張雷 邱路凡 劉麗紅 趙雪鈺 韓春梅

摘要：以黑土水稻田中解鉀菌為研究目標，共分離篩選出5株解鉀菌，通過其形態(tài)特征以及測定菌株解鉀能力篩選出1株高效解鉀菌株S1。利用16S rDNA鑒定S1的種屬，并通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化該菌株的培養(yǎng)條件。結果表明，分離篩選得到的5株解鉀菌均能有效分解鉀長石，菌株S1解鉀能力最強，解鉀率為57.03%，發(fā)酵液中解鉀量為3.852 mg/L，為最優(yōu)解鉀菌。初步鑒定解鉀菌S1為伯克霍爾德菌（Burkholderia ambifaria）。經單因素試驗和正交試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)組分為碳源1.0%甘露醇、氮源1.0%蛋白胨、無機鹽0.5%K2HPO4，培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、時間48 h、培養(yǎng)基裝液量（培養(yǎng)瓶250 mL）? ? ?80 mL、初始pH 6.5、接種量5.0%。

關鍵詞：黑土；解鉀菌；菌種鑒定；培養(yǎng)條件；正交試驗

中圖分類號：S154.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）04-0030-07

Screening， identification and culture conditions optimization of

a highly efficient potassium-solubilizing bacteria

Abstract： Five strains of potassium-solubilizing bacteria were isolated and screened from black soil paddy field. One strain （S1）with high efficiency of potassium-solubilizing was screened by its morphological characteristics and potassium-solubilizing ability. The species of S1 was identified by 16S rDNA， and the culture conditions of the strain were optimized by the single factor test and orthogonal test. The results showed that the five strains of potassium-solubilizing bacteria were all able to decompose potassium feldspar effectively. Strain S1 had the highest potassium-solubilizing ability with a potassium-solubilizing rate of 57.03%， and the content of potassium-solubilizing in the fermentation broth was 3.852 mg/L， which was the best potassium-solubilizing bacteria. The potassium-solubilizing strain S1 was identified as Burkholderia ambifaria. The optimized culture conditions were carbon source 1.0% mannitol， nitrogen source 1.0% peptone， inorganic salt 0.5% K2HPO4， culture temperature 30 ℃， culture time 48 h， liquid volume 80 mL/250 mL， initial pH 6.5， and inoculation volume 5.0%.

Key words： lack soil； potassium-solubilizing bacteria； strain identification； culture conditions； orthogonal test

鉀是植物生長過程中的基本元素。它在增加關鍵光合酶的活性和葉綠素含量方面具有重要作用，可以提高二氧化碳的同化率，增強作物的光合作用，促進植物生長［1-3］。植物中的鉀在細胞液中主要以無機鹽的形式存在，參與調節(jié)細胞水分狀況、葉細胞生長和運動、滲透電位和跨膜電壓梯度維持等生理功能［4，5］。

土壤中的鉀離子會影響作物對鈣等營養(yǎng)素的吸收，從而影響作物的質量和產量［6］。根據植物營養(yǎng)有效性，土壤中的鉀主要分為難溶性鉀、緩效鉀和速效鉀［7］。難溶性鉀是指不溶于水或極少量溶于水的礦物，主要存在狀態(tài)為鉀礦，占土壤總鉀的90%以上［8］，由于極難被風化，故很難被植物吸收利用；緩效鉀是評價土壤供鉀潛力的重要指標，主要存在于黏土礦物晶層和顆粒邊緣，占土壤全鉀含量的2%～8%，在一定條件下仍能緩慢釋放鉀供植物吸收；速效鉀是指土壤中易被作物吸收利用的鉀素，包括水溶性鉀和代換性鉀，占土壤全鉀含量的1%～2%，易被植物吸收利用［9，10］。土壤中的鉀素含量較高，然而能被作物實際吸收利用的卻非常少且分布非常不均勻［11］，嚴重影響了農作物的產量和品質。因此，提高土壤中可被作物吸收利用的鉀含量迫在眉睫，而解鉀菌作為土壤微生物的重要組成部分，能夠分解含鉀硅酸鹽礦物，將土壤中的緩效鉀轉化為速效鉀供作物吸收利用［12-14］。在前人的研究中，解鉀菌種類繁多且具有專一性，解鉀菌解鉀能力和土壤環(huán)境、作物種類等有很大的關系，只有篩選出合適的解鉀菌才能最大程度改善土壤品質和提高作物產量［15，16］。

近年來，由于黑龍江土壤的過度開墾以及化肥的大量使用，黑土土壤養(yǎng)分狀況惡化，肥力下降，極大地影響農業(yè)生產［17］。前人研究發(fā)現，氮、磷、鉀、硫和鋅是黑龍江農田土壤的主要限制因素，但現有土壤調查顯示黑土氮、磷含量較為充足，鉀含量虧欠，農田缺鉀面積持續(xù)擴張，極大地影響了農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和土壤潛力的進一步發(fā)揮［18］。因此，本研究以黑龍江黑土水稻田土壤為研究對象，分離篩選高效解鉀菌并測定其解鉀能力，并對優(yōu)勢菌種采用16S rDNA鑒定確定其種屬，同時利用單因素試驗與正交試驗優(yōu)化高效解鉀菌的生長條件，以期獲得高效解鉀菌的最佳培養(yǎng)量，為微生物菌肥的研制生產奠定基礎，也為改善黑龍江黑土區(qū)農田土壤營養(yǎng)元素環(huán)境提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品土壤取自黑龍江省齊齊哈爾市梅里斯達斡爾族區(qū)大八旗村，位于北緯47°18′31.36″、東經123°45′11.79″，地處松嫩平原西部，屬中溫帶大陸性季風氣候。該地區(qū)春季少雨多風，夏季多雨，秋季晴朗多霜，冬季寒冷干燥，降雨集中，日照時間較長。試驗地土壤成分較復雜，以黑鈣土為主，土層厚度在15～30 cm。

1.1.1 土壤樣品的采集和理化性質的測定 選擇水稻種植面積較大的區(qū)域，采用五點交叉取樣法（10 m×10 m）取樣，取樣點的取樣深度為0～25 cm［19］，每個取樣點約取1.5 kg土壤樣品，去除雜質后密封放置在4 ℃冰箱中保存以便后續(xù)試驗。土壤的理化性質測定參照文獻［20］。采用重量法測定土壤干物質含量；采用電位法測定土壤pH；采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定土壤有機碳含量；采用凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用堿熔-鉬銻抗分光光度法測定土壤總磷含量；采用純水浸提-原子吸收分光光度法測定土壤水溶性鉀含量；采用乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測定土壤速效鉀含量；采用堿熔-火焰光度法測定土壤全鉀含量。

依據上述方法所測試驗前土壤干物質量為93.20%，pH為6.38，全氮含量為0.255 g/kg，有機碳含量為0.20%，全磷含量為0.42 g/kg，全鉀含量為142.05 g/kg，速效鉀含量為157.50 mg/kg，緩效鉀含量為608.90 mg/kg。

1.1.2 試驗所用培養(yǎng)基 ①篩選培養(yǎng)基［21］：蔗糖5.0 g，氯化鐵5.0 mg，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鈉2.0 g，碳酸鈣0.1 g，300目鉀長石粉1.0 g（去離子水清洗5次），瓊脂18.0 g，去離子水1 000 mL，pH調節(jié)為7.0～7.5。②改良培養(yǎng)基：篩選培養(yǎng)基中添加0.25%濃度的溴麝香草酚藍。③LB培養(yǎng)基（基礎種子培養(yǎng)基）［22］：氯化鈉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，去離子水1 000 mL，pH調節(jié)為7.0。

1.2 高效解鉀菌的篩選、鑒定以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.1 解鉀菌的初步分離與純化 取充分混合均勻的土壤樣品10.0 g放置在裝有100 mL無菌水的錐形瓶中，搖床振蕩24 h制成土壤懸液，將制成的土壤懸液均勻涂在篩選培養(yǎng)基上，用封口膜封口并倒置放在恒溫培養(yǎng)箱恒溫搖床培養(yǎng)（30 ℃、130 r/min）72 h，按相同方法重復3次。采用稀釋涂布法和平板劃線法在改良培養(yǎng)基固體平板中對所富集的菌株分離純化［23］，觀察菌株群落的形狀、顏色、凸起情況、表面情況以及質地，挑選出單獨生長且菌落形態(tài)特征差異明顯的菌株，反復劃線得到單菌群。將所得單菌群轉移到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，并采用甘油冷凍保存法（菌種保存液∶接種液=1∶3）保存在4 ℃冰箱中［24］。

1.2.2 解鉀菌復篩 將分離純化得到的單菌群接種在改良液體培養(yǎng)基中，以鉀長石粉為惟一鉀源，在30 ℃、130 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)10 d。取10.0 mL培養(yǎng)液以8 000 r/min離心8 min，取上清液，采用原子吸收分光光度法測定上清液中的解鉀量以及用pH計測定其pH，與未接種解鉀菌的空白對照組相比［25］，重復3次，記錄每次測定結果。

1.2.3 解鉀菌S1的16S rDNA鑒定 16S rDNA鑒定是通過序列測序的方式對所篩選出來的解鉀菌菌株S1進行種屬鑒定。利用生工生物工程股份有限公司基因組提取試劑盒（SK8255）提取解鉀菌菌株S1的DNA，并采用通用引物序列進行PCR擴增［26］，將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（150 V、100 mA、20 min），電泳完成后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并對目的條帶切膠純化。所得片段測序工作由生工生物工程股份有限公司完成，測序結果提交至NCBI數據庫進行對比分析，選取與GenBank中同源性最高的菌株16S rDNA基因序列，將同源性最高的基因序列用MEGA7.0軟件進行分析，并用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 解鉀菌S1培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1）培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。以LB培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將基礎培養(yǎng)基中的碳源分別用甘露醇、淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖替代，每種碳源分別設置0.5%、1.0%、1.5%三種濃度梯度，測定培養(yǎng)一段時間后的菌液在600 nm處的吸光度（OD600 nm），根據菌液OD600 nm確定最佳碳源以及最佳碳源的最佳濃度。以最佳碳源為碳源，在基礎培養(yǎng)基中分別以胰蛋白胨、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨代替氮源，每種氮源分別設置0.5%、1.0%、1.5%三種濃度梯度，根據菌液OD600 nm確定最佳氮源以及最佳氮源的最佳濃度。以前面得到的碳源、氮源為基礎，采用硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉（NaCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鈣（CaCl2）代替基礎培養(yǎng)基中的無機鹽組分，每種無機鹽分別設置0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%五種濃度梯度，由菌液OD600 nm確定最佳無機鹽及最佳濃度［27］。

2）培養(yǎng)條件的優(yōu)化。培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件包含溫度、時間、培養(yǎng)基裝量、初始pH、接菌量等。選用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別設置不同培養(yǎng)條件的單因素梯度試驗，測定所有組分菌液OD600 nm，確定解鉀菌S1的最佳培養(yǎng)條件。各項培養(yǎng)條件的梯度：溫度為20、25、30、35、40 ℃；時間為24、48、72、96、120 h；培養(yǎng)基裝量（250 mL培養(yǎng)瓶）為60、80、100、120、140 mL；初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接菌量為1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%。

正交試驗：依據單因素試驗結果，設計L25（55）五因素（溫度、時間、培養(yǎng)基裝量、初始pH、接種量）五水平正交試驗，并對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 解鉀菌的分離與純化

土壤樣品中的菌種經過分離純化后共分離出5株解鉀菌，分別命名為S1、S2、S3、S4、S5。這5株解鉀菌菌落特征各異，S1、S2、S3菌落呈圓形、邊緣整齊，表面光滑無褶皺且不透明；S3、S4形狀不規(guī)則、邊緣波狀且表面有褶皺不透明。S1、S3為凸起，S2、S4為低凸，S5為扁平。5株菌的具體菌落特征如表1所示，分離純化試驗結果見圖1。

2.2 解鉀菌解鉀能力的測定與復篩

以鉀長石作為惟一鉀源，測定初篩出來的5株解鉀菌發(fā)酵液中解鉀量，不同菌株解鉀能力存在差異。如圖2所示，S0為空白對照組，解鉀量為2.453 mg/L，pH為7.0；菌株S1的解鉀量最高，為3.852 mg/L；菌株S4的解鉀量最低，為2.457 mg/L。菌株S1的發(fā)酵液pH最低，為3.82，產酸能力最強；S2、S3的pH分別為6.26和6.13，產酸能力一般；菌株S4、S5的pH變化較小，幾乎不產酸。

5株菌株均能分解鉀長石，但解鉀率存在顯著差異。如圖3所示，菌株S1的解鉀率最高，為57.03%；S2、S3的解鉀率分別為30.90%、18.22%；菌株S5解鉀率較低，為3.38%；菌株S4解鉀率最低，為0.16%，幾乎不能分解鉀長石。

對這5株解鉀菌發(fā)酵液pH變化分析可知，每株解鉀菌發(fā)酵液的pH都低于空白對照組。有研究發(fā)現，解鉀菌的主要解鉀機理是酸解［28，29］，即解鉀菌在生長代謝過程中會分泌酸性物質，對含鉀礦石的晶體結構造成破壞，從而將固定鉀轉化成植物根系可以吸收利用的有效鉀。如圖4所示，對5株解鉀菌的解鉀量與發(fā)酵液pH進行相關性分析，二者相關性較差，R2=0.876 83，因此解鉀菌解鉀能力與發(fā)酵液pH相關性并不強，說明篩選解鉀菌存在多種解鉀模式，酸解是其主要解鉀機理。

2.3 解鉀菌S1的鑒定與分析

對解鉀菌S1進行PCR擴增鑒定，并利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，如圖5所示，分析可知解鉀菌S1的序列與伯克霍爾德菌菌株［Burkholderia ambifaria AMMD（NR074687）］同源性最高，達99.41%，系統(tǒng)進化樹親緣關系最接近。而一般認為，同源性大于95%時可認為屬于同一菌屬，因此可以將解鉀菌S1初步鑒定為伯克霍爾德菌。據相關研究，伯克霍爾德菌解鉀能力較強，在農業(yè)生產中能有效促進農作物的生長。

2.4 解鉀菌S1培養(yǎng)組分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 解鉀菌S1培養(yǎng)組分的優(yōu)化 培養(yǎng)基的組分主要由碳源、氮源、無機鹽等組成［30］，通過改變3種組分及其濃度，依據菌液OD600 nm比較解鉀菌S1的生長情況，菌液OD600 nm越大，菌液濃度越大，菌株S1生長情況越好。由圖6可知，當分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、甘露醇為培養(yǎng)基碳源時，解鉀菌S1均能吸收利用，且以1.0%的甘露醇作為碳源時，菌液OD600 nm明顯高于其他濃度碳源，菌株生長情況最佳。由圖7可知，當分別以胰蛋白胨、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨作為培養(yǎng)基氮源時，菌株在以1.0%的胰蛋白胨為氮源時生長情況最好，OD600 nm為1.603。由圖8可知，當分別以MgSO4、NaCl、K2HPO4、MgCl2、CaCl2為培養(yǎng)基無機鹽組分時，菌株S1在以0.5%的K2HPO4為無機鹽時生長情況最好，OD600 nm為1.698。

由上述結果可知，以篩選培養(yǎng)基為基礎，通過優(yōu)化解鉀菌S1培養(yǎng)基組分，得到最佳培養(yǎng)基配方為1.0%的甘露醇、1.0%的胰蛋白胨、0.5%的K2HPO4。

2.4.2 解鉀菌S1培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎，通過改變解鉀菌S1培養(yǎng)條件（溫度、時間、培養(yǎng)基裝量、初始pH、接菌量）進行單因素試驗優(yōu)化，根據菌液的OD600 nm確定菌株的生長情況，結果見圖9至圖13。菌株S1最適生長溫度為25～35 ℃，且在30 ℃時，菌株S1生長情況明顯優(yōu)于其他溫度（圖9）；菌株S1在不同培養(yǎng)時間下生長情況存在差異，在48 h時生長情況達最佳，隨后下降（圖10）；搖瓶環(huán)境中氧氣含量是影響菌株生長情況的重要因素［31］，不同培養(yǎng)基裝量對菌株S1生長有顯著差異，80 mL裝液量時與60、120、140 mL間差異明顯（圖11）；初始pH對菌株生長情況影響明顯，菌株S1的菌液OD600 nm隨著pH的增大呈先上升后下降的趨勢，并在6.5時達最大（圖12）；接菌量的不同同樣會對菌株的生長產生影響，由單因素試驗結果可知，菌株S1的菌液OD600 nm隨接菌量的增加呈先上升后下降的趨勢，接菌量為5.0%時，菌液OD600 nm明顯高于其他接菌量（圖13）。

基于上述單因素試驗結果，設計了五因素（溫度、時間、培養(yǎng)基裝量、初始pH、接菌量）五水平正交試驗（表2）。由表2可知，培養(yǎng)基的初始pH對解鉀菌S1的生長影響最大，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基裝量、溫度次之，接菌量的影響最小，解鉀菌S1的最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、時間48 h、初始pH 6.5、培養(yǎng)基裝量80 mL、接菌量5.0%。

3 討論

本試驗從黑龍江省齊齊哈爾市梅里斯達斡爾族區(qū)大八旗村水稻田土壤中分離到5株解鉀菌株，通過對其開展室內試驗評價其解鉀效果，得到1株高效解鉀菌S1。菌株S1產酸能力較強，發(fā)酵液中pH為3.82，解鉀率為57.03%。通過基因測序以及數據庫進行比對分析，確定菌株S1為伯克霍爾德菌（Burkholderia ambifaria）。采取單因素試驗和正交試驗對解鉀菌S1的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為甘露醇1.0%、胰蛋白胨1.0%，K2HPO4 0.5%；最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、時間48 h，培養(yǎng)基裝量（培養(yǎng)瓶250 mL）80 mL，初始pH 6.5，接菌量5.0%。解鉀菌S1的篩選與培養(yǎng)條件的優(yōu)化為東北黑土區(qū)土壤鉀素的改善提供了試驗依據，也為微生物菌肥的研制與生產提供數據支持。

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