陳夢潔　段銳

關(guān)鍵詞：有氧運動；阿霉素；骨骼肌萎縮；TNF-α；TNF-R1

文章編號：1001-747X（2024）01-0099-13 文獻標志碼：A 中圖分類號：G804.23

DOI：10.16063/j.cnki.issnl001-747x.2024.01.010

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種被廣泛用作治療腫瘤的化學(xué)藥劑。盡管其對抑制腫瘤生長效果顯著，但同時，它產(chǎn)生的毒性可危及心臟、骨骼肌等。骨骼肌暴露于阿霉素環(huán)境中會誘發(fā)顯著的骨骼肌損傷，具體表現(xiàn)包括骨骼肌質(zhì)量下降、功能衰退及疲勞增加等。

在臨床上為了緩解阿霉素等化療藥物對健康組織帶來的毒性，已有多種方式被提出用于緩解阿霉素的副作用，其中運動作為一種非藥物療法，已有大量臨床前動物實驗及臨床人體研究證明運動能有效影響阿霉素誘發(fā)的骨骼肌毒性。但是，運動抵抗阿霉素誘導(dǎo)骨骼肌毒性的機制尚未明晰?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，運動能通過影響氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成與降解間的動態(tài)平衡等多種途徑改善阿霉素誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮。

Gilliam等人發(fā)現(xiàn)阿霉素給藥會導(dǎo)致膈肌中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）及其受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNF-R1） mRNA及蛋白表達水平顯著升高。TNF-α與TNF-R1結(jié)合可通過半胱天冬酶途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，尤其會特異性誘發(fā)Caspase-8（cysteinyl aspartate specific proteinase-8）的裂解激活以誘導(dǎo)細胞焦亡；另一方面，TNF-α與TNF-R1的結(jié)合將觸發(fā)NF-кB（the nuclear factor KB）激活，導(dǎo)致肌肉環(huán)指蛋白1（muscle ring finger protein-1，MuRF-1）表達增加，隨后通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome System，UPS）誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解。

阿霉素給藥使TNF-α水平升高，通過循環(huán)系統(tǒng)遷移到組織，而運動能夠有效降低TNF-α水平。在一項人體實驗中，Tsukui等對41名健康女性進行為期5個月的中等強度運動訓(xùn)練（快走或者游泳），發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練后血清TNF-α水平顯著降低；并且運動后血漿中可溶性TNF-R1和TNF-R2水平顯著下降。這提示，阿霉素及運動訓(xùn)練均可影響機體中TNF-α和TNFR表達水平，然而目前尚未有研究指出阿霉素及運動訓(xùn)練對骨骼肌TNFR表達的影響。

綜合以上研究背景，本研究通過對小鼠進行8周中等強度有氧運動訓(xùn)練后給藥阿霉素，探究運動一段時間后骨骼肌產(chǎn)生的有益效應(yīng)能否抵抗阿霉素誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮，及TNF-α/TNF-R1通路是否為運動發(fā)揮作用的途徑之一，為運動抵抗阿霉素副作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物分組

36只3月齡雄性C57BL/6小鼠購自廣東省動物中心，許可證號為SCXK（粵）2016-0041，于清潔級實驗動物房內(nèi)3只／籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對濕度50%，12 h/12 h光暗循環(huán)（考慮老鼠晝伏夜出習(xí)性及減少運動干預(yù)對其作息的影響，照明時間為21：30到次日9：30）。本實驗經(jīng)華南師范大學(xué)倫理委員會審批通過（審查批號：SCNU-SPT-2022-014）。小鼠在實驗期間飲食和飲水均不受限制。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，所有小鼠進行適應(yīng)性運動，共1周。之后將小鼠隨機平均分為對照組（SED）和運動組（EXE），每組18只。SED組正常飼養(yǎng)8周，EXE組進行8周中等強度跑臺運動訓(xùn)練，結(jié)束后對所有小鼠進行運動能力測試。之后從2組中隨機選取6只小鼠，在測試48 h后取材。剩余SED組和EXE組小鼠各12只再次分組，SED組小鼠分為生理鹽水組（SED-SAL）和阿霉素組（SED-DOX），EXE小鼠分為運動后生理鹽水組（EXE-SAL）和運動后阿霉素組（EXE-DOX），每組6只。之后對SED-DOX組和EXE-DOX組進行為期2周的阿霉素給藥；對SED-SAL和EXE -SAL注射對應(yīng)體積生理鹽水。給藥結(jié)束后對各組小鼠進行運動能力測試，48h后取材。

1.2運動干預(yù)方案

適應(yīng)性訓(xùn)練：跑速為10 m/min，運動時間由15min逐天增加到30 min，共進行5d。最后一次適應(yīng)性運動結(jié)束后測試小鼠最大跑速。

正式訓(xùn)練：由于中等強度有氧運動在對比研究中表現(xiàn)出更有效的結(jié)果，因而本研究中運動組小鼠以測得平均最大跑速的60%進行訓(xùn)練。單次運動流程為：5 min速度為10m/min的熱身運動，之后為50 min正式訓(xùn)練，最后為5min速度為10 m/min的整理活動，均無坡度，每次訓(xùn)練時間固定在19：00—20：30之間，周一至周五訓(xùn)練，共8周。訓(xùn)練期間，每2周進行一次小鼠最大跑速測試，并根據(jù)測試結(jié)果調(diào)整下一次訓(xùn)練的跑速。表1為訓(xùn)練期間EXE組平均最大跑速及訓(xùn)練速度。

1.3阿霉素給藥方案

本研究采用分次慢性阿霉素給藥方案，更符合臨床阿霉素給藥方式。給藥組小鼠腹腔注射阿霉素，分4次進行，每次劑量為5 mg/kg（體重），4d一次（圖1）。此使用劑量根據(jù)臨床使用劑量換算。阿霉素溶解于生理鹽水，濃度為0.5 mg/mL。對照組小鼠根據(jù)體重腹腔注射對應(yīng)體積生理鹽水。

1.4樣本采集

由于股四頭肌是小鼠進行跑臺運動時主要使用的肌肉之一，其變化能夠反映出運動對骨骼肌帶來的影響，故選擇股四頭肌作為研究組織。

研究表明，較大強度運動結(jié)束即刻可能會引起血漿中TNF-α水平升高，在靜息一段時間后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。為避免運動訓(xùn)練及運動能力測試結(jié)束即刻小鼠血漿指標的短時變化，均在測試結(jié)束48 h后取材。

將小鼠麻醉后記錄體重，每只小鼠眼眶采血1mL，然后進行灌注，去除組織中血液。之后完整地取下雙側(cè)股四頭肌，記錄濕重。將左側(cè)股四頭肌用EP管收集存放于超低溫冰箱，以備后續(xù)分子生物學(xué)實驗；右側(cè)股四頭肌固定用于制備冰凍切片。

1.5檢測指標與方法

1.5.1H&E染色及肌纖維橫截面積統(tǒng)計

使用冰凍切片機將骨骼肌樣本切成8μm的切片，固定后進行H&E染色，觀察骨骼肌細胞形態(tài)。每個樣品顯微鏡下拍照，取圖片3張，統(tǒng)一所有樣品拍攝位置。使用Image J圖像處理軟件，統(tǒng)計每個肌纖維橫截面積。得到的數(shù)據(jù)使用Excel軟件進行統(tǒng)計分析，計算每個樣品肌纖維平均橫截面積；統(tǒng)計每個樣品不同面積區(qū)間肌纖維數(shù)量，計算每個區(qū)間肌纖維數(shù)量占比（區(qū)間肌纖維數(shù)量／總肌纖維數(shù)）。

1.5.2骨骼肌蛋白提取

取股四頭肌樣品0.1～0.2 g剪碎放入離心管，加入1mL含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液和鋼珠，使用研磨儀研磨樣品，然后在4℃以12600rad/s離心15 min，吸取上清液；使用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)齊樣品濃度為25μg/μL，再加入5×SDS-蛋白上樣緩沖液，在100℃沸水中煮8 min，自然冷卻至室溫后儲存在-80℃冰箱備用。

1.5.3 Western Blot

每孔蛋白上樣量為25μg。依次進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影等步驟。最后使用Image J圖像處理軟件對所得條帶進行灰度值測量，計算出目標蛋白的相對表達量。

一抗信息：TNF-α（1：1000，CST，11948S）、TNF-R1（1：500， Santa Cruz， SC-8436）、TNF-R2（1：500， Santa Cruz， SC-8041）、MuRF-1（1：500，Santa Cruz， SC-398608）、Caspase-8（1：1000，CST，85925）、PGC-1α（1：4 000， Proteintech， 66369）、a-Tubulin（1：1000， Beyotime， AF2827）、GAPDH（1：500， Santa Cruz，SC-365062-HRP）。

1.5.4血漿提取及酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）

將小鼠血液離心，2600 rad/s，4℃，15 min，吸出上層血漿，放于4℃冰箱備用。

使用江萊生物公司產(chǎn)ELISA試劑盒檢測血漿中TNF-α水平。設(shè)置標準品孔、空白孔、樣品孔（每組取3個樣品測試），之后根據(jù)說明書添加試劑。終止反應(yīng)后，將孔板放人酶標儀中，用450 nm波長測量各孔吸光度（OD值），最后根據(jù)標準曲線計算樣品中TNF-α濃度。

1.5.5肌纖維類型免疫熒光染色及數(shù)量統(tǒng)計

使用冰凍切片機將骨骼肌樣本切成8μm切片，后將風(fēng)干的骨骼肌切片，使用M.O.M.封閉液常溫封閉1h，一抗24℃過夜孵育（BA-D5（Type Ⅰ），1：100，DSHB; SC-71（TypeⅡA），1：100， DSHB;WGA（with Alexa Fluor 488），1：200， Thermofisher，W11261；用含1% BSA的PBS溶液稀釋抗體），第2天拿出片子升至室溫，用0.1% PBST（含0.1%Tween的PBS溶液）清洗，之后室溫黑暗孵育二抗1h（Alexa Fluor 647 IgM，1：100， Thermofisher; AlexaFluor 594 IgGl，1：100， Thermofisher）。用0.1%PBST清洗后使用封片劑封片，至激光共聚焦顯微鏡下拍攝。使用掃描模式拍全每個切片，之后用ImageJ圖像處理軟件統(tǒng)計Ⅰ型、ⅡA型肌纖維數(shù)量。

1.6數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以x+s進行統(tǒng)計分析。采用Graph Pad Prism8.3.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果的進行差異分析。其中，SED-SAL與SED-DOX、EXE-SAL與EXE -DOX組數(shù)據(jù)分別采用t檢驗分析阿霉素帶來的影響，*表示具有顯著性差異（P<0.05），**表示具有非常顯著性差異（P<0.01）；SED-SAL與EXE-SAL、SED-DOX與EXE-DOX組數(shù)據(jù)分別采用t檢驗分析運動帶來的影響，#表示具有顯著性差異（P<0.05），##表示具有非常顯著性差異（P<0.01）；SED與EXE組數(shù)據(jù)采用t檢驗分析運動帶來的影響，☆表示具有顯著性差異（P<0.05），☆☆表示具有非常顯著性差異（P<0.01）。

2研究結(jié)果

2.1 8周中等強度有氧運動有效抵抗阿霉素導(dǎo)致的小鼠最大跑速下降

阿霉素給藥后，SED-DOX組相較SED-SAL組小鼠最大跑速顯著下降（P<0.05）。而8周跑臺訓(xùn)練后，EXE-SAL組最大跑速顯著高于SED-SAL組（P<0.05），且最大跑速的提升在小鼠接受阿霉素給藥后在SED-DOX和EXE-DOX組間仍然非常顯著（P<0.01，見圖2）。這表明8周中等強度有氧運動能有效維持小鼠最大跑速，抵抗阿霉素導(dǎo)致的骨骼肌功能下降。

2.2 8周中等強度有氧運動緩解阿霉素導(dǎo)致的骨骼肌不良反應(yīng)

阿霉素給藥期間，SED-SAL和EXE-SAL組小鼠體重穩(wěn)定，而SAL-DOX和EXE-DOX組小鼠體重均快速下降（見圖3A）。阿霉素給藥結(jié)束，SED-DOX組相較于SED-SAL組體重非常顯著下降（P<0.01），EXE-DOX組相較于EXE -SAL組體重非常顯著下降（P<0.01），表明阿霉素給藥導(dǎo)致小鼠體重下降：同時，SED-DOX組相較于EXE-DOX組體重同樣非常顯著性下降（P<0.01，見圖3B），表明前期8周中等強度有氧運動能一定程度上緩解阿霉素導(dǎo)致的體重下降。

阿霉素給藥后小鼠股四頭肌質(zhì)量受到影響，其中SED-DOX與SED-SAL組相比，股四頭肌質(zhì)量非常顯著性下降（P<0.01），而EXE-DOX與EXE-SAL組相比，僅有下降趨勢（P=0.111 2）。SED-SAL與EXE-SAL組之間肌肉質(zhì)量未產(chǎn)生顯著性差異，說明前期8周跑臺運動并未影響小鼠股四頭肌質(zhì)量；但SED-DOX與EXE-DOX組相比，具有顯著性差異（P<0.05，見圖3C），說明前期8周中等強度有氧運動能一定程度上抵抗阿霉素導(dǎo)致的股四頭肌質(zhì)量下降。

骨骼肌H&E染色顯示，SED-SAL與EXE-SAL組小鼠肌纖維排列整齊致密，肌纖維大小正常：而阿霉素給藥處理的SED-DOX與EXE-DOX組小鼠肌纖維間隙增大，部分細胞壞死、破裂，細胞間隙中存在堆積的細胞核（見圖3D黃色方框），表明阿霉素給藥導(dǎo)致骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)受到損傷。

統(tǒng)計小鼠股四頭肌平均CSA，具體結(jié)果顯示，在接受阿霉素給藥后平均CSA顯著下降，其中SED-DOX與SED-SAL組相比，CSA非常顯著性減?。≒<0.01）；EXE-DOX與EXE-SAL組相比，CSA顯著性減?。≒<0.05）；SED-DOX與EXE-DOX組相比，CSA同樣也是顯著性減?。≒<0.05，見圖3E），說明之前8周中等強度有氧運動的干預(yù)能在一定程度上抵抗由阿霉素導(dǎo)致的股四頭肌平均肌纖維CSA減小。

統(tǒng)計不同大小CSA肌纖維的分布數(shù)量情況，同樣也能反映阿霉素及運動對骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)層面的影響。SED-DOX與SED-SAL組及EXE-DOX與EXE-SAL組分別相比，波峰均明顯向左遷移，表明阿霉素給藥后橫截面積小的肌纖維數(shù)量增多。EXE-SAL與SED-SAL組相比，波峰顯著向右遷移，說明8周中等強度有氧運動使橫截面積大的肌纖維數(shù)量增多；EXE-DOX與SED-DOX組相比，波峰也向右遷移（見圖3F），說明8周中等強度有氧運動能一定程度抵抗阿霉素給藥導(dǎo)致的橫截面積小的肌纖維數(shù)量增多，維持住大肌纖維數(shù)量的占比。

通過免疫熒光染色肌纖維類型，探究8周中等強度有氧運動及阿霉素給藥對小鼠肌纖維類型的影響。有研究指出骨骼肌肌纖維總數(shù)受遺傳因素決定，運動干預(yù)并不會使肌纖維總數(shù)量發(fā)生改變。因此，我們對小鼠股四頭肌進行肌纖維類型染色，并統(tǒng)計有氧代謝Ⅰ型、ⅡA型肌纖維數(shù)量進行比較。結(jié)果顯示，EXE-SAL與SED-SAL組相比，股四頭肌中Ⅰ型肌纖維數(shù)量非常顯著增加（P<0.01）；SED-DOX與SED-SAL組及EXE-DOX與EXE-SAL組分別相比，股四頭肌中Ⅰ型肌纖維數(shù)量均非常顯著性下降（P<0.01）；而EXE-DOX與SED-DOX組相比無顯著性差異（P=0.9530，見圖3H）。這說明阿霉素給藥導(dǎo)致股四頭肌中Ⅰ型肌纖維急劇減少，并且運動對Ⅰ型纖維的保護并不顯著。統(tǒng)計ⅡA型肌纖維數(shù)量，僅SED-DOX相較于SED-SAL組ⅡA型肌纖維數(shù)量顯著減少（P<0.05，見圖31），表明阿霉素給藥同樣會造成ⅡA型肌纖維減少，且運動對其保護作用并不顯著。

2.3 8周中等強度有氧運動緩解阿霉素導(dǎo)致的

TNF-α水平升高并顯著下調(diào)股四頭肌TNF-R1水平

ELISA檢測顯示，SED-SAL組血漿中TNF-α水平非常顯著低于SED-DOX組（P<0.01），EXE-SAL組相較于EXE-DOX組也具有非常顯著的差異（P<0.01），表明阿霉素給藥會導(dǎo)致小鼠血漿中TNF-α水平顯著升高。同時，EXE-DOX組小鼠血漿中TNF-α水平顯著低于SED-DOX組（P<0.05，見圖4A），說明8周中等強度有氧運動能緩解由于阿霉素給藥導(dǎo)致的血漿TNF-α水平升高。

WB檢測股四頭肌中TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)阿霉素給藥后SED-DOX組股四頭肌中TNF-α水平相較于SED-SAL組顯著上升（P<0.05），而EXE -DOX組相較于EXE -SAL組雖然有上升趨勢，但并無顯著性差異（P=0.1138），并且EXE-DOX組股四頭肌TNF-α水平顯著低于SED-DOX組（P<0.05，見圖4C），說明8周中等強度有氧運動能緩解由于阿霉素給藥導(dǎo)致的股四頭肌TNF-α水平升高。

WB檢測股四頭肌中TNF-R1表達水平，結(jié)果顯示SED-SAL與EXE-SAL組間、SED -DOX與EXE-DOX組間，均具有非常顯著性差異（P<0.01），說明8周中等強度有氧運動能顯著降低股四頭肌TNF-R1的表達。而對比SED-SAL與SED-DOX組，2組間股四頭肌TNF-R1水平也存在非常顯著性差異（P<0.01），說明阿霉素給藥會促進股四頭肌TNF-R1的表達；同時，EXE-SAL與EXE-DOX組TNF-R1相對表達量幾乎一致（P=0.7539，見圖4D），說明8周中等強度有氧運動同時能顯著抑制阿霉素導(dǎo)致的股四頭肌TNF-R1水平升高。

WB檢測股四頭肌TNF-R2表達水平，各組間均無顯著差異，說明運動及阿霉素對股四頭肌TNF-R2水平影響并不顯著（見圖4E）。

2.4 8周中等強度有氧運動減緩阿霉素誘導(dǎo)的

TNF-α/TNF-R1通路下游反應(yīng)

WB結(jié)果顯示，8周中等強度有氧運動及阿霉素對小鼠股四頭肌中MuRF-1、Caspase-8的影響是一致的。SED-SAL組股四頭肌中2種蛋白水平均顯著低于SED-DOX組（P<0.05），說明阿霉素給藥導(dǎo)致MuRF-1、Caspase-8表達增加；而EXE-DOX組股四頭肌中2種蛋白水平均顯著低于SED-DOX組（P<0.05，見圖5B、C），說明8周中等強度有氧運動能減緩阿霉素給藥導(dǎo)致的股四頭肌中肌萎縮相關(guān)蛋白MuRF-1及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8的表達升高。MuRF-1與Caspase-8各組間變化趨勢同TNF-α變化趨勢一致，表明他們的變化可能是由于TNF-α/TNF-R1通路激活導(dǎo)致的下游反應(yīng)。

2.5 8周中等強度有氧運動降低小鼠股四頭肌TNF-α及TNF-R1水平

為進一步確認運動對于小鼠股四頭肌TNF-α及TNF-R1水平的影響，使用運動后48 h取材小鼠檢測。ELISA結(jié)果顯示，最后一次運動結(jié)束48 h后，小鼠血漿中TNF-α水平SED與EXE組組間并無顯著差異（見圖6A）；但WB結(jié)果顯示，EXE組股四頭肌中TNF-α表達水平顯著低于SED組（P<0.05，見圖6C）。血漿與股四頭肌中TNF-α水平的差異可能是由于運動后股四頭肌中PGC-1α激活導(dǎo)致的結(jié)果，有研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α激活能抑制炎癥反應(yīng)，從而降低組織中TNF-α水平。WB結(jié)果顯示，EXE組股四頭肌中PGC-1α表達水平顯著高于SED組（P<0.05，見圖6D）；將小鼠股四頭肌中PGC-1α與TNF-α做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)EXE組具有高PGC-1α和低TNF-α水平分布傾向，而SED組具有低PGC-1α和略高TNF-α水平分布傾向（見圖6E）。這說明PGC-1α的表達伴隨著TNF-α水平的抑制，但此相關(guān)性分析并不能闡明兩者間的因果關(guān)系。

WB結(jié)果顯示，訓(xùn)練結(jié)束48 h后，EXE組小鼠股四頭肌中TNF-R1表達水平已非常顯著低于SED組（P<0.01，見圖6F），說明確實是8周跑臺運動使股四頭肌TNF-R1水平顯著下降。

3分析與討論

3.1阿霉素給藥導(dǎo)致骨骼肌萎縮

阿霉素是廣泛使用的化療藥物，為治療實體瘤、血液腫瘤、白血病等提供了有效的方法。但阿霉素具有非特異性，健康細胞也會受到影響，因此包括骨骼肌萎縮在內(nèi)的有害副作用限制了阿霉素全身給藥時更有效劑量的臨床使用。據(jù)估計，多達80%的癌癥患者在接受化療時體重減輕，而骨骼肌過度消耗被認為是導(dǎo)致體重變化的主要原因。本研究中，采用阿霉素分次給藥方案：每次5 mg/kg體重，每次間隔4d，共4次，腹腔注射，此方法更符合臨床給藥劑量及給藥方式。結(jié)果顯示，接受阿霉素給藥的小鼠（SED-DOX和EXE-DOX）相比于接受生理鹽水的小鼠（SED-SAL和EXE- SAL）體重下降13.5%，股四頭肌質(zhì)量下降9.5%。對比采用相同給藥方案的研究，阿霉素給藥使小鼠體重下降16%，比目魚肌質(zhì)量下降7%，研究結(jié)果相似。

本研究對肌肉切片進行H&E染色觀察到阿霉素給藥后小鼠股四頭肌肌纖維排列紊亂，細胞間隙增大，部分細胞出現(xiàn)細胞核外溢以及膠原纖維分布的現(xiàn)象：對肌纖維橫截面積的統(tǒng)計結(jié)果顯示，阿霉素給藥導(dǎo)致骨骼肌平均CSA顯著減小，且使橫截面積小的肌纖維的相對豐度增大，以上結(jié)果表明阿霉素給藥使小鼠骨骼肌發(fā)生萎縮。此結(jié)果與聚焦于阿霉素對小鼠脛骨前肌、大鼠比目魚肌和趾長伸肌影響的相關(guān)研究結(jié)果一致；在Min等人的研究中進一步指出，阿霉素給藥導(dǎo)致小鼠Ⅰ、ⅡA與ⅡB型肌纖維CSA均顯著性減小。

在骨骼肌功能方面，本研究僅測試了小鼠的最大跑速，結(jié)果顯示阿霉素組最大跑速與對照組相比顯著下降，表明骨骼肌功能受到阿霉素的影響。多項動物研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素給藥對骨骼肌功能的影響表現(xiàn)在耐力及力量2個方面，不僅使小鼠在最大耐力跑步測試中表現(xiàn)顯著受損，且使最大抽搐力呈劑量依賴性降低，同時“力-頻率”關(guān)系顯著降低，多方面表明肌肉功能受損。

3.2 8周中等強度有氧運動抵抗阿霉素導(dǎo)致的骨骼肌萎縮

目前對消除或緩解阿霉素這類藥物引起的毒副作用的最佳方法尚未達成共識，而在使用阿霉素治療的同時，輔助治療應(yīng)考慮減輕阿霉素對肌肉的不良影響，以誘導(dǎo)更好的抗腫瘤反應(yīng)。1979年，Combs等通過一次30 min的劇烈游泳提高了接受阿霉素給藥小鼠的存活率，第一次證明運動訓(xùn)練可抵抗阿霉素毒性。這一發(fā)現(xiàn)改變了之前人們普遍認為運動訓(xùn)練會因活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加和線粒體功能障礙而加劇阿霉素毒性的看法，促進大量工作致力于確定運動如何減少阿霉素毒副作用，并促進多項評估運動作為化療輔助療法的安全性和有效性的臨床試驗開展。

大量研究采用運動作為干預(yù)手段以抵抗阿霉素給藥產(chǎn)生的副作用，而無論是給藥前、給藥過程中，或者從給藥開始持續(xù)至給藥結(jié)束后一段時間，運動干預(yù)都能對骨骼肌產(chǎn)生一定程度的有益影響。不同的運動方式，如有氧運動、抗阻訓(xùn)練、間歇訓(xùn)練，也都能產(chǎn)生有益作用，其中有氧運動在對比研究中表現(xiàn)出更有效的結(jié)果。值得一提的是，上述研究中大多數(shù)運動方案僅1-2周就能產(chǎn)生有益結(jié)果，但他們多采用阿霉素急性給藥方式，并在給藥72 h內(nèi)取材，未考慮阿霉素長期作用的影響。

不同運動方式給骨骼肌帶來的影響不盡相同，本研究擬探究長期有氧運動對骨骼肌產(chǎn)生的影響，及其是否對阿霉素慢性誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮具有保護作用。因而選用中等強度有氧運動預(yù)干預(yù)方式，使運動組小鼠以60%最大跑步速度進行跑臺運動，每次50 min，每周5d，持續(xù)8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8周中等強度有氧運動并未影響小鼠的體重、骨骼肌質(zhì)量、CSA等；而8周中等強度有氧運動使股四頭肌中橫截面積大的肌纖維豐度增大，并增加有氧代謝Ⅰ型肌纖維數(shù)量；在阿霉素給藥后，8周中等強度有氧運動能一定程度抵抗阿霉素誘導(dǎo)的小鼠體重下降、運動能力下降，維持住小鼠的肌肉質(zhì)量、平均CSA等。

3.3抑制TNF-α及TNF-R1水平可能是8周中等強度有氧運動抵抗阿霉素導(dǎo)致的骨骼肌萎縮的途徑之一

盡管已經(jīng)確定在阿霉素給藥前進行有氧8運動訓(xùn)練可以緩解阿霉素引起的骨骼肌萎縮，但其中的機制仍不明晰?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的有氧運動引起骨骼肌的多種變化，均可能是其中的潛在機制。大量研究表明，阿霉素給藥后線粒體功能障礙引起氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS是損傷骨骼肌的主要途徑之一；而運動引起的內(nèi)源性抗氧化劑增加、線粒體生物活性改善有可能防止阿霉素引起的肌肉萎縮。本研究中小鼠在接受有氧運動訓(xùn)練后，股四頭肌中PGC-1α表達增加，不僅僅能抑制組織中TNF-α水平，同時能使線粒體功能增強，這正與大多數(shù)研究指出的阿霉素誘導(dǎo)骨骼肌毒性部分是由于ROS的生成增加以及由此導(dǎo)致的肌纖維氧化損傷相對應(yīng)。除此之外，在蛋白質(zhì)合成方面，阿霉素給藥期間及之后進行有氧運動可通過改善蛋白質(zhì)合成信號通路mTOR/P70S6等來抵抗阿霉素誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌萎縮；在蛋白質(zhì)降解方面，有氧運動能夠通過多種途徑抑制阿霉素導(dǎo)致的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)UPS的激活。

除上述可能機制外，Gilliam等人發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)的膈肌無力是通過TNF-R1介導(dǎo)的。另一項研究向小鼠植入可溶性TNF-R1，發(fā)現(xiàn)TNF-α可能是導(dǎo)致荷瘤小鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)丟失的原因；另一方面，他們又通過敲除TNF-R1減輕了荷瘤小鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)丟失。以上結(jié)果表明，TNF-R1水平是TNF-α/TNF-R1通路誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)小鼠血漿、股四頭肌中TNF-α水平顯著升高，且TNF-α與TNF-R1結(jié)合后，激活下游反應(yīng)的相關(guān)蛋白MuRF-1和Caspase-8表達水平顯著升高，因而TNF-α/TNF-R1通路可能是本研究中阿霉素誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的途徑之一。檢測運動后小鼠血漿及股四頭肌TNF-α水平發(fā)現(xiàn)，8周中等強度有氧運動能顯著降低股四頭肌中TNF-α表達水平：更為重要的是.8周中等強度有氧運動能非常顯著抑制股四頭肌中TNF-R1水平，并且在阿霉素給藥后，對TNF-R1表達的抑制仍能維持，表明8周有氧運動能夠有效下調(diào)TNF-R1表達水平，抑制細胞凋亡和蛋白質(zhì)降解反應(yīng)，維持骨骼肌質(zhì)量和肌纖維大小，緩解阿霉素造成的骨骼肌萎縮。

關(guān)于運動對TNF-R1的影響，在現(xiàn)有發(fā)表過的研究中，僅Tsukui等的研究顯示為期5個月中等強度規(guī)律運動能抑制肥胖女性循環(huán)血液中TNF-α、可溶性TNF-R1和TNF-R2蛋白表達水平。Stracz-kowski等的研究結(jié)果顯示持續(xù)12 d的70%最大心率的功率自行車訓(xùn)練對循環(huán)中可溶性TNF-R1水平并無影響，此研究結(jié)果與Tsukui等研究的不同可能是由于運動干預(yù)僅進行了12d，在干預(yù)時長上未達到抑制TNF-R1表達的程度。這2項研究關(guān)注運動對循環(huán)血液中可溶性TNFR表達水平的影響，而本研究突破性地發(fā)現(xiàn)8周中等強度有氧運動能顯著抑制小鼠股四頭肌中TNF-R1表達水平。但需要說明的是，本研究并未進一步驗證運動前后、阿霉素給藥前后TNF-α與TNF-R1的結(jié)合水平：同時并未指出TNF-R1水平的下調(diào)在持續(xù)運動的第幾周能出現(xiàn)顯著性的變化，此變化在停止運動訓(xùn)練后能維持多長時間。

4結(jié)論

8周中等強度有氧運動抑制股四頭肌TNF-α、TNF-R1表達水平，抑制阿霉素給藥后TNF-α/TNF-R1通路下游蛋白質(zhì)降解和細胞凋亡反應(yīng)，這可能是運動抵抗阿霉素誘導(dǎo)小鼠股四頭肌萎縮的潛在原因之一。

作者貢獻聲明：

陳夢潔：設(shè)計并進行實驗，收集、處理數(shù)據(jù)，撰寫、修改論文。

段銳：構(gòu)建實驗框架，提供實驗指導(dǎo)，修改論文。