梁旺利 于雯靜 胡進紅 宋繁 王玲霞 梁文裕

摘 要 為解析寧夏枸杞響應(yīng)NaCl脅迫的ABA代謝分子調(diào)控機制，檢測NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片脫落酸（ABA）含量變化，并利用RNA-seq和qRT-PCR技術(shù)研究NaCl脅迫下ABA代謝相關(guān)基因的差異表達規(guī)律。結(jié)果表明，不同濃度NaCl脅迫下，寧夏枸杞葉片中ABA含量隨NaCl濃度的增加呈現(xiàn)增加趨勢；通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選得到21個ABA代謝相關(guān)的差異表達基因，從100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl處理下的寧夏枸杞葉片中檢測到ABA代謝相關(guān)的差異表達基因分別有17、11、9個，qRT-PCR檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。寧夏枸杞通過相關(guān)基因的差異表達調(diào)控ABA代謝和信號通路，從而參與調(diào)控其響應(yīng)NaCl脅迫。

關(guān)鍵詞 寧夏枸杞；NaCl脅迫；ABA；代謝；差異基因表達

土地鹽堿化是全球面臨的日益嚴重的環(huán)境問題。鹽脅迫引起土壤鹽漬化和離子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致植物代謝紊亂、營養(yǎng)缺乏和氧化損傷等，對光合作用、呼吸作用和能量代謝等一系列生理過程產(chǎn)生抑制作用[1]。植物內(nèi)源激素是植物自身合成并對其生長發(fā)育起重要調(diào)控作用的物質(zhì)，激素水平是調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫的重要因素，如脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）可正調(diào)控苦豆子對鹽脅迫的反應(yīng)，而乙烯（ETH）和茉莉酸（JA）可負調(diào)控苦豆子響應(yīng)鹽脅迫[2]。ABA作為植物逆境響應(yīng)的核心激素，其代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年來研究的熱點[3-4]，尤其對ABA調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫的分子機制有了一定的認識，如植物遭遇到鹽脅迫時ABA迅速合成，先后與PYR/PYL和PP2C相結(jié)合而增強SnRK2活性，激活下游ABA應(yīng)答基因，同時分解代謝途徑使ABA含量達到動態(tài)平衡[5]；ABA生物合成關(guān)鍵基因NCED2和NCED6的表達量在鹽脅迫下強烈增加，影響了番茄的抗鹽能力[6]；PYR/PYL/RCAR基因和SnRK2基因上調(diào)表達、PP2C基因下調(diào)表達共同增強了結(jié)縷草的耐鹽能力[7]；富士蘋果栽培的早期階段 CYP707A1和 CYP707A2表達減少有助于弱化ABA分解代謝而防御鹽脅迫[8]。雖然ABA可調(diào)控植物耐鹽性已被人們熟知，但木本灌木在鹽脅迫下基因差異表達調(diào)控ABA代謝的分子機制還有許多未知之處。

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞屬多年生落葉灌木，具有耐鹽堿、耐瘠薄的特點和極高的經(jīng)濟及藥用價值。目前寧夏枸杞激素相關(guān)研究主要集中在果實內(nèi)源激素與果實發(fā)育[9]、外源激素對枸杞生長和繁殖的影響[10]、激素處理對寧夏枸杞扦插生根效果評價[11]等方面，而關(guān)于鹽脅迫下寧夏枸杞基因差異表達調(diào)控ABA代謝的分子機制方面缺少相應(yīng)的研究報道。因此，本研究對NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量的變化進行檢測，采用RNA-seq技術(shù)對ABA代謝相關(guān)差異表達基因進行篩選，并通過qRT-PCR技術(shù)驗證了關(guān)鍵基因差異表達情況，進而解析鹽脅迫下寧夏枸杞ABA代謝相關(guān)基因差異表達規(guī)律，為深入認識寧夏枸杞耐鹽堿的激素代謝分子機理奠定基礎(chǔ)，為寧夏枸杞耐鹽新品種的培育提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

寧夏枸杞‘寧杞1號由寧夏農(nóng)林科學院枸杞工程技術(shù)研究所惠贈。寧夏枸杞幼苗培養(yǎng)及處理在人工溫室[溫度（25±2） ℃、濕度42%、光周期16 h/8 h、光照強度60 μmol/（m 2·s）]內(nèi)完成。幼苗在草木灰、珍珠巖與蛭石1∶1∶1（體積比）混合后的基質(zhì)中，加入Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)1個月后，除去基質(zhì)進行水培至8～12葉期，選擇健康且長勢一致的幼苗進行NaCl（分析純，購自天津市永大化學試劑有限公司）脅迫處理。脅迫處理設(shè)定0 mmol/L NaCl（A）、100 mmol/L NaCl（B）、200 mmol/L NaCl（C）、300 mmol/L NaCl（D）4個濃度，處理7 d后選取植株同一部位葉片取樣，-80 ℃保存，備用。每組處理3次生物學重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量測定 ABA的提取參考Fu等[12]的方法并加以改進。稱取0.2 g寧夏枸杞葉片于液氮中研磨至干粉狀，加入1 mL 90%甲醇（色譜純，購自天根生化科技有限公司），4 ℃ 12 h后10 000 r/min離心5 min，上清液倒入MCX-WAX串聯(lián)柱，用1.2 mL 90%甲醇洗提后分離MCX-WAX 串聯(lián)柱，WAX柱先用2 mL 5%富里酸淋洗，再用1.5 mL甲醇洗脫，氮氣吹干洗脫液，用100 μL 40%甲醇溶液復(fù)溶（所有步驟于4 ℃進行）。

ABA含量使用Agilent 1290高效液相色譜儀串聯(lián)AB Sciex QTRAP 6500+質(zhì)譜儀測定。液相條件：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相：? 甲∶乙=（0.1%甲酸甲醇）∶（0.1%甲酸水）；柱溫40 ℃；洗脫梯度：0～1 min，甲=20%；1～3 min，甲遞增至50%；3～9 min，甲遞增至90%；? 9～10.5 min，甲=90%；10.5～10.6 min，甲遞減至20%；10.6～13.5 min，甲=20%；進樣量? 2 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源 ESI；霧化溫度：500 ℃；氣簾氣（CUR）：35 psi；噴霧電壓（IS）：? 4 500 V；霧化氣壓力（Gas1）：60 psi；輔助氣壓力（Gas2）：60 psi；監(jiān)測模式：MRM。ABA標準品選用Sigma公司產(chǎn)品。每個處理進行3個生物學重復(fù)測定。

1.2.2 RNA提取、文庫構(gòu)建及測序 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）提取NaCl脅迫處理的寧夏枸杞葉片總RNA，樣品總RNA質(zhì)量檢測合格后，構(gòu)建cDNA測序文庫，對文庫插入片段長度和有效濃度進行檢測。使用高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對文庫進行測序獲得原始數(shù)據(jù)，對raw reads進行過濾處理得到clean reads。采用Trinity軟件對clean reads進行拼接以獲取后續(xù)分析參考序列。

1.2.3 基因功能注釋及差異基因篩選 將Unigene序列與Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得基因功能注釋。采用DESeq 2進行基因的差異表達分析，以P<0.05且|log2（Fold Change）|>1為差異顯著性標準，篩選ABA代謝相關(guān)的差異表達基因（DEG）。

1.2.4 ABA相關(guān)基因的qRT-PCR分析 對轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)進行分析，挑選ABA代謝關(guān)鍵基因進行qRT-PCR分析（試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司）。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計目的基因擴增引物（表1）。PCR擴增條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共41個循環(huán)，每個反應(yīng)3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[13-14]計算相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26、Origin 2018和Excel等軟件進行數(shù)據(jù)處理、方差分析與圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA含量變化

寧夏枸杞葉片中ABA含量隨著NaCl脅迫濃度的增加呈增加趨勢。ABA含量在NaCl脅迫濃度為0 mmol/L時與200 mmol/L、300 mmol/L處理組相比呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05），與100 mmol/L處理組相比無顯著性差異（P>0.05）（圖1）。

2.2 NaCl脅迫下寧夏枸杞ABA代謝相關(guān)基因的差異表達

對NaCl脅迫下寧夏枸杞所有差異表達基因進行KEGG pathway顯著性富集分析，篩選21個富集到ABA代謝途徑的差異表達基因（P

2.3 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片ABA代謝相關(guān)差異基因的qRT-PCR分析

挑選與NaCl脅迫下寧夏枸杞ABA代謝密切相關(guān)的黃質(zhì)醛脫氫酶2（ ABA2）、醛氧化酶4（ ?AAO4）、脫落酸8′-羥化酶（ CYP707A）、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶3（ ?NCED3 ）、脫落酸受體4（ PYL4）、SNF1相關(guān)蛋白激酶2A? （ SnRK2A）、蛋白磷酸酯酶2C 5（ PP2C5）、轉(zhuǎn)錄因子MYB1R1（ MYB1R1）等基因進行qRT-PCR表達驗證分析。結(jié)果顯示：隨著NaCl濃度的增加，寧夏枸杞葉片中 ABA2的表達量呈上升趨勢， ?AAO4的表達量呈先上升后下降的趨勢， CYP707A和 ?NCED3 的表達量呈先上升后下降再上升的趨勢， PP2C5和 MYB1R1的表達量呈下降趨勢， PYL4和 SnRK2A 的表達量呈先下降后上升再下降的趨勢（圖4）。qRT-PCR的驗證結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果基本吻合。

3 討? 論

植物激素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和應(yīng)對各種脅迫耐受性或敏感性的內(nèi)源分子，可通過誘導(dǎo)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，激活自身免疫系統(tǒng)以應(yīng)對生物或非生物脅迫。ABA作為植物中最重要的應(yīng)激反應(yīng)激素之一，在植物調(diào)控生物與非生物應(yīng)激反應(yīng)以及在植物不同生長和發(fā)育進程中發(fā)揮重要? 作用。

ABA的生物合成是植物應(yīng)對非生物脅迫最快的反應(yīng)之一。真核生物ABA的早期生物合成主要為甲基赤蘚糖磷酸（MEP）途徑合成類胡蘿卜素，繼而促進ABA生物合成。類胡蘿卜素氧化衍生物玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)是ABA合成過程中重要前體物質(zhì)，二者可在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（ZEP）與紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶（VDE）的作用下相互轉(zhuǎn)化。紫黃質(zhì)可異構(gòu)化為9-順式-紫黃質(zhì)和9-順式-新黃質(zhì)，在9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的作用下生成黃質(zhì)醛；黃質(zhì)醛經(jīng)黃質(zhì)醛脫氫酶2（ABA2）作用產(chǎn)生脫落醛，最終經(jīng)ABA醛氧化酶（AAO）催化生成ABA。ABA生物合成相關(guān)基因之間互相影響，共同調(diào)控著植物響應(yīng)鹽脅迫。Wang等[15]研究表明葉綠體中類脂蛋白基因OsVDE可負調(diào)控水稻幼苗 ?OsNECD2/4/5的表達及ABA的生物合成和耐鹽性。NCED是ABA合成中的關(guān)鍵限速酶，也是關(guān)鍵調(diào)控酶，過表達At ?NCED3 基因可明顯提高內(nèi)源ABA水平，同時上調(diào)ABA合成酶基因ZEP、 ?AAO3等的表達水平[16]；而利用CRISPR/Cas9敲除 OsNCED5后，水稻的耐鹽性顯著降低[17]。而且PEG6000脅迫煙草試驗也發(fā)現(xiàn)了干旱脅迫誘導(dǎo) ?NCED3 基因上調(diào)表達以及內(nèi)源ABA的積累[18]。此外，絨毛白蠟體內(nèi) ?FvNCED3 基因在脫水、鹽脅迫和外源ABA的作用下的表達量升高，且 ?FvNCED3 可以通過響應(yīng)外界刺激增強植物下游基因的表達和抗逆性[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)， ABA2可以正反饋調(diào)節(jié)ABA的積累，例如水稻中ABA2利用NAD做輔因子，催化黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)化為脫落醛，在ABA生物合成過程中發(fā)揮重要作用[20]。而且外源ABA也能上調(diào)擬南芥中ZEP、AAO3和MCSU基因表達水平[21-22]。轉(zhuǎn)基因水稻相較于野生型與非轉(zhuǎn)基因水稻中的AAO基因顯著上調(diào)表達，且具有較高的耐鹽性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞葉片中 VDE1基因在300?? mmol/L NaCl處理下顯著下調(diào)表達，表明玉米黃質(zhì)向紫黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化可能促進了ABA的生物合成。 ?NCED3 在100 mmol/L NaCl處理下顯著上調(diào)，而在300?? mmol/L NaCl處理下變化不顯著； ABA2在300?? mmol/L NaCl處理下顯著上調(diào)； ?AAO4在100、200? mmol/L NaCl處理下顯著上調(diào)，而在300 mmol/L NaCl處理下變化不顯著，推測200 mmol/L、300 mmol/L NaCl處理下寧夏枸杞中ABA含量升高的原因可能與以上基因的表達有關(guān)，提示了寧夏枸杞在NaCl脅迫下通過誘導(dǎo)ABA合成關(guān)鍵基因差異表達進而增加ABA含量，以此參與應(yīng)對鹽脅迫環(huán)境。

現(xiàn)有研究認為ABA響應(yīng)鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有依賴ABA和不依賴ABA途徑[24]。不依賴ABA途徑中，植物將識別到的鹽脅迫信號以Ca2+和干旱應(yīng)答元件為中心進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生相應(yīng)的生理生化反應(yīng)以緩解鹽害帶來的負面影響[25]。依賴ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要以PYR/PYL/RCAR-PP2C-SnRK2復(fù)合物作為主要框架，通過ABA受體PYR/PYL/RCAR、A類蛋白磷酸酶PP2C及第Ⅲ亞類SNF1相關(guān)蛋白激酶2（SnRK2s）及下游響應(yīng)因子發(fā)揮作用[26]。在鹽脅迫下，植物內(nèi)源ABA水平迅速升高被ABA受體PYL/PYR感知，后與蛋白磷酸酶PP2C結(jié)合，減少PP2C對SnRK2的抑制，從而激活SnRK2的表達，啟動下游ABA反應(yīng)元件（ABRE）結(jié)合蛋白（AREBs）/ABRE結(jié)合因子ABFs，引起氣孔關(guān)閉、種子休眠[2，27]。PP2C與PYR/PYL/RCAR受體的選擇性相互作用取決于組織中現(xiàn)存ABA的含量，擬南芥中已鑒定的14個PYL受體，在ABA存在的情況下，只有 PYL1、 PYL3、 PYL6、 PYL8、 PYL9、 PYL10、 PYL11受體與植物激素分子結(jié)合后，使 ?PP2C失活啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的正調(diào)控因子[28]。在鹽脅迫和滲透脅迫下，ABA信號增強激活 ?SnRK2，引起下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而提高植物抗逆性[29]。擬南芥 ?ABF4基因參與了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且在馬鈴薯中的表達增強了其耐鹽和耐旱性[30]。本研究發(fā)現(xiàn) ?PLY4基因在200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著增加； ?PP2C5基因在100 mmol/L和200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著減少； ?SnRK2A基因在200 mmol/L NaCl處理下表達量顯著增加（表2，圖4），說明 ?PP2C5與ABA受體結(jié)合后 ?SnRK2A被釋放發(fā)揮作用，這暗示了NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。另外， ?ABF2、 ?ABF3、 ?ABF4基因均在100 mmol/L NaCl脅迫下表達顯著上調(diào)，在200 mmol/L處理下變化不顯著，可能意味著ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游響應(yīng)因子被啟動進而對鹽脅迫信號做出了反應(yīng)。此外，植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一MYB也可以參與ABA信號傳導(dǎo)通路及調(diào)節(jié)植物耐鹽性[31-32]。 ?AtMYB20可通過抑制擬南芥中 ?PP2C的表達來增強抗鹽性[33]，而玉米可通過增強 ?ZmMYB3R的表達調(diào)節(jié)氣孔開度賦予玉米耐鹽性[34]，另外過表達 ?GmMYB3a可負調(diào)控大豆耐鹽性[35]。本研究發(fā)現(xiàn) ?MYB1R1在鹽脅迫下表達量顯著下降，而 MYB44在鹽脅迫下表達量顯著增加，推測寧夏枸杞在響應(yīng)鹽脅迫過程中不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能具有不同的調(diào)控ABA代謝作用，其具體機制還有待于進一步研究。因此，寧夏枸杞在NaCl脅迫下可能通過激活A(yù)BA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)調(diào)控基因，進而參與應(yīng)答寧夏枸杞對鹽脅迫的? 響應(yīng)。

為有效調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ABA水平以響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，除加強ABA生物合成途徑外，抑制ABA代謝也是增強植物ABA水平的一個有價值且非常重要的舉措[36]。ABA的分解代謝主要包括與葡萄糖結(jié)合和羥基化作用。當植物體內(nèi)ABA含量過高時，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）催化其與葡萄糖反應(yīng)生成脫落酸葡萄糖酯（ABA-GE）；當植物體內(nèi)ABA過低時，ABA-GE又可將ABA釋放出來[37]。羥基化作用中，ABA分解代謝通過氧化失活方式產(chǎn)生紅花菜豆酸（PA），其關(guān)鍵限速酶是脫落酸8′-羥化酶[38]。Liu等[39]通過RNAi對水稻 ?OsABA8ox1（ ?CYP707A5）基因進行抑制，提高了水稻植株內(nèi)源ABA水平，顯著提高了水稻對堿脅迫的耐受性。在對水稻冷脅迫研究[40]中發(fā)現(xiàn)過表達 ?OsABA8ox1的轉(zhuǎn)基因水稻品系A(chǔ)BA含量降低，同時其對干旱和寒冷耐受性降低，這意味著隨著 ?OsABA8ox1表達的升高，ABA水平受到負反饋調(diào)控。另有研究表明， ?CYP707A基因的轉(zhuǎn)錄本可增加植物對鹽、滲透、脫水壓力以及ABA的響應(yīng)[41]。本研究發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞葉片在100 mmol/L NaCl脅迫下 ?CYP707A基因顯著上調(diào)表達，可能加速了ABA降解使得ABA含量下降，而200 mmol/L NaCl脅迫下 ?CYP707A基因表達量顯著下調(diào)，減緩了ABA羥基化分解代謝。因此，寧夏枸杞在NaCl脅迫過程中可能通過抑制其降解相關(guān)基因表達，從而提高植物體內(nèi)ABA的含量，達到對鹽脅迫防御的調(diào)控作用。

綜上所述，寧夏枸杞通過相關(guān)基因的差異表達調(diào)控ABA代謝和信號通路，從而調(diào)控其響應(yīng)NaCl脅迫。研究結(jié)果為深入解析寧夏枸杞耐鹽的ABA代謝調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理奠定了基礎(chǔ)，并為寧夏枸杞耐鹽新品種的培育提供了理論和試驗依據(jù)。

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Differential Expression of? ABA Metabolism-Related Genes in Lycium barbarum under NaCl Stress

Abstract To analyze the molecular regulation mechanism of ABA metabolism of Lycium barbarum in response to NaCl-induced stress，we detected ABA contents of L.barbarum leaves under NaCl stress，and used RNA-seq and qRT-PCR techniques to analyze the differential expression of ABA metabolism related genes.The results showed that ABA content in leaves of L.barbarum increased by NaCl stress.21 ABA metabolism-related genes were differentially expressed in L.barbarum，and 17，11 and 9 ABA metabolism-related genes were differentially expressed in 100 mmol/L，200 mmol/L and 300 mmol/L NaCl，respectively.Meanwhile，the results of qRT-PCR were consistent with the results of transcriptome sequencing.L.barbarum responded to NaCl stress through regulating ABA metabolism and signal pathway by differential expression of related genes.

Key words Lycium barbarum; NaCl stress; ABA; Metabolism; Differential expression of genes