徐小倩 孫衛(wèi)國 朱瑩

[摘要]目的：研究鐵死亡在炎癥微環(huán)境中抑制牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）增殖及成骨分化的作用。方法：培養(yǎng)PDLSCs，將不含藥物培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為對照組，炎癥組用含有10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基處理，鐵死亡激動(dòng)劑組用含有10 μg/L TNF-α及10 μmol/L Erastin的培養(yǎng)基處理，鐵死亡抑制劑組用含有10 μg/L TNF-α及1 μmol/L Ferrostatin-1的培養(yǎng)基處理。檢測各組細(xì)胞增殖活力、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（Transferrin receptor 1，TfR1）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx4）的表達(dá)水平及成骨誘導(dǎo)分化后的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活力、成骨標(biāo)志基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）的表達(dá)水平。結(jié)果：炎癥組TfR1表達(dá)水平高于對照組、GPx4表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05）。炎癥組處理第3、5、7 d時(shí)的增殖活力，成骨誘導(dǎo)第21 d時(shí)的鈣結(jié)節(jié)OD540水平，成骨誘導(dǎo)第7 d時(shí)的Runx2、OCN、OPN表達(dá)水平均低于對照組（P＜0.05）；鐵死亡激動(dòng)劑組的上述指標(biāo)低于炎癥組、鐵死亡抑制劑組的上述指標(biāo)高于炎癥組（P＜0.05）。結(jié)論：炎癥微環(huán)境下鐵死亡的激活抑制PDLSCs的增殖及成骨分化。

[關(guān)鍵詞]牙周膜干細(xì)胞；炎癥微環(huán)境；鐵死亡；增殖；成骨分化

[中圖分類號(hào)]R781? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）05-0001-05

Role Ferroptosis in the Inhibition of Proliferation and Osteogenic Differentiation of Periodontal Membrane Stem Cell under Inflammatory Microenvironment

XU Xiaoqian， SUN Weiguo， ZHU Ying

（ Department of Stomatology， the First Hospital of Anhui University of Science&Technology? Huainan First People's Hospital， Huainan 232001， Anhui ，China ）

Abstract： Objective? To study the role and mechanism of ferroptosis in the inhibition of proliferation and osteogenic differentiation of periodontal membrane stem cells （PDLSCs） under inflammatory microenvironment. Methods? PDLSCs were cultured， cells treated with drug free medium served as control group， inflammation group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α， ferroptosis agonist group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 10 μmol/L erastin， and ferroptosis inhibitor group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 1 μmol/L ferrostatin-1. The expression levels of cell proliferation viability， transferrin receptor 1 （TfR1）， glutathione peroxidase （GPx4）， the number of calcium nodules， the alkaline phosphatase （ALP） viability， the expression levels of Runt-related transcription factor 2 （Runx 2）， osteocalcin （OCN）， and osteopontin （OPN） after osteogenic induction were measured. Results? TfR 1 expression level of the inflammation group was higher than the control group， GPx4 expression level was lower the control group （P＜0.05）.The proliferative activity of the inflammatory group at the 3rd， 5th and 7th day， the level of calcium nodules OD540 at the 21st day of osteogenesis induction， and the expression levels of Runx2， OCN and OPN at the 7th day of osteogenesis induction were lower than those of the control group （P＜0.05）. The above indexes in the iron death agonist group were lower than those in the inflammation group， and those in the iron death inhibitor group were higher than those in the inflammation group （P＜0.05）. Conclusion? The activation of ferroptosis in the inflammatory microenvironment suppresses PDLSCs proliferation and osteogenic differentiation.

Key words： periodontal ligament stem cells; nflammatory microenvironment; ferroptosis; proliferation; osteogenic differentiation

牙周炎是細(xì)菌感染引起的牙周組織慢性炎性疾病，可引起牙周支持組織破壞、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落。牙周膜干細(xì)胞是用于牙周支持組織及牙槽骨修復(fù)的重要種子細(xì)胞，PDLSCs在牙周炎的局部微炎癥環(huán)境中的增殖能力和成骨分化能力顯著減弱，不利于PDLSCs在牙周炎治療中發(fā)揮組織修復(fù)作用[1-2]。因此，深入認(rèn)識(shí)PDLSCs增殖及成骨分化的調(diào)控機(jī)制，特別是在炎癥微環(huán)境下的增殖及成骨分化調(diào)控機(jī)制對牙周炎的治療至關(guān)重要。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴性新型細(xì)胞死亡形式，對細(xì)胞的增殖和分化均具有調(diào)控作用，有研究報(bào)道高糖環(huán)境下鐵死亡的激活對基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化具有抑制作用[3]。炎癥是刺激鐵死亡激活的重要因素之一，牙周炎發(fā)病過程中存在鐵死亡的激活[4]，但炎癥微環(huán)境下PDLSCs鐵死亡的變化及其對細(xì)胞增殖、成骨分化的調(diào)控作用缺乏研究證據(jù)。因此，本研究將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究鐵死亡在炎癥微環(huán)境抑制牙周膜干細(xì)胞增殖及成骨分化中的作用。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：PDLSCs細(xì)胞株（LM-H002）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。TNF-α、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅購自美國Sigma公司，鐵死亡激動(dòng)劑Erastin、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1購自美國MCE公司，CCK8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒、ALP活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司，細(xì)胞RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，TfR1、GPx4、Runx2、OCN、OPN及β-actin的特異性一抗及辣根過氧化物酶二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs培養(yǎng)及分組：PDLSCs在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)用胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化后的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。取第3代PDLSCs進(jìn)行分組，方法如下。對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，炎癥組用含有10μg/L TNF-α的培養(yǎng)基處理，鐵死亡激動(dòng)劑組參照Li Y等[5]的研究確定Erastin的劑量為10μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及10μmol/L Erastin的培養(yǎng)基處理，鐵死亡抑制劑組參照李暢等[6]的研究確定Ferrostatin-1的劑量為1μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及1μmol/L Ferrostatin-1的培養(yǎng)基處理。

1.2.2 PDLSCs干細(xì)胞特性的鑒定：取第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，4℃避光孵育CD44、CD90抗體1 h，在流式細(xì)胞儀上檢測CD44、CD90的表達(dá)情況。

1.2.3 PDLSCs增殖活力的檢測：第3代PDLSCs接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組處理1 d、3 d、5 d、7 d時(shí)采用CCK8法進(jìn)行檢測，按照試劑盒說明書在每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入CCK8檢測液10μl，繼續(xù)孵育2 h后在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長的吸光值，以該吸光值反映細(xì)胞增殖活力。

1.2.4 PDLSCs的成骨誘導(dǎo)：培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，包括0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清。將第3代PDLSCs接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)70%匯合后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液配置10μg/L TNF-α、10μmol/L Erastin、1μmol/L Ferrostatin-1，每2 d更換1次。

1.2.5 PDLSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色：PDLSCs成骨誘導(dǎo)后第21天時(shí)，用1%茜素紅染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色20 min，觀察鈣結(jié)節(jié)并拍照記錄，加入1 ml十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)，震蕩后吸取100μl移入96孔培養(yǎng)板，在酶標(biāo)儀上測定540 nm波長的吸光值OD540。

1.2.6 PDLSCs成骨誘導(dǎo)后ALP活力檢測：PDLSCs成骨誘導(dǎo)后第3天、第5天、第7天時(shí)，采用ALP檢測試劑盒進(jìn)行檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測定標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的510 nm波長吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的ALP活力。

1.2.7 PDLSCs中成骨標(biāo)志基因mRNA表達(dá)水平的檢測：PDLSCs成骨誘導(dǎo)后第7天時(shí)，采用細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將細(xì)胞中提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的Runx2、OCN、OPN進(jìn)行熒光定量PCR檢測，PCR的體系為：cDNA 1μl、試劑盒中反應(yīng)混合液10μl、上下游引物各0.6μl，去離子水補(bǔ)足至20μl；PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃ 15 s、特異性退火溫度25 s、72℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計(jì)算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平。

1.2.8 PDLSCs中成骨標(biāo)志基因蛋白表達(dá)水平的檢測：PDLSCs成骨誘導(dǎo)后第7天時(shí)加入裂解液提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測。在測定蛋白含量后取20μg蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h，4℃孵育1∶1 000稀釋的GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN、β-actin抗體或1∶5 000稀釋的β-actin的抗體過夜；第2天，室溫孵育1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗1 h，顯色后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 PDLSCs干細(xì)胞特性的鑒定：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測PDLSCs表面CD44及CD90的陽性表達(dá)率均超過99%，符合干細(xì)胞的特征。見圖1。

2.2 炎癥微環(huán)境下PDLSCs中鐵死亡標(biāo)志基因表達(dá)的影響：炎癥組PDLSCs中GPx4的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均低于對照組，TfR1的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 鐵死亡在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs增殖的影響：處理第1天時(shí)，各組PDLSCs的增殖活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；處理第3、5、7天時(shí)，炎癥組PDLSCs的增殖活力低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的增殖活力高于炎癥組，鐵死亡激動(dòng)劑組PDLSCs的增殖活力低于炎癥組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 鐵死亡在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)的影響：成骨誘導(dǎo)21 d時(shí)進(jìn)行茜素紅染色，炎癥組PDLSCs的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少于對照組、OD540水平低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多于炎癥組、OD540水平高于炎癥組，鐵死亡激動(dòng)劑組PDLSCs的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少于炎癥組、OD540水平低于炎癥組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 鐵死亡在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs成骨誘導(dǎo)后ALP活力的影響：成骨誘導(dǎo)3 d、5 d、7 d時(shí)，炎癥組PDLSCs的ALP活力低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs的ALP活力高于炎癥組，鐵死亡激動(dòng)劑組PDLSCs的ALP活力低于炎癥組（P＜0.05）。見圖5。

2.6 鐵死亡在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs成骨誘導(dǎo)后成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響：成骨誘導(dǎo)3 d、5 d、7 d時(shí)，炎癥組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平低于對照組，鐵死亡抑制劑組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平高于炎癥組，鐵死亡激動(dòng)劑組PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平低于炎癥組（P＜0.05）。見圖6。

3? 討論

PDLSCs是組織工程領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞，來源于牙周組織且具有自我更新、多向分化的潛能，在特定條件下發(fā)生成骨分化能夠參與牙槽骨的重建和修復(fù)。牙槽骨的吸收和破壞是慢性牙周炎進(jìn)展過程中的特征之一，PDLSCs能夠用于牙槽骨的重建和修復(fù)，但PDLSCs在炎癥微環(huán)境下增殖和成骨分化受到抑制，進(jìn)而影響了PDLSCs對牙槽骨的重建和修復(fù)作用[7-9]。TNF-α處理是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中建立炎癥微環(huán)境的常用方法，本研究的結(jié)果均證實(shí)TNF-α處理PDLSCs后細(xì)胞的增殖活力減弱，成骨誘導(dǎo)分化后的鈣結(jié)節(jié)減少、ALP活力降低，與既往相關(guān)研究的結(jié)果一致[1-2]。但炎癥微環(huán)境下PDLSCs增殖及成骨分化的調(diào)控機(jī)制尚不明確，深入研究相關(guān)的分子機(jī)制有助于為今后發(fā)現(xiàn)新的慢性牙周炎治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

本研究以鐵死亡為切入點(diǎn)，對炎癥微環(huán)境下PDLSCs增殖和成骨分化受抑制的相關(guān)分子機(jī)制展開探索。鐵死亡是一種新型細(xì)胞死亡方式，分子生物學(xué)表現(xiàn)為TfR1表達(dá)增加以及GPX4表達(dá)降低[10]；TfR1介導(dǎo)了三價(jià)鐵的內(nèi)吞及入核，繼而促進(jìn)鐵死亡[11]；GPX4是還原過氧化物酶的關(guān)鍵酶，能夠減輕鐵死亡[12]。多項(xiàng)牙周炎相關(guān)的研究證實(shí)牙周炎患者、牙周炎動(dòng)物模型、牙周炎細(xì)胞模型中均存在鐵死亡的顯著激活[13-15]。本研究在TNF-α處理的PDLSCs中檢測到TfR1表達(dá)增加以及GPX4表達(dá)降低，提示PDLSCs在炎癥微環(huán)境中出現(xiàn)了鐵死亡的激活，與既往臨床研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果吻合。

鐵死亡的生物學(xué)作用廣泛，在細(xì)胞增殖及分化中均發(fā)揮調(diào)控作用。在多種組織損傷的模型中，鐵死亡的激活顯著降低細(xì)胞增殖活力、加重組織損傷[16-18]；在干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的研究中，鐵死亡對成骨分化具有抑制作用。本研究在炎癥微環(huán)境中觀察了鐵死亡對PDLSCs增殖和成骨分化的影響，分別在炎癥微環(huán)境中使用鐵死亡激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)，使用激動(dòng)劑進(jìn)一步加劇了炎癥微環(huán)境對PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用，而抑制劑明顯改善炎癥微環(huán)境對PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用。以上結(jié)果提示炎癥微環(huán)境下鐵死亡的激活對PDLSCs的增殖和成骨分化具有抑制作用。

成骨分化過程中存在多種成骨標(biāo)志基因表達(dá)增加，其中Runx2是成骨分化過程中特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，OCN和OPN是骨基質(zhì)中主要非膠原成分，在骨質(zhì)疏松的進(jìn)展、成骨分化受抑的過程中Runx、OCN、OPN的表達(dá)均明顯降低[19-20]。為深入認(rèn)識(shí)炎癥微環(huán)境中鐵死亡對PDLSCs成骨分化的調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步對上述三種成骨標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測，TNF-α處理后PDLSCs中Runx、OCN、OPN的表達(dá)降低，符合炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨分化受抑制的特點(diǎn)；分別使用鐵死亡激動(dòng)劑和抑制劑后，PDLSCs中成骨標(biāo)志基因的表達(dá)分別降低和增加，表明炎癥微環(huán)境下鐵死亡的激活抑制了PDLSCs中成骨標(biāo)志基因的表達(dá)。

綜上所述，炎癥微環(huán)境下PDLSCs中鐵死亡顯著激活，異常激活的鐵死亡對PDLSCs的增殖及成骨分化均具有抑制作用。在今后的臨床實(shí)踐中，抑制鐵死亡有望成為治療慢性牙周炎的新靶點(diǎn)，在炎癥微環(huán)境下抑制鐵死亡能夠促進(jìn)PDLSCs的增殖和成骨分化，進(jìn)而有利于牙槽骨的重建和修復(fù)。

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[收稿日期]2023-02-15

本文引用格式：徐小倩，孫衛(wèi)國，朱瑩.鐵死亡在炎癥微環(huán)境中抑制牙周膜干細(xì)胞增殖及成骨分化的作用[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（5）：1-5.