馮曉麗 陳薪旭 鄭曉晗

摘要：目的 明確巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在胚胎干細(xì)胞上的相互作用受體，闡明MIF維持胚胎干細(xì)胞增殖存活的作用機(jī)制。方法：培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀、免疫熒光共聚焦顯微鏡、Western blot等檢測(cè)方法檢測(cè)HESCs相關(guān)受體CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7 表達(dá)情況，同時(shí)在胚胎干細(xì)胞中加入MIF、ISO后，CCK-8 法檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞活性。結(jié)果 流式細(xì)胞儀、免疫熒光共聚焦顯微鏡、Western blot等檢測(cè)方法表明，人胚胎干細(xì)胞中的相關(guān)因子均有表達(dá)，其中CXCR2、CXCR7和MIF的表達(dá)水平較高，而CD74、CD44、CXCR4表達(dá)水平較低，但比較并無(wú)顯著差異，P＞0.05。在胚胎干細(xì)胞中加入MIF、ISO后，CCK-8 法檢測(cè)顯示，與空白組相比，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度值和細(xì)胞活性均明顯下降，P＜0.05；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值和細(xì)胞活性明顯更低，P＜0.05。結(jié)論 MIF在人胚胎干細(xì)胞中可能通過(guò)與CXCR2、CXCR7、CD74、CD44、CXCR4等相關(guān)因子結(jié)合調(diào)控人胚胎干細(xì)胞的增殖活性。

關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞遷移抑制因子；人胚胎干細(xì)胞；增殖；細(xì)胞活性

目前研究發(fā)現(xiàn)，人胚胎干細(xì)胞（hESCs）可分泌表達(dá)MIF，并在維持hESCs增殖存活方面具有重要作用[1～2]。MIF促進(jìn)hESCs增殖存活的相關(guān)功能機(jī)制仍不完全明確，相關(guān)研究認(rèn)為MIF可能是通過(guò)結(jié)合CXCR2和CXCR7相關(guān)受體，進(jìn)而激活下游PI3-Akt信號(hào)通路來(lái)維持ESCs的增殖和存活[3～4]。為此，本研究擬通過(guò)添加不同濃度梯度的MIF、MIF抑制劑ISO觀察ESCs的增殖存活狀況，檢測(cè)ESCs 中MIF的自分泌情況、相關(guān)受體表達(dá)，以及不同條件下細(xì)胞增殖情況，闡明MIF維持ESCs增殖存活的相關(guān)機(jī)制。

1資料與方法

1.1 臨床資料

檢驗(yàn)方法：包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、CCK-8法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞儀分析、蛋白質(zhì)印跡法、免疫共沉淀等方法。

細(xì)胞培養(yǎng)：胚胎干細(xì)胞（H9）在添加 mTeSRTM1培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。貼壁細(xì)胞消化，收集細(xì)胞懸液，離心收取細(xì)胞上清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2 方法

（1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9細(xì)胞CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7表達(dá)情況：將六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的H9細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。取100 ?L細(xì)胞懸液至離心管中，并分別在管中加入5 ?LPE標(biāo)記的CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7對(duì)應(yīng)抗體，4 ℃反應(yīng)30 min；加入2 mL PBS離心去上清，重復(fù)2次；再加入500 ?LPBS，通過(guò)流式細(xì)胞儀器進(jìn)行檢測(cè)。

（2）免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)H9細(xì)胞MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7表達(dá)情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9細(xì)胞。長(zhǎng)滿后，加入750 ?L/9.6 cm2的Accutase進(jìn)行消化；接種于細(xì)胞玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁，用 4%的多聚甲醛室溫下固定20 min；用 PBS清洗3次后，同時(shí)用10%驢血清（Biorad）和 0.1%Triton X-100（Sigma）的PBS在室溫下封閉和滲透30 min。孵育一抗4 ℃過(guò)夜。用PBS洗3次，每次5 min。避光孵育二抗1 h后，再用PBS洗3次，每次5 min。檢測(cè)MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7表達(dá)情況。本階段所用試劑如下。

一抗：鼠抗人MIF（1：100）； 兔抗人CD74（1：200）；兔抗人CD44（1：100）；兔抗人CXCR2（1：200）；兔抗人CXCR4（1：200）；兔抗人CXCR7（1：200）二抗：山羊抗鼠（1：500）， 山羊抗兔（1：500）；樣品用抗褪色熒光固定介質(zhì)（Dako）固定。使用蔡司 LSM 510 共焦激光掃描顯微鏡（Carl-Zeiss 顯微成像）獲取圖像。

（3）Western blot檢測(cè)H9細(xì)胞MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7表達(dá)情況：胚胎干細(xì)胞（H9）在添加 mTeSR?1培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。長(zhǎng)滿后，加入750 ?L/9.6 cm2的Accutase進(jìn)行消化；細(xì)胞懸液離心，收集細(xì)胞沉淀；加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞，離心提取總蛋白；BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加樣后采用80 V 30 min，120 V 60min程序進(jìn)行電泳，再通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜用封閉液室溫孵育2 h。再將PVDF膜與特異性一抗在4 ℃下過(guò)夜孵育，TBST洗5次。PVDF膜置于特異性二抗中室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗5次，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行蛋白曝光。

（4）加入MIF、CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9細(xì)胞。長(zhǎng)滿后，加入750 ?L/9.6 cm2的Accutase進(jìn)行消化， 接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，共分3組，分別為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入包被培養(yǎng)器皿的BD MatrigelTM 和500 ?LmTeSRTM1培養(yǎng)基，對(duì)照組加入包被培養(yǎng)器皿的BD MatrigelTM 和100 ?LmTeSRTM1培養(yǎng)基以及實(shí)驗(yàn)組等量細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入包被培養(yǎng)器皿的BD MatrigelTM和100 ?LmTeSRTM1培養(yǎng)基以及適量細(xì)胞。再分梯度濃度加入hMIF，各組在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h每孔細(xì)胞加入10 ?L CCK-8溶液，共孵1～4 h后在酶標(biāo)儀450 nm處讀取每孔細(xì)胞的吸光度值，測(cè)定細(xì)胞活力。

（5）加入ISO、CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性：操作步驟同（4）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS27.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示。所有數(shù)據(jù)均采用 GraphPad Prism軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用 Bonferroni 事后檢驗(yàn)的單因素方差分析。P＜0.05為差異性顯著。

2結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法下人胚胎干細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)水平

流式細(xì)胞儀、免疫熒光共聚焦顯微鏡、Western blot等檢測(cè)方法表明，人胚胎干細(xì)胞中的相關(guān)因子均有表達(dá)，其中CXCR2、CXCR7和MIF的表達(dá)水平較高，而CD74、CD44、CXCR4表達(dá)水平較低，但比較并無(wú)顯著差異，P＞0.05。見表1。

2.2 胚胎干細(xì)胞活性檢測(cè)

在胚胎干細(xì)胞中加入MIF、ISO后，CCK-8 法檢測(cè)顯示，與空白組相比，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度值和細(xì)胞活性均明顯下降，P＜0.05；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組吸光度值和細(xì)胞活性明顯更低，P＜0.05。見表2～3。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀、免疫熒光共聚焦顯微鏡、Western blot等檢測(cè)方法表明，人胚胎干細(xì)胞中的相關(guān)因子均有表達(dá)，其中CXCR2、CXCR7和MIF的表達(dá)水平較高，而CD74、CD44、CXCR4表達(dá)水平較低，但比較并無(wú)顯著差異，P＞0.05。這些因子可與MIF結(jié)合，其中CD74在MIF受體復(fù)合物中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)镃D74敲除或應(yīng)用抗CD74抗體可消除表達(dá)CD44、CXCR2、CXCR4或CXCR7的細(xì)胞中的MIF效應(yīng)[5]。但有研究表明，MIF可通過(guò)CXCR7激活PI3K-AKT信號(hào)通路。這說(shuō)明CD74在介導(dǎo)MIF信號(hào)中的作用中并非完全不可或缺。CD74不能單獨(dú)介導(dǎo)MIF信號(hào)，但是可以協(xié)助增強(qiáng)CD44、CXCR2或CXCR4的表達(dá)效應(yīng)[6]。因此，CD74在MIF信號(hào)中起著中樞作用，可以引導(dǎo)組織受體并幫助形成受體復(fù)合物。MIF可以直接結(jié)合CXCR2和CXCR7受體觸發(fā)相關(guān)效應(yīng)。MIF首先與CXCR2結(jié)合，通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)激活ERK1/2和AKT信號(hào)通路。CXCR7不與任何類型的G蛋白偶聯(lián)，而是與β-arrestin2結(jié)合進(jìn)而激活ERK1/2信號(hào)通路，但也有研究顯示可以同樣激活A(yù)KT信號(hào)通路[7～8]。此外，MIF 最重要的作用之一是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的能力。ISO-1經(jīng)常作為MIF的標(biāo)準(zhǔn)抑制劑，可抑制MIF的互變異構(gòu)酶活性，也可阻止 MIF 與其表面受體的結(jié)合，從而阻斷MIF誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)[9～10]。本研究在胚胎干細(xì)胞中加入MIF、ISO后，CCK-8法檢測(cè)顯示，與空白組相比，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度值和細(xì)胞活性均明顯下降，P＜0.05；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值和細(xì)胞活性明顯更低，P＜0.05。表明抑制 MIF 將會(huì)顯著抑制細(xì)胞的增殖活性。

綜上所述，CXCR2、CXCR7、CD74、CD44、CXCR4等MIF相關(guān)受體在人胚胎干細(xì)胞中均有所表達(dá)，表明巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在調(diào)控人胚胎干細(xì)胞增殖中具有重要作用。

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