李崇娟 楊鼎 呂鳳仙 和江明 蘭梅 楊紅麗 徐學忠 胡靖鋒 張麗琴

摘要：通過遠緣雜交及回交將白菜的抗病基因導入到芥菜中，創(chuàng)制獲得優(yōu)質的抗根腫病長柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）育種材料。采用人工接種鑒定和分子標記鑒定相結合法，對10份抗根腫病白菜材料進行抗性分析，篩選出1份可作為長柄芥抗根腫病育種材料創(chuàng)制的抗性資源CCR21002。利用CCR21002分別作為父本、母本提供抗根腫病基因，與長柄芥進行遠緣雜交，結合胚挽救技術獲得正反雜交種F1，選取植株形態(tài)偏向芥菜的F1與長柄芥回交獲得BC1，對BC1植株進行形態(tài)學、細胞學分析及抗病性鑒定。結果表明，回交一代比雜種一代更難獲得，胚挽救成活的13株BC1中，僅篩選出1株基因型為AABB且抗根腫病的植株，經分子標記鑒定所含抗病基因為CRb，在植株形態(tài)上保留有長柄芥的大部分性狀。證明經過與抗根腫病白菜遠緣雜交及回交，獲得對4號生理小種表現(xiàn)抗性的長柄芥新種質1份，可用于繼續(xù)回交轉育。

關鍵詞：長柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）； 抗根腫?。?胚挽救； 正反雜交； 創(chuàng)制與鑒定

中圖分類號：S436.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）04-0082-08

Creation and identification of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen breeding materials resistant to clubroot

Abstract： The high quality breeding and clubroot disease resistance material of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen was created by introducing the clubroot disease resistance gene of Brassica rapa into Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen through distant and reciprocal hybridization. The resistance of 10 Chinese cabbage materials to clubroot disease was analyzed by the combination of artificial inoculation identification and molecular marker identification， and one material CCR21002 was selected as the resistant resource to be created as the breeding material for clubroot disease resistance of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen. CCR21002 was used as the male parent and female parent to provide anti-clubroot disease genes， and the hybrid F1 was obtained with the embryo rescue technique. F1， whose plant morphology was more favorable to Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen， was backcrossed to obtain BC1， and the BC1 generation plants were analyzed by morphology， cytology and disease resistance identification. The results showed that the backcross generation was more difficult to obtain than the hybrid generation. Among the 13 strains of BC1 that survived by embryo rescue， only 1 strain was screened with genotype AABB and resistance to clubroot disease. The resistance gene was identified by molecular markers as CRb， and most of the traits of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen were retained in plant morphology. It was proved that a new germplasm resistant to physiological race 4 was obtained through remote cross and backcross with anti-clubroot disease Chinese cabbage， which could be used for backcrossing breeding.

Key words： Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen； resistance to clubroot； embryo rescue； reciprocal crosses； creation and identification

長柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）是十字花科蕓薹屬葉用芥菜中的一個變種類群，主要起源于四川省，因其葉柄細長而得名，可鮮食或加工成酸腌菜［1］，因葉肉肥厚、質地脆嫩、纖維較少而深受人們的喜愛，在云南省被廣泛種植，形成了一個以長柄芥種植、加工、消費為中心的產業(yè)體系［2］。隨著長柄芥在云南省的栽培面積逐年擴大， 4號生理小種導致的根腫病危害也日益嚴重，威脅著長柄芥產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為解決根腫病對長柄芥生產的限制，培育抗根腫病長柄芥品種是最經濟有效的途徑，而篩選優(yōu)質的抗根腫病種資質源，創(chuàng)制抗根腫病的長柄芥育種材料，可為培育抗根腫病長柄芥品種奠定基礎。

根腫病是由根腫菌侵染植株根部皮層細胞所引起的一種土傳病害［3］，Williams鑒別系統(tǒng)將根腫菌劃分為16個生理小種，其中4號生理小種的致病力最強。沈向群等［4］、陳靜等［5］對云南省發(fā)病地區(qū)的菌樣進行鑒定，發(fā)現(xiàn)致病菌主要以4號生理小種為主。江瑩芬等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，與C基因組相比，蕓薹屬A基因組內所含的抗源較豐富，而B基因組則尚未見相關報道，因此在十字花科蕓薹屬蔬菜抗根腫病育種中，選用的抗性基因主要來源于A基因組。白菜已報道的抗性位點多達23個［7］，其中CRb基因對根腫菌生理小種2、4和8均具有良好抗性，并表現(xiàn)為單基因顯性遺傳特性［8］。羅延青等［9］通過甘藍型油菜種質與根腫病高抗白菜品種“康根51”雜交，獲得對云南省特定根腫病生理小種具有抗性的甘藍型油菜新種質2份。彭麗莎等［10，11］采用胚挽救技術篩選到抗根腫病的甘藍×大白菜和甘藍型油菜新材料，利用種間雜交獲得抗根腫病莖瘤芥育種材料。李倩等［12］以含有CRb抗根腫病位點的白菜為供體親本，通過與甘藍型油菜雜交、回交及自交，成功選育了中國首個抗根腫病雜交油菜新品種華油雜62R。

白菜與芥菜同為蕓薹屬蔬菜，具有相同的染色體組AA。利用篩選出對4號生理小種表現(xiàn)抗性、含聚合抗病基因的白菜抗源材料CCR21002與長柄芥進行遠緣正反雜交及回交，通過胚挽救結合抗根腫病基因的背景選擇技術，將白菜的CRb基因轉育到芥菜中，獲得抗根腫病芥菜種質資源，從而改良芥菜的抗根腫病性狀，為培育抗根腫病長柄芥品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白菜腫根來自云南省昆明市，由云南省農業(yè)科學院園藝作物研究所實驗室分離獲得根腫菌，使用Williams鑒定系統(tǒng)將其病原菌鑒定為4號生理小種。供接種試驗材料為云南省農業(yè)科學院園藝作物研究所葉菜類團隊從全國各地收集的10份抗根腫病白菜資源，1份感病白菜資源，材料名稱及來源見表1；長柄芥JC21001為云南省農業(yè)科學院園藝作物研究所選育的高代自交材料。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子懸浮液的制備 將白菜腫根用研磨機研磨成勻漿，過濾后3 100 r/min離心15 min，棄上清液，加入50%的蔗糖溶液，再次離心后棄上清液，使用無菌水將孢子懸浮液濃度調至1×108個孢子/mL。

1.2.2 人工接種鑒定 接種材料于2020年5月1日播種，長至2片真葉時，以孢子濃度為1×108個孢子/mL的4號生理小種根腫菌菌液在根際周圍進行接種，每穴1 mL，每處理15穴，3次重復，同時設置空白對照。30 d后拔出幼苗，洗凈根部雜質，參考司軍等［13］、楊曉云等［14］的方法進行病情調查統(tǒng)計。

1.2.3 分子標記鑒定 以植株幼嫩葉片為材料，使用北京全式金生物技術有限公司試劑盒提取DNA，利用與白菜抗根腫病CRb［3］、CRa［15］、CRk［16］、Crr1［17］、CRd［18］、CRbkato［19］基因緊密連鎖的6個分子標記引物組（表2）進行PCR擴增，產物采用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測，在Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察。

1.2.4 種間雜交及不同培養(yǎng)方式 將白菜與長柄芥進行正反交，配制2個雜交組合。于授粉后13 d選取部分植株胚珠進行胚挽救，另一部分植株胚珠留在母本植株上繼續(xù)生長。觀察自然生長條件下的雜交結實率，并與胚挽救的結實率進行比較。

1.2.5 選擇回交及胚挽救 將正反交雜種F1定植于基地大棚內，于抽薹前觀察植株的生長形態(tài)，選擇保留較多芥菜性狀的植株與長柄芥進行回交。授粉后13 d選取部分植株胚珠進行胚挽救，另一部分留在母本植株上繼續(xù)生長，統(tǒng)計回交自然結子率。

1.2.6 雜種植株F1代及BC1代的鑒定

1）形態(tài)學鑒定。對雜種植株生長勢、株型、株高、葉片、花蕾等特征特性進行觀察記錄，并利用亞歷山大染色液隨機抽取花藥鏡檢，分析育性情況。

2）染色體分析。將雌蕊置于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中暗處理3～4 h，轉入卡諾固定液中固定12 h，于1 mol/L的HCl中60 ℃水浴7 min，在載玻片上搗碎，卡寶品紅染色30 s，于顯微鏡下觀察。

3）倍性鑒定。取幼嫩葉片100 mg沖洗干凈，加入600 μL裂解液解離，切碎后用0.22 μm的濾膜過濾，加入1 μL的裂解液、5 μL的PI（碘化丙啶，Propidium iodide）染料、2.5 μL的RnaseA混勻，冰上避光孵化30 min后移至上樣管上機檢測。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Microsoft Excel 2010軟件對相關數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計分析，用 SPSS 23.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同白菜材料抗根腫病鑒定結果

2.1.1 人工接種鑒定結果 抗病性鑒定結果如圖1所示，未接種菌液的空白對照均未發(fā)病，感病對照CCR21010表現(xiàn)為高感?。℉S），病情指數(shù)為75.64。由表3可知，表現(xiàn)為免疫（I）的材料2份，為CCR21001、CCR21002，病情指數(shù)和發(fā)病率均為0，顯著低于其他8份材料。表現(xiàn)為高抗（HR）的材料? 2份，為CCR21000、CCR21009，病情指數(shù)分別為5.01、4.46。表現(xiàn)為抗病（R）的材料3份，為CCR21004、CCR21005、CCR21006，病情指數(shù)為19.71～30.14。CCR21003、CCR21007表現(xiàn)為感?。⊿），在病情指數(shù)和發(fā)病率方面無顯著差異。

2.1.2 分子標記鑒定結果 利用與白菜抗根腫病常見基因緊密連鎖的6個分子標記對上述材料進行鑒定，結果表明5個分子標記具有多態(tài)性，分別是TCR02a、SC2930、HC688、BRMS-088、KBrH129J18，對應的基因分別為CRb、CRa、CRK、Crr1、CRbkato。由表4可以看出，10份抗根腫病白菜材料均檢測到1個或多個與CR基因連鎖的分子標記抗性條帶。其中CCR21001、CCR21002涉及到CRb、CRbkato、CRk? ? 3個基因；CCR21000涉及到CRb、CRbkato 2個基因；CCR21003、CCR21006分別涉及到CRk、Crr1基因；CCR21004涉及到Crr1和CRb 2個基因；CCR21005涉及到Cra和CRk 2個基因；CCR21009涉及到CRb和CRk 2個基因；CCR21007涉及到Crr1和Cra 2個基因，CCR21008涉及到Crr1和CRbkato? 2個基因；感病對照CCR21010未涉及到以上抗病基因。

結合人工接種鑒定結果，分析發(fā)現(xiàn)含有抗病基因相對較多的白菜材料對接種的根腫菌表現(xiàn)的抗性水平相對較高，如CCR21001和CCR21002含有3個抗病基因，抗性表現(xiàn)為免疫，含2個或1個抗病基因的白菜材料抗性表現(xiàn)為抗病或感病。含有相同的抗病基因，不同白菜材料間抗性水平也存在差異，如CCR21003與CCR21001、CCR21002含有相同的抗病基因CRk，但CCR21003表現(xiàn)為感病。此外，含有CRb基因的5份材料在不同程度上表現(xiàn)為抗病，說明CRb基因對4號生理小種表現(xiàn)為抗病，故篩選出? 2份可以作為長柄芥抗根腫病材料創(chuàng)制的抗性資源，分別是CCR21001、CCR21002。由于CCR21001是雄性不育材料，無法在后續(xù)正反交試驗中提供花粉，因此選擇CCR21002作為抗性資源進行轉育。

2.2 不同雜交組合及培養(yǎng)方式的雜種獲得率

對正反交以及不同培養(yǎng)方式的結實率進行比較，由圖2可知，正反雜交結實率有一定的差異，以長柄芥為母本的正交組合，在田間常規(guī)培養(yǎng)即可獲得F1代種子，而以白菜為母本的反交組合，田間常規(guī)培養(yǎng)時種莢會出現(xiàn)焦黃干癟或假膨大的現(xiàn)象，導致胚敗育不結子，需要通過胚挽救技術才能獲得雜交種F1代幼苗。統(tǒng)計結果（表5）顯示，長柄芥×白菜的正交組合田間常規(guī)培養(yǎng)共獲得501粒F1代種子，顏色偏向母本長柄芥，體積小于兩親本，成苗率僅達19.76%；通過胚挽救共獲得F1代幼苗313株，成苗率為37.49%，胚挽救的成苗率是田間授粉常規(guī)培養(yǎng)的1.90倍，利用胚挽救技術獲得種間雜種的比例明顯高于人工授粉。白菜×長柄芥的反交組合，田間常規(guī)培養(yǎng)未獲得種子，通過胚挽救成苗率為14.13%，是田間常規(guī)培養(yǎng)的14.13倍。比較不同雜交組合胚挽救的成苗率，發(fā)現(xiàn)以長柄芥為母本的成苗率是以白菜為母本成苗率的2.65倍，表明長柄芥與白菜正反雜交親和性有差異，以染色體數(shù)目多的長柄芥作母本時更容易獲得雜交種。

2.3 種間雜交種F1鑒定結果

2.3.1 形態(tài)學鑒定 將正反雜交獲得的F1材料移栽到大田后植株生長狀況良好，形態(tài)觀察結果如圖3所示。正交F1（圖3C）生長勢旺盛，開展度較大，葉下表面無刺毛，在葉片、花蕾、植株高度等方面具有明顯的超親優(yōu)勢，在株型、葉數(shù)、葉柄長度以及蠟粉量方面偏向母本長柄芥（圖3B），葉形、葉柄寬度及顏色偏向父本白菜（圖3A），花瓣的顏色及大小介于雙親之間，有微量花粉，可染率為3.2%（圖3G），育性較低。反交F1（圖3D）保留了母本白菜的大部分性狀，植株較矮小，葉背具有刺毛，葉片卵圓形且呈環(huán)抱狀態(tài)，葉緣波狀，葉面綠色微皺，葉柄背部有微量蠟粉，側生分枝量及花的形態(tài)與父本長柄芥相似，葉數(shù)、葉柄長度及寬度介于親本之間，花粉可染率為0（圖3H），表現(xiàn)為完全不育。正反雜交所獲得F1植株形態(tài)差異較大，有明顯的母本偏向性，育性檢測結果表明均存在不同程度的敗育。

2.3.2 染色體分析 在親本和正反雜交F1減數(shù)分裂過程中，觀察雌蕊染色體數(shù)目及形態(tài)，壓片的鏡檢結果（圖4）表明，正交F1（圖4C）和反交F1（圖4D）雌蕊染色體數(shù)目相等，均為28，是親本長柄芥（圖4B）（AABB，2n=36）產生的配子AB與親本白菜（圖4A）（AA，2n=20）產生的配子A染色體數(shù)目之和，與預期染色體數(shù)目相符，為異源三倍體植株。進一步分析發(fā)現(xiàn)不同的聯(lián)會染色體在細胞中隨機分布，沒有表現(xiàn)出一定程度的分群現(xiàn)象，說明白菜A基因組染色體的導入可能打破了長柄芥A基因組和B基因組之間相對的局域性分布，白菜A基因組可能與芥菜B基因組染色體存在著部分同源性。綜合以上結果表明獲得的種質為長柄芥與白菜的雜交種（AAB，2n=28）。

2.3.3 倍性鑒定 以親本作為參照，利用流式細胞儀檢測正反雜交種F1的倍性，結果如圖5所示，親本長柄芥（圖5B）的熒光強度高峰位于50，白菜（圖5A）的熒光強度高峰位于30，正交F1（圖5C）的熒光強度高峰位于40，為親本的平均值，為異源三倍體，反交F1（圖5D）的熒光強度高峰位置與正交F1相同，位于40，為異源三倍體。經驗證，30株雜交種后代中無自然加倍的雙三倍體或其他倍性植株，均為異源三倍體。鑒定結果與染色體觀察結果一致，表明正反雜交得到的F1植株是基因型為AAB的三倍體雜交種。

2.3.4 抗病性鑒定 對雜交種進行人工接種根腫菌抗性鑒定，結果如圖6所示，對照親本長柄芥（圖6C）主根膨大，側根出現(xiàn)腫塊，存在弱苗以及萎蔫現(xiàn)象，表現(xiàn)為感病。正交組合F1（圖6D）和反交組合F1（圖6B）的須根發(fā)達細長，根系未出現(xiàn)腫大部分，與抗病對照親本白菜（圖6A）相似，均表現(xiàn)為抗病。以上結果表明，遠緣雜交已將白菜的抗性基因導入雜交種后代中，正反交F1對4號生理小種均表現(xiàn)為抗病。

對雜交種進行分子標記鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖7所示，正交F1和反交F1擴增出特異性條帶的位置均與抗病親本白菜保持一致，其中引物TCR02a擴增的條帶大小在400 bp左右，引物KBrH129J18擴增的條帶大小在230 bp左右，引物HC688擴增的條帶大小在1 000 bp左右，感病親本長柄芥均未擴增出明顯的特異性條帶。以上結果表明，正反交雜交種F1中均含有CRb、CRbkato、CRk基因，通過遠緣雜交成功將白菜中的抗病基因轉育到雜交種后代中，創(chuàng)制出了抗根腫病的種間雜交種，此結果與人工接種鑒定結果一致。

2.4 回交后代BC1鑒定結果

回交一代比雜交種一代更難獲得，授粉后田間自然生長的BC1胚完全敗育不結子，未獲得BC1種子；授粉13 d后取300個胚珠進行胚挽救，僅獲得13株BC1，定植后最終成活9株BC1。7、8、9（圖8）在株型與株高上近似輪回親本長柄芥，7在葉形、葉數(shù)以及葉色方面都與輪回親本長柄芥高度相似。雌蕊染色體觀察結果表明，保留部分白菜性狀的1、2、3、4、5、6有26條或28條染色體；8、9有38條染色體；7有36條染色體，可以推斷該株的基因型為AABB，在植株形態(tài)上符合選育長柄芥的目標?？垢[病分子標記鑒定結果（圖9）表明，1、5、7中含有CRb基因，F(xiàn)1中的CRbkato、CRk基因均未遺傳到BC1中。綜合植株形態(tài)與基因型分析，9株BC1中只有7是抗根腫病的芥菜材料。

3 小結與討論

在創(chuàng)制抗根腫病新種質的研究中，對收集的抗病品種和資源進行抗性評價，是篩選抗病親本的重要依據(jù)。種質材料的抗性評價采取人工接種鑒定和分子標記鑒定相結合的方法，可明確種質材料對不同生理小種的抗性及含抗病基因的類型，有利于提高抗病育種的效率。張淑霞等［20］通過人工接種鑒定和分子標記鑒定相結合的方法，對收集的94份抗根腫病大白菜資源進行抗性分析，篩選到56個含CRb基因的品種，與人工接種鑒定結果一致。楊征等［21］利用2個與抗根腫病基因緊密連鎖的分子標記，對78份大白菜材料進行鑒定，發(fā)現(xiàn)有23份材料同時含有CRa和CRb基因，為抗病育種提供了材料選擇依據(jù)。本試驗通過對10份抗根腫病白菜材料進行人工接種和分子標記鑒定，獲得2份含CRb、CRk、CRbkato基因、對4號生理小種表現(xiàn)抗病的白菜材料，可作為后續(xù)抗根腫病長柄芥材料創(chuàng)制的抗性資源。此外，本研究在2種方法結合鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)，即使含有相同的抗病基因CRb，白菜材料的抗性水平也存在差異，這一結果與黃新彪等［22］的研究結果相似，分析產生差異的原因，可能是這些白菜材料還含有其他CR位點，或是其攜帶的CR基因不純合。此外，在檢測的10份抗根腫病白菜種質中，CCR21003、CCR21008表現(xiàn)出了特殊性，檢測到了CRk、CRbkato基因的連鎖標記，但又表現(xiàn)出對4號生理小種的感病，其解釋可能需要進一步試驗驗證和研究。

遠緣雜交可以實現(xiàn)異屬、種間的遺傳物質引入和轉移， 達到改良農藝性狀以及創(chuàng)制新作物類型的目的，是拓寬種質資源遺傳基礎的重要手段，但獲得遠緣雜交種通常需要克服雜交不親和、雜交種幼胚敗育等問題。王丹等［23］、周慶紅等［24］的研究表明芥菜型油菜與白菜無論正交、反交都存在一定程度的受精不親和性，以芥菜型油菜作母本的正交組合能獲得種子，反交組合的雜交種胚則全部敗育。徐書法等［25］在不同芥菜和白菜配制的多對正反雜交組合中，發(fā)現(xiàn)有6對反交組合的親和指數(shù)高于正交組合，說明以白菜作母本、芥菜作父本也能獲得雜交種。本試驗以長柄芥分別作為父本、母本與白菜進行雜交，長柄芥×白菜的正交組合獲得種子，反交組合的雜交種胚敗育，這與王丹等［23］的結果一致，與徐書法等［25］的結果有差異，這可能與親本的基因型有關。胚挽救技術可以克服遠緣雜交不親和的問題，提高遠緣雜交種的獲得率。Diederichsen等［26］通過胚挽救技術獲得了西蘭花與白菜雜交的F1，為后續(xù)將A基因組CR基因轉育到C基因組中奠定了基礎。曾愛松等［27］在抗根腫病甘藍新種質研究中發(fā)現(xiàn)，胚挽救技術獲得遠緣雜交種比例最高為常規(guī)人工授粉的35倍。在本試驗中，對反交組合白菜×長柄芥授粉13 d后的胚珠進行離體培養(yǎng)，成功獲得了F1代幼苗，雜交種獲得率是大田常規(guī)培養(yǎng)的14.12倍，該結果證明了胚挽救技術能克服遠緣雜交不親和導致的胚敗育問題。對能正常結子的正交組合進行胚挽救研究，發(fā)現(xiàn)獲得幼苗率是大田常規(guī)培養(yǎng)的1.89倍，說明利用胚挽救技術獲得種間雜交種的比例顯著高于人工授粉，這與曾愛松等［27］的研究結果一致。

本試驗通過遠緣正反雜交及選擇回交法將白菜的抗病基因轉育到芥菜中，選育出1株抗根腫病的長柄芥育種材料，該材料可為選育長柄芥抗根腫病新品種奠定基礎。

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