常樂 孫禎 蔡振煜 翁曉源 董學(xué)峰

摘要?目的：分析褪黑素對白細(xì)胞介素-17（IL-17）刺激下類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活性及相關(guān)蛋白Rankl、Bcl-2和Bax表達(dá)水平的影響。方法：將類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞分為對照組、IL-17組及IL-17+褪黑素組，分別使用CCK8試劑盒以及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性及相關(guān)蛋白Rankl、Bcl-2及Bax表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組比較，IL-17組有更高的細(xì)胞活性（P<0.01）；而IL-17+褪黑素組的細(xì)胞活性低于IL-17組（P<0.01）。與對照組比較，IL-17組的Rankl、Bcl-2蛋白表達(dá)水平上升，Bax表達(dá)水平下降（P<0.01）；與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Rankl、Bcl-2表達(dá)水平則下降，Bax表達(dá)水平上升（P<0.01）。結(jié)論：褪黑素能抑制IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的活性作用，同時褪黑素能減弱IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞表達(dá)Rankl以及抗凋亡作用。

關(guān)鍵詞?類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素-17；褪黑素；睡眠；晝夜規(guī)律

Effects of Sleep-regulated Melatonin on Synovial Cells in Rheumatoid ArthritisCHANG Le1，SUN Zhen1，CAI Zhenyu2，WENG Xiaoyuan1，DONG Xuefeng1

（1 Department of Internal Medicine，Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China; 2 Department of Orthopedics，Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

Abstract?Objective：To analyze the effect of melatonin on the activity of synovial cells and the expression of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax in rheumatoid arthritis stimulated by interleukin-17 （IL-17）.Methods：Rheumatoid arthritis synovial cells were divided into control group，IL-17 group and IL-17+melatonin group.Cell activity and expression levels of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax were detected by CCK8 kit and western blotting.Results：Compared with the control group，the IL-17 group had higher cell activity （P<0.01）.The cell activity of IL-17+melatonin group was lower than that of IL-17 group （P<0.01）.Compared with the control group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 proteins in the IL-17 group increased，while the expression levels of Bax decreased （P<0.01）.Compared with the IL-17 treatment group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 in the IL-17+melatonin group decreased，and the expression level of Bax increased （P<0.01）.Conclusion：Melatonin can inhibit the activity of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells，and melatonin can reduce the expression of Rankl and anti apoptosis of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells.

Keywords?Rheumatoid arthritis; Interleukin-17; Melatonin; Sleep; Circadian rhythm

中圖分類號：R593.22；R338.63文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.065

褪黑素是人體的一種內(nèi)源性激素，主要由松果體分泌，它的分泌有晝夜規(guī)律并且和年齡有關(guān)，可以誘導(dǎo)自然睡眠并具有抗氧化和抗炎活性。白天的光照信息可以通過人和動物的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)傳遞到視交叉上核，從而抑制褪黑素的分泌，其含量低至幾乎檢測不到；然而褪黑素在夜間分泌量逐漸增多，于凌晨2～4點(diǎn)間達(dá)高峰［1-4］。由此可見，褪黑素分泌的高峰期正處于人和動物的睡眠期。褪黑素是一種天然有效的抗炎及抗氧化劑，富含電子的芳香系統(tǒng)及由氧甲基和氮乙酰基殘基產(chǎn)生的化合物兩親性被認(rèn)為是其功能的分子基礎(chǔ)［5］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種由于滑膜增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和殘疾的慢性炎癥性自身免疫性疾病。白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）是一種重要的炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，例如IL-6、IL-8和粒細(xì)胞集落刺激因子［6］。先前的研究表明，IL-17可增強(qiáng)成纖維滑膜細(xì)胞的遷移、侵襲，從而加重RA的后果［7］。本研究旨在探究褪黑素在IL-17刺激下的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的作用。

1?材料與方法

1.1?細(xì)胞培養(yǎng)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司），在含10%胎牛血清（HyClone，Logan，UT，USA）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Grand Island，NY，USA）中培養(yǎng)，放置于37 ℃，5%CO2的孵箱中。細(xì)胞因子IL-17（PeproTech公司）；褪黑素（索萊寶生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司）；Rankl、Bcl-2和Bax一抗（Abcam公司）。

1.2?細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

將滑膜細(xì)胞以3×103/cm2的密度接種到96孔板中，分別在0 h，1 d及2 d時，隨機(jī)取出一塊96孔板，將CCK-8溶液（10 μL）添加到每個孔中，并在37 ℃下孵育1 h。然后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度，以此來檢測各組細(xì)胞在不同刺激下的細(xì)胞活性。

1.3?蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞在4 ℃下用裂解緩沖液裂解并以12 000 r/min離心30 min后收集上清液。將上清液與上樣緩沖液混合并煮沸5 min。樣品通過12%SDS-PAGE分離后，在60 V條件下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h，4 ℃孵育過夜。之后再將一抗稀釋，1∶1 000孵育結(jié)合目的蛋白，隨后將膜用TBST洗滌3次，并在室溫下予以1∶6 000或1∶10 000稀釋的二抗孵育2 h。使用EC3成像系統(tǒng)（UVP Inc.，Upland，CA，USA）對條帶進(jìn)行可視化，并使用ImageJ軟件（NIH）測量每個條帶的光密度。

1.4?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t組間兩兩比較，所有的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?褪黑素抑制IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞的活性作用

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，0.1 mmol/L褪黑素對細(xì)胞活性的影響無統(tǒng)計學(xué)差異，而0.5 mmol/L褪黑素抑制細(xì)胞的活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。為了排除高濃度褪黑素本身對細(xì)胞的不良反應(yīng)，后續(xù)研究采用對細(xì)胞活性無明顯抑制作用的0.1 mmol/L的褪黑素濃度。結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-17（20 ng/mL）組可以提高細(xì)胞活性（P<0.01），而在相同時間點(diǎn)上，IL-17（20 ng/mL）+褪黑素（0.1 mmol/L）組的細(xì)胞活性低于IL-17（20 ng/mL）組（P<0.01）。見表2。這意味著褪黑素能抑制IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞的活性作用。

2.2?褪黑素可減弱IL-17刺激下的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞生成骨侵蝕因子Rankl，同時減弱細(xì)胞抗凋亡水平

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-17處理組的Rankl蛋白表達(dá)水平顯著增多（P<0.01），這表明IL-17能促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞表達(dá)Rankl蛋白。而與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Rankl表達(dá)水平則明顯下降（P<0.01），這表明褪黑素能減弱IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞表達(dá)Rankl的作用。見圖1。而在凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)水平上，與對照組比較，IL-17處理組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增多（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)水平顯著增減低（P<0.01），這表明IL-17促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞抗凋亡能力提升。而與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Bcl-2表達(dá)水平則明顯下降（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)水平顯著增高（P<0.01），這表明褪黑素能減弱IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞抗凋亡作用。見圖2。

3?討論

睡眠障礙是風(fēng)濕病的一個常見但未被認(rèn)識的特征。睡眠對人類免疫力有著重大而廣泛的影響，對人類健康至關(guān)重要，并且越來越被認(rèn)同是一種影響生活的行為。在新西蘭進(jìn)行的一項(xiàng)動物模型研究表明，睡眠不足會導(dǎo)致免疫紊亂，這不僅可能包括對病原體的反應(yīng)降低，還可能破壞免疫自我耐受，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的出現(xiàn)。根據(jù)研究，50%～75%的RA患者患有睡眠障礙，睡眠質(zhì)量差和總睡眠時間減少是RA患者的常見癥狀，失眠影響了一半以上的患者。

在橫斷面研究中，睡眠障礙與RA有關(guān)，但研究結(jié)果相互矛盾，尚不清楚睡眠問題是否是RA的獨(dú)立風(fēng)險因素。根據(jù)RA睡眠障礙隊列研究的基線評估數(shù)據(jù)，87.4%的人睡眠時間短。隨著疾病活動的惡化，包括疼痛、疲勞和功能障礙在內(nèi)的身體健康狀況受到影響，睡眠障礙變得更加常見。英國的一項(xiàng)隊列的基線數(shù)據(jù)顯示，類風(fēng)濕因子水平與睡眠時間有關(guān)，這意味著睡眠時間可能會影響類風(fēng)濕因子水平。這些結(jié)果表明，睡眠障礙可能導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［8］。

盡管有證據(jù)表明，這些患者在慢波睡眠期間的睡眠潛伏期更長，睡眠效率較差，覺醒次數(shù)更多，但是目前很少有對照研究對RA患者的睡眠進(jìn)行定量評估。據(jù)我們所知，只有2項(xiàng)研究使用活動記錄儀來評估RA患者夜間覺醒的次數(shù)。此外，大多數(shù)研究受到缺乏比較對照、樣本量小和依賴傳統(tǒng)睡眠評分方法的限制，相對缺乏對RA患者的睡眠和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行綜合評估的研究。

RA患者的睡眠質(zhì)量比正常人群差，50%～75%的患者會出現(xiàn)睡眠問題，RA患者睡眠障礙可能跟疼痛、抑郁和疾病活動有關(guān)。RA患者已被證實(shí)晝夜節(jié)律存在異常，其關(guān)節(jié)腫痛、僵硬等臨床癥狀晨起加重的臨床現(xiàn)象被認(rèn)為與患者體內(nèi)的炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-1、IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子α等在夜間異常升高，而具有抗炎作用的皮質(zhì)醇等激素分泌相對不足有關(guān)［9］。下丘腦-垂體-腎上腺軸損傷、褪黑素的水平波動可能在造成RA晝夜節(jié)律異常中起重要作用。褪黑素在負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律外，被證明在哺乳動物中具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性［10］。在一項(xiàng)涉及RA患者的臨床試驗(yàn)中，褪黑素被認(rèn)為是通過其抗氧化作用發(fā)揮著治療的效果［11］。成纖維滑膜細(xì)胞是RA的關(guān)鍵參與者，其通過分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶促進(jìn)RA的進(jìn)展。本人既往研究已證實(shí)IL-17可以促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞增殖，同時通過STAT3通路調(diào)控細(xì)胞自噬水平［12］。有研究支持IL-17在RA中具有促炎、加重關(guān)節(jié)損傷、促進(jìn)免疫因子釋放等作用［13］。本研究結(jié)果顯示，褪黑素可以減弱類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，升高Bax蛋白水平，意味著細(xì)胞的抗凋亡能力下降。

綜上所述，結(jié)合本研究結(jié)果，褪黑素能抑制IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞的活性作用，同時褪黑素能減弱IL-17對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞表達(dá)Rankl以及抗凋亡作用。因此，在臨床治療上，我們可以通過有效地管理睡眠，促進(jìn)患者自身褪黑素水平的增加，可能會對減緩RA的癥狀有所作用。

利益沖突聲明：無。

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基金項(xiàng)目：泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級課題青年科技（XJK1922B）通信作者：董學(xué)峰，E-mail：707683823@qq.com