李成成 劉康欣 代百樂 陳雪茹 唐紅楓

摘要：采用BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加、替換不同碳源和氮源、改變碳源和氮源比例、去除磷元素或硫元素及額外添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑建立不同培養(yǎng)體系，進(jìn)行蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）培養(yǎng)，考察各因素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)情況及產(chǎn)油率的影響。結(jié)果表明，無論是自養(yǎng)體系還是異養(yǎng)體系，蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和產(chǎn)油率均比普通小球藻（Chlorella vulgaris）更優(yōu)，異養(yǎng)體系下2種小球藻產(chǎn)油率分別為20.14%和18.66%；葡萄糖為碳源時(shí)蛋白核小球藻生長(zhǎng)情況最好且產(chǎn)油率最高，產(chǎn)油率為26.40%；氮源為尿素時(shí)蛋白核小球藻有最大產(chǎn)油率，為32.70%；碳氮比為30∶1時(shí)蛋白核小球藻產(chǎn)油率最高，為34.42%；硫元素缺乏時(shí)蛋白核小球藻產(chǎn)油率比對(duì)照提高28.54個(gè)百分點(diǎn)；1.5 mg/L茉莉酸干擾下，蛋白核小球藻產(chǎn)油率最高，為40.42%。由此得出，蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和產(chǎn)油率都比普通小球藻更優(yōu)；葡萄糖為最優(yōu)碳源；尿素為最優(yōu)氮源；碳氮比為30∶1時(shí)產(chǎn)油率最高；硫元素缺乏時(shí)對(duì)蛋白核小球藻影響更大；1.5 mg/L茉莉酸干擾下，蛋白核小球藻產(chǎn)油率最高。

關(guān)鍵詞：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）；碳源；氮源；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；產(chǎn)油率

中圖分類號(hào)：Q949.93? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）04-0037-04

Influencing factors of oil production rate of Chlorella pyrenoidosa

Abstract： BG-11 was used as the basic medium to establish different culture systems for Chlorella pyrenoidosa culture by adding and replacing different carbon and nitrogen sources， changing the proportion of carbon and nitrogen sources， removing phosphorus or sulfur and adding additional plant growth regulator， and the effects of various factors on the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were investigated. The results showed that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris in both autotrophic and heterotrophic systems. The oil production rates of the two Chlorella species in the heterotrophic system were 20.14% and 18.66%， respectively. When glucose was used as the carbon source， the growth of Chlorella pyrenoidosa was the best and the oil production rate was the highest， and the oil production rate was 26.40%. When the nitrogen source was urea， the maximum oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was got， and was 32.70%. The highest oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was 34.42% when the carbon-nitrogen ratio was 30∶1. The oil production rate of Chlorella pyrenoidosa under sulfur deficiency increased by 28.54 percentage points compared with the control. Under the interference of jasmonic acid with the concentration of 1.5 mg/L， the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest， which was 40.42%. The results indicated that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris； glucose was the best carbon source； urea was the best nitrogen source； the oil production rate was the highest when the carbon nitrogen ratio was 30∶1； sulfur deficiency had a greater effect on Chlorella pyrenoidosa； the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest under the interference of jasmonic acid with a concentration of 1.5 mg/L.

Key words： Chlorella pyrenoidosa； carbon source； nitrogen source； plant growth regulator； oil production rate

伴隨著全球環(huán)境污染和氣候變暖，以煤炭、石油為典型代表的化石燃料正逐漸減少，找到對(duì)環(huán)境無污染的新型生物能源迫在眉睫［1］。生物柴油是一種以動(dòng)植物油脂為原料制備、可替代化石柴油的新型生物燃料。然而使用動(dòng)植物油脂成本過高，靠餐飲廢棄油脂能夠有效降低成本需求，但其來源有限且產(chǎn)品質(zhì)量難以保證［2］。小球藻是一類體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖迅速的微型自養(yǎng)生物，種類繁多，可以適應(yīng)于不同的生長(zhǎng)環(huán)境，并且在人工培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好［3］，除能利用光能自養(yǎng)外，還可以異養(yǎng)培養(yǎng)。小球藻細(xì)胞中含有豐富的脂類、蛋白質(zhì)、藻多糖、多種色素及礦質(zhì)元素等。小球藻產(chǎn)生的油脂與甲醇反應(yīng)可制得生物柴油［4］。以小球藻為載體，通過對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出生長(zhǎng)和產(chǎn)油均較好的藻株，針對(duì)其進(jìn)行碳氮源、碳氮比、磷或硫元素缺乏、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小球藻油脂積累影響的研究，旨在尋求既能保證小球藻的生長(zhǎng)又能提高其油脂產(chǎn)量，同時(shí)還能降低小球藻培養(yǎng)成本的方法，為利用小球藻生產(chǎn)生物柴油提供理論基礎(chǔ)［5，6］。

1 材料與方法

1.1 藻種

供試藻種為普通小球藻（Chlorella vulgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、EDTA、Na2CO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O等，試劑均為分析純。

主要儀器有D-37520型臺(tái)式離心機(jī)、BCD-247C型電冰箱、SPX-300B-G型恒溫光照培養(yǎng)箱、CB800V型超凈工作臺(tái)、LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋、紫外分光光度計(jì)等。

1.3 小球藻的培養(yǎng)

1.3.1 小球藻的擴(kuò)培及更優(yōu)藻種的篩選 分別配制BG-11（添加葡萄糖）及BG-11基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取普通小球藻藻種、蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15min，取沉淀接種至各錐形瓶?jī)?nèi)（每個(gè)藻種每種培養(yǎng)液各3組平行樣，共12組），編號(hào)。23 ℃恒溫培養(yǎng)，光照度為2 000 lx，光/暗周期為12 h/12 h，每天3次定時(shí)充分搖動(dòng)［7］。

1.3.2 不同碳源、氮源下小球藻的培養(yǎng) 配制含不同碳源（葡萄糖、乙酸鈉、碳酸氫鈉，濃度均為15 000 mg/L）及不同氮源（硝酸鈉、硝酸銨、尿素，濃度均為1 500 mg/L）的BG-11培養(yǎng)基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶?jī)?nèi)（不同碳源及氮源各3組平行樣，共18組），編號(hào)。培養(yǎng)條件同“1.3.1”。

1.3.3 最佳碳氮比的篩選 配制不同碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）［8］BG-11培養(yǎng)基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶?jī)?nèi)（不同碳氮比各3組平行樣，共18組），編號(hào)，培養(yǎng)條件同“1.3.1”。

1.3.4 缺磷、硫元素下小球藻的培養(yǎng) 配制BG-11［外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺磷）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺硫）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（對(duì)照）］培養(yǎng)基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶?jī)?nèi)（每種培養(yǎng)基各3組平行樣，共9組），編號(hào)，培養(yǎng)條件同“1.3.1”。

1.3.5 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下小球藻的培養(yǎng) 分別配制含0.5、1.0、1.5 mg/L共3種濃度的水楊酸、脫落酸、茉莉酸的BG-11培養(yǎng)基各100 mL及基礎(chǔ)BG-11培養(yǎng)基100 mL（對(duì)照）［9］，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶（不同濃度的各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑各3組平行樣，共30組），編號(hào)，培養(yǎng)條件同“1.3.1”。

1.4 藻細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)定

在無菌環(huán)境下將培養(yǎng)的小球藻取樣3 mL，置于無菌離心管中，標(biāo)記。在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量蛋白核小球藻的吸光度，記錄。在培養(yǎng)階段每隔2 d測(cè)其吸光度，各平行樣取平均值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白核小球藻的生長(zhǎng)情況［10］。

1.5 藻細(xì)胞油脂含量的測(cè)定

在無菌環(huán)境下將培養(yǎng)的蛋白核小球藻取樣10 mL，5 000 r/min離心10 min獲取藻泥，經(jīng)24 h 低溫干燥，獲取藻粉，稱重記為m0，再量取60 mL藻液，2 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀加少量去離子水洗出。將樣品置于細(xì)胞破碎儀下破碎，每次10 min，重復(fù)2次。加入氯仿∶甲醇（1∶2）9 mL與樣品混合均勻，取上清液加入10 g/L的NaCl，吸取氯仿層于潔凈干燥的試管中，60 ℃水浴鍋蒸去多余氯仿［11］。試管稱重記為m2，潔凈干燥試管稱重記為m1，藻細(xì)胞單位干重油脂含量即產(chǎn)油率（C）計(jì)算式如下。

C=（m2- m1）/6m0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻的擴(kuò)培和更優(yōu)藻種的篩選

建立不同的小球藻培養(yǎng)體系（自養(yǎng)體系和異養(yǎng)體系），在各培養(yǎng)體系中培養(yǎng)小球藻，試驗(yàn)結(jié)果中普通小球藻和蛋白核小球藻在異養(yǎng)條件下所測(cè)得生長(zhǎng)量和產(chǎn)油率都比自養(yǎng)條件下更優(yōu)；蛋白核小球藻在2種培養(yǎng)體系中，無論是生長(zhǎng)量還是產(chǎn)油率都比普通小球藻更優(yōu)，如圖1、表1所示，因此選取蛋白核小球藻進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 蛋白核小球藻合適碳源、氮源的篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基BG-11的基礎(chǔ)上添加、置換不同種類的碳源15 000 mg/L（葡萄糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉）、氮源1 500 mg/L（硝酸鈉、硝酸銨、尿素）培養(yǎng)蛋白核小球藻。添加不同碳源情況下，蛋白核小球藻在以葡萄糖為碳源的條件下所測(cè)得的吸光度及產(chǎn)油率均為最優(yōu)，乙酸鈉次之（圖2、表2）。謝林靜等［12］的研究表明，相對(duì)于葡萄糖為碳源的小球藻來說，以乙酸鈉為碳源的小球藻的生物量要小一些。添加不同氮源情況下，蛋白核小球藻在以硝酸鈉為氮源的條件下所測(cè)得吸光度最優(yōu)，硝酸銨次之，尿素最小（圖2）。但是蛋白核小球藻在以尿素為氮源的條件下所測(cè)得的產(chǎn)油率最大，為32.70%；硝酸鈉次之，為18.42%；硝酸銨最小，為17.50%。金虹等［13］的研究表明，在添加尿素的環(huán)境中，小球藻生物量和產(chǎn)油率明顯高于其他氮源和無氮環(huán)境。

2.3 異養(yǎng)條件下適合小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的最佳碳氮比篩選

采用最適合蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的碳源（葡萄糖）與氮源（尿素），設(shè)置合適碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）培養(yǎng)小球藻，其中碳氮比為60∶1的培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的長(zhǎng)勢(shì)最好，其他依次為30∶9、30∶1、60∶3、30∶3和60∶9（圖3）。碳氮比為30∶1的培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的產(chǎn)油率最高，為34.42%，其次為碳氮比60∶1，產(chǎn)油率為29.78%，其中碳氮比為30∶3的產(chǎn)油率最低，產(chǎn)油率為17.79%（表3）。

2.4 磷、硫缺乏對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

建立不同的培養(yǎng)體系，測(cè)定缺磷或硫元素情況下蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和油脂積累量，得出硫、磷元素缺乏對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響。與對(duì)照相比，當(dāng)培養(yǎng)基中磷、硫元素缺乏時(shí)，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量會(huì)有所下降，特別是缺乏硫元素的培養(yǎng)基會(huì)使蛋白核小球藻生長(zhǎng)量大幅度下降，而缺乏磷元素的培養(yǎng)基下降幅度比缺乏硫元素的培養(yǎng)基小，但一段時(shí)間后仍然會(huì)大幅度下降（圖4）。蔡佳佳等［14］的研究表明，缺硫?qū)υ逯晟L(zhǎng)的抑制作用要大于缺磷。雖然硫的缺乏會(huì)使蛋白核小球藻的生物量大幅度減少，但能促進(jìn)蛋白核小球藻油脂的積累，其含油量最高，為48.10%，磷的缺乏只能小幅度提高藻株的含油量（表4）。

2.5 自養(yǎng)條件下不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下，根據(jù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度的設(shè)置建立不同的培養(yǎng)體系，測(cè)定不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和產(chǎn)油率（圖5至圖8、表5）。結(jié)果表明，0.5 mg/L茉莉酸、1.0 mg/L茉莉酸、1.5 mg/L脫落酸、1.5 mg/L水楊酸對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中1.0 mg/L茉莉酸對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)有最大促進(jìn)作用。在油脂的測(cè)定中，1.5 mg/L茉莉酸培養(yǎng)條件對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)后期雖無促進(jìn)作用，但對(duì)蛋白核小球藻油脂積累促進(jìn)效果最好。0.5 mg/L脫落酸培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻產(chǎn)油率最低，隨著脫落酸含量的上升，蛋白核小球藻的產(chǎn)油率增加。肖丹曦［15］的研究表明，脫落酸對(duì)藻類生長(zhǎng)具有一定的影響。水楊酸濃度為0.5 mg/L時(shí)，對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞產(chǎn)油率低于對(duì)照，隨著水楊酸濃度的上升，蛋白核小球藻的產(chǎn)油率增加。以上3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，茉莉酸對(duì)蛋白核小球藻的油脂積累促進(jìn)效果最好。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過測(cè)定蛋白核小球藻培養(yǎng)液吸光值間接反映蛋白核小球藻的生長(zhǎng)情況，并通過細(xì)胞破碎法，氯仿-甲醇提取法測(cè)定蛋白核小球藻的產(chǎn)油率，得到結(jié)果如下。

1）不同碳源情況下，蛋白核小球藻在以葡萄糖為碳源的條件下所測(cè)得的吸光度以及產(chǎn)油率均最優(yōu)；添加不同氮源情況下，蛋白核小球藻在以硝酸鈉為氮源的條件下所測(cè)得的吸光度最優(yōu)，乙酸鈉次之，但是蛋白核小球藻在以尿素為氮源的條件下所測(cè)得的產(chǎn)油率最大。

2）碳氮比為60∶1的培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的長(zhǎng)勢(shì)最好，碳氮比為30∶1的培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的產(chǎn)油率最高。

3）培養(yǎng)基中缺硫比缺磷對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和油脂產(chǎn)量影響更大。

4）茉莉酸濃度為1.0 mg/L時(shí)對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)有最大促進(jìn)作用；茉莉酸、脫落酸和水楊酸3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，1.5 mg/L茉莉酸對(duì)蛋白核小球藻油脂積累有最大促進(jìn)作用。

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