閆俊苗 徐煒 劉立科 王盼

摘要?目的：探討茯苓水提取物、三七水提取物及其提取物對(duì)小鼠睡眠作用的影響及作用機(jī)制。方法：采用直接睡眠、戊巴比妥鈉延長睡眠時(shí)間、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠、巴比妥鈉睡眠潛伏期，檢測小鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠睡眠情況的影響，通過急性毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)茯苓三七水提取物復(fù)合物的安全性。結(jié)果：茯苓水提取物、三七水提取物及其水提取物復(fù)合物各劑量組結(jié)果顯示，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)可以延長小鼠的睡眠時(shí)間。茯苓三七水提取物復(fù)合物各劑量組小鼠睡眠發(fā)生率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），除三七水提取物低劑量組外，其余各組小鼠的睡眠潛伏期有所縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，茯苓三七水提取物復(fù)合物中、高劑量組小鼠下丘腦及血清中的5-羥色胺（5-HT）與γ-氨基丁酸（GABA）含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），明顯增加失眠大鼠下丘腦中的5-HT和GABA含量，調(diào)節(jié)下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，并且不會(huì)產(chǎn)生毒性。結(jié)論：茯苓水提取物、三七水提取物及茯苓三七水提取物復(fù)合物均可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等方面改善小鼠睡眠，并且茯苓水提取物和三七水提取物組成的復(fù)合物具有協(xié)同增效，安全性良好。

關(guān)鍵詞?茯苓；三七；改善睡眠；戊巴比妥鈉；巴比妥鈉；神經(jīng)遞質(zhì)；5-羥色胺；γ-氨基丁酸

Analysis of the Effects of Poria Cocos，Panax Notoginseng and Their Complexes on Improving Sleep in MiceYAN Junmiao1，2，XU Wei3，LIU Like4，WANG Pan1，2

（1 School of Chemical Engineering，Northwest University，Xi′an 710069，China; 2 Institute of Biomedicine，Northwest University，Xi′an 710069，China; 3 Shaanxi Taibai Wine Co.，Ltd.，Baoji 722300，China; 4 Shaanxi Institute of Medical Device Quality Inspection，Xianyang 712046，China）

Abstract?Objective：To explore the effects and mechanisms of Poria cocos water extract，Panax notoginseng water extract and their extracts on sleep in mice.Methods：Direct sleep，prolonged sleep time with pentobarbital sodium，subthreshold dose hypnosis with pentobarbital sodium，and sleep latency with pentobarbital sodium were used to detect the changes in neurotransmitter content in the hypothalamus of mice，evaluate its impact on mouse sleep，and evaluate the safety of Poria cocos notoginseng water extract complex through acute toxicity experiments.Results：The results of each dose group of Poria cocos water extract，Panax notoginseng water extract and their water extract complex showed that pentobarbital sodium induction can prolong the sleep time of mice.The sleep incidence of mice in each dose group of Poria cocos and Panax notoginseng water extract complex was significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Except for the low-dose group of Panax notoginseng water extract，the sleep latency of other groups of mice was shortened，and the difference was statistically significant（P<0.05）.In addition，the levels of 5-hydroxytryptamine（5-HT） in the hypothalamus and serum of mice in the middle and high-dose groups of Poria cocos and Panax notoginseng water extract complex were found to be correlated with γ-Aminobutyric acid γ-The content of Aminobutyric acid（GABA） was significantly higher than that of the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）.It significantly increased the content of 5-HT and GABA in the hypothalamus of insomnia rats，regulated the change of the content of neurotransmitters in the hypothalamus，and did not produce toxicity.Conclusion：Pachycoia water extract，Notoginseng water extract and pachycoia Notoginseng water extract complex can improve sleep of mice by regulating neurotransmitter，and the complex composed of pachycoia water extract and Notoginseng water extract has synergistic effect and good safety.

Keywords?Poria cocos; Sanqi; Improve sleep; Pentobarbital sodium; Sodium barbiturate; Neurotransmitters; 5-hydroxytryptamine; γ-aminobutyric acid

中圖分類號(hào)：R338.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.063

睡眠是一種重要的生理活動(dòng)，良好的睡眠是提升免疫力最直接、最有效的方式之一。但在當(dāng)今社會(huì)，隨著社會(huì)競爭日趨激烈，人們生活節(jié)奏不斷加快，越來越多的人由于缺乏有效的調(diào)節(jié)產(chǎn)生了一系列睡眠障礙。根據(jù)《2023中國健康睡眠白皮書》結(jié)果顯示，有近80%的受調(diào)者都伴隨睡眠困擾的情況。失眠已逐漸成為影響人們生活健康的重大問題，如可能引起感知力、注意力、記憶力、思維、情緒等意志行為出現(xiàn)異常，甚至可能引發(fā)抑郁癥、癲癇等疾?。?-2］，有研究表明長期失眠也會(huì)加重高血壓、冠心病、腦出血、乳腺癌、偏癱、糖尿病等多種疾病［3-5］。因此，維持良好的睡眠對(duì)提高國民健康水平有著很重要的影響。

目前治療和改善失眠的西藥包括苯二氮艸卓類藥物、抗抑郁藥、抗組胺藥等，這些藥物起效迅速、服用便捷，但都可能擾亂覺醒和認(rèn)知功能，影響運(yùn)動(dòng)功能，且會(huì)隨著使用時(shí)間推移產(chǎn)生耐藥性，甚至導(dǎo)致藥物依賴等不良反應(yīng)。因此，急需挖掘和開發(fā)更多安全有效地改善睡眠的食物及保健食品。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)許多中藥在改善睡眠方面作用顯著，且不良反應(yīng)低。國家“十四五”規(guī)劃和2035年遠(yuǎn)景目標(biāo)綱要也提出，要推動(dòng)中醫(yī)藥的傳承和創(chuàng)新，發(fā)揮中藥材在疾病預(yù)防中的優(yōu)勢。因此，探索我國豐富的傳統(tǒng)中藥材在改善睡眠等方面的作用成為新的研究熱點(diǎn)。

茯苓是由多孔菌科真菌茯苓的菌核經(jīng)過干燥工藝制成，是我國傳統(tǒng)的藥食同源中藥材，其中三萜類、多糖類、甾醇類、氨基酸、揮發(fā)油及微量元素等都可以起到相應(yīng)的功效［8］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明茯苓三萜酸能夠增加γ-氨基丁酸（GABA）的含量，從而促進(jìn)睡眠［6］，茯苓多糖通過協(xié)同戊巴比妥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到催眠安神的效果［7］。三七屬于五加科人參屬植物，是我國云南文山州的特色藥材，主要活性成分是其所含的總皂苷。研究表明三七中的花［8］、莖葉［9］和果梗［10］等均有鎮(zhèn)靜安神的效果。本研究以這2種藥食同源的茯苓和三七為主，根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》（2022年版），采用直接睡眠實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉延長睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)小鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，對(duì)茯苓水提取物、三七水提物及其水提取物復(fù)合物進(jìn)行驗(yàn)證其對(duì)動(dòng)物是否具有改善睡眠功能的實(shí)驗(yàn)，以期為藥食同源的中藥、地方特色食品、助睡眠產(chǎn)品在實(shí)際產(chǎn)品中的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量子均為18～22 g（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（陜）2018-001，飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h照明，12 h黑暗交替，自由攝食和飲水）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求操作，實(shí)驗(yàn)開展經(jīng)過西北大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：NWU-AWC-20210809M）。

1.1.2?試劑與儀器?實(shí)驗(yàn)試劑：茯苓飲片、三七粉（陜西嘉禾生物科技股份有限公司）；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號(hào)：P11011、B0500）；5-HT、GABA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20210504、20210509）。實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：ME104E/02］；臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)療器械廠，型號(hào)：TGL-16C）；立式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：DW-86L3386）；超純水制備機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號(hào)：UPR-II-20L）；實(shí)驗(yàn)室雪花制冰機(jī)（常州市金閶電器有限公司，型號(hào)：SZB-20）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?1）茯苓水提取物、三七水提物及其水提取物復(fù)合物的制備：茯苓水提物按重量（茯苓：水=1∶10）于95 ℃提取2次，每次2 h，經(jīng)過濾、濃縮、噴霧干燥、粉碎過篩制備，水提得率為5%，其功效成分為茯苓多糖。三七水提物按重量（三七：水=1∶8）于95 ℃提取3次，每次22 h，經(jīng)過濾、濃縮、噴霧干燥、粉碎過篩制備，水提得率為10%，其功效成分為三七總皂苷。茯苓三七復(fù)合物按照茯苓水提物、三七水提物=7：2的重量比例混合制備。

1.2.2?茯苓水提取物、三七水提物及其水提取物復(fù)合物改善睡眠的評(píng)價(jià)方法?選擇昆明種雌性小鼠，將雌性小鼠分為3個(gè)觀察組，為直接睡眠實(shí)驗(yàn)、延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)，觀察組根據(jù)小鼠體質(zhì)量分為10個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。按照人體每日推薦服用量三七水提物為60 mg，即1 mg/（kg·bw）（折合生藥量0.6 g/d，三七在《中華人民共和國藥典》中的推薦每日生藥用量為3～9 g，由于本研究擬開發(fā)產(chǎn)品為保健食品，屬于食品范疇，因此用量低于藥典最低用量，且改善睡眠產(chǎn)品多為各功效原料聯(lián)合使用，因此每種原料的使用量均相對(duì)較少），茯苓水提物人體每日服用量為210 mg，即3.5 mg/（kg·bw）（折合生藥量4.2 g/d，茯苓在《中華人民共和國藥典》中的推薦每日生藥用量為10～15 g，設(shè)計(jì)理由同三七提取物），依據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》（2022年版）中“有助于改善睡眠檢驗(yàn)方法”進(jìn)行茯苓、三七及其復(fù)合物的改善睡眠功能評(píng)價(jià)，設(shè)置3個(gè)劑量組，以人體的10倍劑量為一個(gè)劑量組，另設(shè)5倍和20倍劑量，根據(jù)要求設(shè)置三七水提物低［5 mg/（kg·bw）］、中［10 mg/（kg·bw）］、高［20 mg/（kg·bw）］單方劑量組，茯苓水提取物低［17.5 mg/（kg·bw）］、中［35 mg/（kg·bw）］、高［70 mg/（kg·bw）］單方劑量組，及茯苓三七復(fù)合物低［22.5 mg/（kg·bw）］、中［45 mg/（kg·bw）］、高［90 mg/（kg·bw）］劑量組。順時(shí)采用對(duì)應(yīng)劑量給小鼠灌胃，體積為0.2 mL/（10 g·bw），給予對(duì)照組等體積的dd H2O溶液，每組均進(jìn)行灌胃1次/d，連續(xù)進(jìn)行30 d。

1.2.3?直接睡眠實(shí)驗(yàn)?動(dòng)物只數(shù)、分組、給藥劑量，給受實(shí)物方法均同1.2.2一致。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)，從翻正反射消失到其恢復(fù)的時(shí)間為小鼠的睡眠時(shí)間。觀察并統(tǒng)計(jì)每個(gè)觀察組和空白對(duì)照組小鼠的睡眠時(shí)間。

1.2.4?延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)?動(dòng)物只數(shù)、分組、給藥劑量，給受方法均同1.2.2所述。戊巴比妥鈉溶液劑量通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出為50 mg/（kg·bw），末次灌胃30 min后，通過給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液［50 mg/（kg·bw）］，以小鼠翻正反射消失認(rèn)為其進(jìn)入睡眠期，觀察睡眠持續(xù)時(shí)間即從翻正反射開始消失到恢復(fù)的時(shí)間。注射劑量0.2 mL/（20 g·bw），比較各受實(shí)物對(duì)小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響。

1.2.5?戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)?動(dòng)物只數(shù)、分組、給藥劑量，給受實(shí)物方法均同1.2.2所述。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定戊巴比妥鈉溶液劑量為30 mg/（kg·bw），于末次灌胃15 min后，隨后給予各組動(dòng)物腹腔注射30 mg/（kg·bw）戊巴比妥鈉（最大閾下催眠劑量），注射量為0.2 mL/（20 g·bw），以翻正反射消失達(dá)1 min以上為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 min內(nèi)小鼠的入睡數(shù)量。

1.2.6?巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)?動(dòng)物只數(shù)、分組、給藥劑量，給受實(shí)物方法均同1.2.2所述。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定巴比妥鈉溶液劑量為250 mg/（kg·bw），于末次灌胃后30 min后，腹腔注射巴比妥鈉［250 mg/（kg·bw）］，腹腔注射巴比妥鈉溶液到翻正反射消失的時(shí)間為睡眠潛伏期，記錄該時(shí)間。溶液注射劑量0.2 mL/20 g·bw，比較各受實(shí)物對(duì)小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.2.7?小鼠下丘腦和血清中5-HT、GABA水平測定??第一批100只小鼠完成閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)后，禁食不禁水1 d，次日清晨稱量小鼠質(zhì)量，摘眼球取血，將血液迅速離心（5 000 r/min，5 min），收集血清待測；隨后進(jìn)行脫臼頸椎致死，斷頭取腦于冰上，用預(yù)冷生理鹽水漂洗分離出來的下丘腦組織，用濾紙拭干，稱得下丘腦組織質(zhì)量。依據(jù)下丘腦組織質(zhì)量（g）：體積（mL）=1∶9比例，加入9倍體積的生理鹽水，采用玻璃勻漿器在冰水浴條件下進(jìn)行勻漿，獲得組織勻漿化，4 ℃下離心（5 000 r/min，5 min）待測離心收取上清液。嚴(yán)格按照5-HT、GABA各指標(biāo)試劑盒的操作步驟進(jìn)行檢測和分析。

1.2.8?茯苓三七復(fù)合物的急性毒性實(shí)驗(yàn)?小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)灌胃劑量為15 000 mg/（kg·bw）、30 000 mg/（kg·bw）（以樣品干重計(jì)，下同），給樣體積為20 mL/kg體質(zhì)量。選購KM小鼠60只（雄性30只，雌性30只），體質(zhì)量18～22 g。觀察5 d后，隨機(jī)按體質(zhì)量分成3組：對(duì)照組、低劑量組［1 500 0 mg/（kg·bw）］、高劑量組［3 000 0 mg/（kg·bw）］，每組20只（雄性10只，雌性10只），根據(jù)提取率折算，高劑量組相當(dāng)于人體每日服用量的100倍，以10 mL/（kg·bw）的灌胃容量給予小鼠灌胃，給予對(duì)照組等體積的dd H2O進(jìn)行灌胃，灌胃1次/d，實(shí)驗(yàn)周期為14 d。急性毒性實(shí)驗(yàn)開始前，前12 h先對(duì)小鼠進(jìn)行禁食不禁水處理，之后小鼠可以自由飲水、進(jìn)食。在實(shí)驗(yàn)周期的0、3、7、14 d，分別稱量小鼠體質(zhì)量。給小鼠灌胃給藥后仍需連續(xù)觀察4 h，評(píng)估小鼠飲食有無異常情況，之后每天觀察至少1次，連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖處理，詳細(xì)比對(duì)小鼠心、肝、脾、肺、腎等器官的各個(gè)組織顏色和質(zhì)地有無異常變化。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比/率（%）表示，采用?x2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?小鼠直接睡眠實(shí)驗(yàn)?三七水提物各單劑量組、茯苓水提物各單劑量組、茯苓三七復(fù)合物各劑量組與對(duì)照組經(jīng)灌胃后小鼠均未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》（2022年版）規(guī)定，可以進(jìn)行后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。見表1。

2.2?延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)???三七水提物、茯苓水提物各單劑量組、茯苓三七復(fù)合物各劑量組結(jié)果得出戊巴比妥鈉對(duì)小鼠睡眠時(shí)間有延長趨勢，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且茯苓三七復(fù)合物的中、高劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明觀察組灌胃劑量可以有效延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間，且茯苓和三七有一定的協(xié)同作用，能夠更好地發(fā)揮戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時(shí)間的作用。對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間得出，茯苓水提物的最低起效劑量為17.5 mg/（kg·bw），三七水提物的最低起效劑量為10 mg/（kg·bw）。見圖1。三七水提物的低、中、高各單劑量組和茯苓水提物低、中、高各單劑量組對(duì)小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)的睡眠發(fā)生率無明顯影響，而茯苓三七復(fù)合物的高劑量組與對(duì)照組相比，探究小鼠的戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)中的睡眠發(fā)生率結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在茯苓三七復(fù)合物的中、低劑量組與對(duì)照組的小鼠睡眠發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明茯苓三七復(fù)合物各劑量組與閾下劑量的戊巴比妥鈉有協(xié)同催眠功效。見表2。

2.3?巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)?三七水提物低、

圖1?各劑量組對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響??注：*表示與對(duì)照組比較，具有顯著性差異（P<0.05），**表示與對(duì)照組比較，具有極顯著性差異（P<0.01）中、高各劑量組、茯苓水提物低、中、高各劑量組和茯苓三七復(fù)合物低、中、高各劑量組誘導(dǎo)動(dòng)物睡眠潛伏期均比對(duì)照組短，且除三七水提物低劑量組外，其余各個(gè)劑量組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。茯苓三七復(fù)合物的高、中劑量組小鼠睡眠潛伏期與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明茯苓水提物、三七水提物及茯苓三七復(fù)合物均具有縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期的作用，且茯苓與三七之間具有一定的協(xié)同增效作用。在本研究中，三七粉的最低小鼠起效劑量為10 mg/（kg·bw），茯苓水提物的最低起效劑量為17.5 mg/（kg·bw），為以后二者在實(shí)際產(chǎn)品中的應(yīng)用劑量提供了理論依據(jù)。見圖2。

2.4?對(duì)小鼠下丘腦中5-HT濃度以及GABA含量的影響?實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各劑量組小鼠下丘腦中的5-HT含量均高于對(duì)照組，且除三七水提物低劑量組［5 mg/（kg·bw）］、茯苓水提物低劑量組17.5 mg/（kg·bw）外其余各組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中茯苓三七復(fù)合物高劑量組［90 mg/（kg·bw）］中小鼠下丘腦中5-HT濃度與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示茯苓水提物、三七提取物和茯苓三七復(fù)合物均能有效提高小鼠下丘腦中5-HT的含量，推測茯苓和三七都能通過調(diào)節(jié)小鼠下丘腦中5-HT的水平來實(shí)現(xiàn)改善睡眠的作用。見圖3A。由圖3B可知，與對(duì)照組比較，除三七水提物低劑量組［5 mg/（kg·bw）］外，各劑量組小鼠下丘腦中的GABA含量均有不同程度上升，且茯苓水提物高劑量組［70 mg/（kg·bw）］、中劑量組［35 mg/（kg·bw）］與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），推測茯苓還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體中GABA的水平來調(diào)控睡眠。依據(jù)茯苓水提取物低、中、高各劑量組、三七提取物低、中、高各劑量組對(duì)小鼠下丘腦中5-HT和GABA含量的差異性影響分析，說明茯苓和三七在機(jī)體中作用機(jī)制存在一定差異，這或許是二者能夠協(xié)同增效發(fā)揮改善睡眠作用的原因之一。關(guān)于二者是否在本研究劑量下對(duì)其他神經(jīng)遞質(zhì)有影響，還需進(jìn)一步研究探索。見圖3B。

2.5?對(duì)小鼠血清中5-HT濃度以及GABA含量的影響?實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各劑量組小鼠血清中的5-HT含量均高于對(duì)照組，且除三七水提物低劑量組［5 mg/（kg·bw）］、三七水提物中劑量組［10 mg/（kg·bw）］、茯苓水提物低劑量組［17.5 mg/（kg·bw）］外其余各組與對(duì)照組比較均具有顯著性差異（P<0.05），其中茯苓三七復(fù)合物中劑量組［45 mg/（kg·bw）］以及茯苓三七復(fù)合物高劑量組［90 mg/（kg·bw）］的小鼠血清中5-HT濃度與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示茯苓水提物、三七提取物和茯苓三七復(fù)合物均能有效提高小鼠血清中5-HT的含量，推測茯苓和三七都能通過調(diào)節(jié)小鼠血清中5-HT的水平來實(shí)現(xiàn)改善睡眠的作用。見圖4A。與對(duì)照組比較，各劑量組小鼠血清中的GABA含量均有不同程度上升，且茯苓水提物高劑量組［70 mg/（kg·bw）］以及茯苓三七復(fù)合物的3個(gè)劑量組，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步說明茯苓能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體中GABA的水平來調(diào)控睡眠。分析茯苓、三七對(duì)小鼠血清中5-HT和GABA含量的差異性影響，也說明二者調(diào)控睡眠的機(jī)制略有不同，關(guān)于二者是否在本研究劑量下對(duì)血清中的其他神經(jīng)遞質(zhì)有影響，還需進(jìn)一步研究探索。見圖4B。

2.6?小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)?在進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中小鼠未出現(xiàn)驚厥不安、便秘腹瀉或者是豎毛等不良反應(yīng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡現(xiàn)象的出現(xiàn)，在急性毒性實(shí)驗(yàn)前后小鼠各組體質(zhì)量的變化，給藥前后小鼠體質(zhì)理與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，肉眼未發(fā)現(xiàn)小鼠各個(gè)臟器存在異常，表明茯苓三七復(fù)合物具有良好的安全性。小鼠的急性毒性試驗(yàn)經(jīng)口耐受劑量>30 g/（kg·bw）。根據(jù)GB 15193.3-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》中急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，茯苓三七復(fù)合物急性毒性屬實(shí)際無毒級(jí)。

3?結(jié)論

睡眠是保障人們生命質(zhì)量和工作效率的重要行為，但是由于生活節(jié)奏加快及壓力日益增大，各種失眠問題越來越嚴(yán)重。失眠的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到多種因素的共同調(diào)控［11-14］，神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)于睡眠調(diào)節(jié)至關(guān)重要［15-16］，神經(jīng)遞質(zhì)可作為失眠的內(nèi)源性指標(biāo)［17-19］，通常包括過度覺醒機(jī)制，是失眠發(fā)生與持續(xù)機(jī)制的重要理論基礎(chǔ)。內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)（睡眠驅(qū)動(dòng)）和晝夜節(jié)律雙雙調(diào)控著有關(guān)腦內(nèi)的睡眠-覺醒系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著睡眠、覺醒的發(fā)生與維持，相關(guān)腦區(qū)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。從神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層面看，睡眠的啟動(dòng)是由下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（Ventrolateral Preoptic Area，VLPO）和下丘腦正中視前區(qū)（Median Preoptic Area，MnPO）的GABA神經(jīng)元及甘丙肽（Galanin）神經(jīng)元的激活［20］。在往常動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得出的相關(guān)結(jié)論，失眠一部分原因是5-HT能神經(jīng)元遭受了損壞或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT的合成過程受到了阻斷［21］，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的GABA能夠抑制傳導(dǎo)興奮，從而能夠起到改善睡眠、抗焦慮、調(diào)節(jié)情緒的作用，參與胃腸功能的調(diào)節(jié)，腸道菌群問題與失眠有一定的關(guān)聯(lián)，腸道乳酸菌能夠促進(jìn)GABA的分泌調(diào)節(jié)，可以有效改善焦慮和抑郁情緒［22］。趙仁云［23］探究了梔子厚樸湯可提高5-HT的含量，有助于5-HIAA在大腦水平上的提高，達(dá)到改善睡眠的效果；百合提取物同樣可以有效增加5-HT并上調(diào)5-HT1A的表達(dá)；可以將下丘腦神經(jīng)元的病理得到有效改善，未來可考慮進(jìn)行新型藥物或保健食品的研制［24］；陳抒鵬等［25］討論失眠大鼠的睡眠及飲食，可能與促進(jìn)GABAA、GABAB mRNA表達(dá)，增加GABAA、GABAB蛋白的翻譯有關(guān)，并驗(yàn)證出GABA可通過調(diào)節(jié)腸道菌群達(dá)到促進(jìn)睡眠，改善脾虛。

目前有關(guān)改善睡眠的實(shí)驗(yàn)探究大多從動(dòng)物行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)等方面詳細(xì)展開。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物行為的藥理學(xué)研究，采用直接睡眠、戊巴比妥鈉延長睡眠時(shí)間、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠、巴比妥鈉睡眠潛伏期，檢測小鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠睡眠情況的影響，通過急性毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)茯苓三七水提取物復(fù)合物的安全性，通過大鼠的自主活動(dòng)證明了茯苓水提物、三七水提物及茯苓三七復(fù)合物均在一定程度上起到改善睡眠的作用。

本實(shí)驗(yàn)中茯苓水提取物、三七水提取物及其提取物復(fù)合物各組均可以顯著提高失眠大鼠下丘腦中血清中5-HT和GABA含量，進(jìn)一步通過測定小鼠下丘腦和血清中5-HT和GABA含量，推測三七水提物主要從5-HT這一神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)小鼠的睡眠進(jìn)行調(diào)節(jié)，而茯苓則同時(shí)從5-HT和GABA 2個(gè)通路進(jìn)行睡眠調(diào)節(jié)，故茯苓三七復(fù)合物聯(lián)合使用有協(xié)同增效作用，加強(qiáng)了改善睡眠的功能，對(duì)是否參與促進(jìn)腸道菌群趨于正常化的研究后續(xù)將進(jìn)行探討。茯苓三七復(fù)合物的高劑量組［90 mg/（kg·bw）］、中劑量組［45 mg/（kg·bw）］顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間、增加催眠試驗(yàn)入睡率和減少睡眠潛伏時(shí)間，且無直接睡眠作用。根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》（2022年版）改善睡眠功能評(píng)價(jià)方法，茯苓三七復(fù)合物具有改善睡眠的作用，且急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，茯苓三七復(fù)合物屬于無毒級(jí)，說明產(chǎn)品安全性高。綜上所述，茯苓三七復(fù)合物可以成為改善睡眠保健食品開發(fā)的一個(gè)方向，但其改善睡眠的詳細(xì)機(jī)制和是否促進(jìn)腸道菌群正?；€需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：無。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22108229）作者簡介：閆俊苗（1998.05—），女，碩士研究生，研究方向：天然活性物質(zhì)功能分析，E-mail：1594059235@qq.com通信作者：王盼（1989.07—），女，博士，講師，研究方向：天然活性物質(zhì)分析，E-mail：panwanghgxy@nwu.edu.cn