表3）確定了均勻設(shè)計實驗方案（表4）[8]。

1.2.4 石榴酵素發(fā)酵工藝單因素實驗

基本配方：石榴粉碎經(jīng)酶解后滅菌，與無菌水按7∶3的質(zhì)量比混勻，以此質(zhì)量為基準，pH調(diào)至6.00，以植物乳桿菌、乳酸片球菌、乳雙歧桿菌的質(zhì)量比為1.625∶1.250∶1.100組成的復(fù)合菌作為發(fā)酵菌種，接種量4.0%，糖添加量13%，37 ℃發(fā)酵36 h。

為研究糖添加量對石榴酵素感官品質(zhì)的影響，向發(fā)酵液中加入不同量（9%、11%、13%、15%及17%）白砂糖。為研究發(fā)酵時間對石榴酵素感官品質(zhì)的影響，分別發(fā)酵不同時間（12 h、24 h、36 h、48 h及60 h）。為研究發(fā)酵溫度對石榴酵素感官品質(zhì)的影響，將發(fā)酵液在不同溫度（32 ℃、35 ℃、38 ℃、41 ℃及44 ℃）下發(fā)酵。為研究接種量對石榴酵素感官品質(zhì)的影響，向發(fā)酵液中接種不同量的（2%、3%、4%、5%及6%）菌種[9]。

1.2.5 正交優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以石榴酵素感官評分作為響應(yīng)值，對糖添加量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）、菌種添加量（D）4個因素進行考察，設(shè)計L9（34）正交實驗[10]。正交實驗因素與水平見表5。

1.2.6 感官評價

根據(jù)石榴酵素感官質(zhì)量評分標準，對石榴酵素的色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)進行感官評價（表6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選

由表7可知，5種乳酸菌發(fā)酵36 h后，植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品pH值最低，乳酸片球菌發(fā)酵產(chǎn)品的總酚含量最高，乳雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)品的總酸含量最高，故選擇植物乳桿菌、乳酸片球菌、乳雙歧桿菌3種乳酸菌制備復(fù)合菌劑。

對篩選出的3種菌的添加量范圍進行篩選，如圖1、圖2和圖3所示，隨著菌種添加量的增加，感官評分均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。隨著菌種添加量增加，發(fā)酵產(chǎn)酸增多，糖酸比由多減少；菌種添加量過少時，糖剩余多，口感偏甜發(fā)膩；當(dāng)植物乳桿菌添加量為1.5%、乳酸片球菌添加量為1.5%、乳雙歧桿菌添加量為0.8%時，糖酸比協(xié)調(diào)，口感酸甜可口，感官評分最高；菌種添加量過高時，產(chǎn)酸較多，酸甜失調(diào)，感官評價值變低。因此確定植物乳桿菌最佳添加量在1.0%～2.0%、乳酸片球菌最佳添加量在1.0%～2.0%、乳雙歧桿菌最佳添加量在0.5%～1.1%。

2.2 均勻設(shè)計確定菌種比例

由表8可得，8組實驗樣品pH值基本不變，總酸含量變化同樣不大，第5組樣品的總酚含量最高，達到12.74 mg·kg-1，因此復(fù)合菌質(zhì)量比例確定為植物乳桿菌∶乳酸片球菌∶乳雙歧桿菌=1.625∶1.250∶1.100。

2.3 單因素實驗

2.3.1 糖添加量對石榴酵素品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著糖添加量不斷增加，石榴酵素口感呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)白砂糖添加量為13%時，石榴酵素口感最好，感官評分最高；白砂糖的量繼續(xù)增加，甜度增大，口感變差，故選擇白砂糖添加量為13%。

2.3.2 發(fā)酵時間對石榴酵素品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，石榴酵素的感官評分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，發(fā)酵36 h時感官評分最高，48 h時略有下降，60 h時明顯降低，這與乳酸菌產(chǎn)酸造成酸甜失衡有關(guān)，通過感官評價確定發(fā)酵時間為36 h。

2.3.3 發(fā)酵溫度對石榴酵素品質(zhì)的影響

如圖6所示，石榴酵素的感官評分呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度較低，乳酸菌生長緩慢，酸產(chǎn)量低，口感偏甜；當(dāng)溫度為38 ℃時，感官評分最高，此時酵素味道酸甜適中，無榨汁時的澀味；隨著溫度繼續(xù)升高，乳酸菌繁殖速度過快，代謝旺盛，生長周期縮短，從而出現(xiàn)乳酸菌裂解、鮮味減退等現(xiàn)象；故確定最適生長溫度為38 ℃。

2.3.4 接種量對石榴酵素品質(zhì)的影響

由圖7可以看出，隨著菌種添加量增加，感官評分呈先升高后下降的趨勢，在添加量為4%時，感官品質(zhì)最好；菌種添加量為5%時產(chǎn)品感官評分略有下降，口感微甜，綜合成本考慮選擇菌種添加量為4%。

2.4 正交實驗

從表9的極差分析可得，對石榴酵素影響的主次順序為白砂糖添加量＞菌種添加量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度。感官評分最高組合為A2B2C2D1，正交實驗所得最優(yōu)組合為A3B2C1D1。因此，進行驗證實驗，A3B2C1D1感官評價平均分為87分，低于A2B2C2D1組合。因此，發(fā)酵石榴酵素最佳工藝為白砂糖添加量13%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度38 ℃、菌種添加量3%。

3 結(jié)論

本研究以石榴為原料，通過單因素實驗從5種乳酸菌中篩選出植物乳桿菌、乳酸片球菌、乳雙歧桿菌組成復(fù)合菌種對石榴酵素進行發(fā)酵，通過均勻?qū)嶒灤_定復(fù)合菌種接種質(zhì)量比例為植物乳桿菌∶乳酸片球菌∶乳雙歧桿菌=1.625∶1.250∶1.100。

通過單因素和正交實驗對石榴酵素發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，確定了最佳的工藝條件為白砂糖添加量13%，發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度38 ℃，菌種添加量3%，在該條件下發(fā)酵的石榴酵素顏色鮮紅，口感微甜，兼具石榴和乳酸菌的風(fēng)味。

參考文獻

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