雷航 王學鋒 程曉文 張慧 蔡曉紅

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院 輸血科，上海 200025；2.復旦大學附屬閔行醫(yī)院 輸血科)

ABO 血型系統(tǒng)由血型之父Karl Landsteiner 于1900 年發(fā)現(xiàn)，在臨床輸血、器官移植、新生兒溶血病的診斷和篩查中發(fā)揮著重要作用[1-3]。 ABO 亞型是1 種具有以下血清學特征的遺傳性ABO 表型:紅細胞上抗原的強度減弱、消失、出現(xiàn)混合視野，血清中伴有不規(guī)則抗-A 或抗-B 出現(xiàn)[4-5]。 而類孟買血型因H 抗原的缺失，影響A、B 抗原的合成，進而影響著ABO 血型的準確鑒定[6-7]。

ABO 亞型與類孟買血型是導致ABO 血型變異的重要原因，臨床上均可以導致ABO 血型定型困難、血型誤判、甚至急性溶血性輸血反應的發(fā)生[8-9]。 ABO 亞型與類孟買血型復雜的血清學表現(xiàn)，我們僅依靠常規(guī)血清學實驗已無法滿足臨床安全供血和器官移植等精準醫(yī)學發(fā)展需求，隨著近年來分子生物學的發(fā)展，基因分析逐漸成為ABO 亞型和類孟買血型鑒定的重要組成部分[10-13]，但也有相關文獻報道:1 種亞型表型可對應多種基因型，如B(A)血型有6 種等位基因(BA.01—BA.06)[14]；同1 種基因型也可對應多種表現(xiàn)型，如等位基因BW.12 血清學上可以出現(xiàn):Bx、Bm、ABx、ABm、AB3等多種表型[3]；甚至同1 個基因位點突變也可以產(chǎn)生不同的表型，如c.425T＞C 發(fā)生在等位基因B.01 上突變可產(chǎn)生混合視野B3表型[15]，而c.425T＞C 若發(fā)生在等位基因A1.02 基礎上的突變則會產(chǎn)生Ael表型[16]。 這提示我們在遇到ABO 血型變異時，需要將傳統(tǒng)經(jīng)典的血清學方法同現(xiàn)代的基因檢測方法結合起來，方能提高對血型變異的鑒定準確率。 我們對在臨床工作中遇到的ABO 血型變異標本進行了表型與基因型的關聯(lián)性分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

納入標準:1)2022 年2 月至2022 年12 月上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院(以下簡稱瑞金醫(yī)院)門急診/住院部2.42 萬名血型鑒定患者(重復檢測的患者只計入首次)；2)2022 年9 月外院送檢瑞金醫(yī)院的ABO 疑難血型鑒定標本10 例，其中疑似ABO 亞型3 例，疑似類孟買血型7 例。 以上標本類型均為EDTA 抗凝外周靜脈全血。

排除標準:1)新生兒血型標本；2)血液科疾病患者標本；3)近2 月內有ABO 非同型輸注史的患者標本。 研究對照:隨機選取120 名ABO 血型正常的外科患者的標本。

1.2 試劑與儀器

單克隆抗-A(批號:20220102)、抗-B(批號:20220102)、抗-A1(批號:20211128)、抗-H 血清(批號:20211110)，人ABO 血型反定型紅細胞試劑(批號:20225303)， 不規(guī)則抗體篩查細胞(批號:20227004)，均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；人源多克隆抗-A、抗-B 來自本課題組自制，效價128；抗-Lea(批號:8000451442)、抗-Leb血清(批號:8000262294)均為荷蘭Sanquin 公司產(chǎn)品；血液基因組DNA 抽提試劑盒(批號:X0615)、DNA 瓊脂糖凝膠純化試劑盒(批號:X1014)均為北京天根生物； Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye ( 批 號:ALE2528A)、pMD18-T 克隆載體(批號:AL51603A)均為日本TAKARA 公司產(chǎn)品。 全自動血型儀(Ortho AutoVue，強生)；KUBOTA 離心機(KA-2200，久保田)；瞬時離心機(5424R，Eppendorf)；DNA 擴增安全柜(SCV 4A1，Airtech)； PCR 擴增儀(Proflex3，ABI)；基因測序儀(3730xl，ABI)。

1.3 方法

1.3.1血型血清學檢測

采用全自動血型分析儀對患者的ABO 血型及不規(guī)則抗體篩查進行檢測，對初篩中顯示ABO 正反定型不符的疑為ABO 亞型標本和外地送來已初篩過疑似ABO 亞型和類孟買血型的標本按如下方法進行ABO 亞型和類孟買血型的確認試驗:弱ABO(H)抗原或抗體檢測法、增強法、吸收放散試驗，根據(jù)血型血清學國際標準方法AABB[17]對ABO 亞型、類孟買血型進行鑒定。 由于未獲取到患者的唾液標本，故我們使用Lewis 血型鑒定方法來間接地對個體的分泌狀況進行判斷。 亞型分類判斷按文獻[4]判斷。

1.3.2基因組DNA 抽提與PCR 擴增

血清學鑒定為ABO 亞型、類孟買血型的患者標本，進行外周血基因組DNA 抽提，對ABO基因的7 個外顯子(E1—E7)及其側翼序列、增強子、啟動子進行PCR 擴增，類孟買血型則對FUT1、FUT2基因序列進行擴增。ABO、FUT1、FUT2 基因突變篩查的擴增引物序列及擴增條件按參考文獻[3，18]進行。

1.3.3PCR 產(chǎn)物純化、測序和克隆

采用DNA 瓊脂糖凝膠純化試劑盒對PCR 產(chǎn)物進行純化后測序，單倍體鑒定時，將ABO基因E6、E7、Intron6 的PCR 產(chǎn)物或FUT1 基因擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體做TA 克隆，挑取多個陽性菌落，抽提質粒DNA 進行測序鑒定，確定標本的單體型[19]。

1.3.4ABO基因、FUT1 和FUT2 基因新突變與等位基因的命名方式

對測序結果分析到的含有基因突變的序列，進行再一次的PCR 擴增和測序確認，以排除PCR 擴增引入基因突變的可能性。 根據(jù)國際輸血協(xié)會(ISBT)命名方式對新突變及ABO、FUT1 和FUT2等位基因進行命名。

2 結果

2.1 ABO 亞型的表型檢測

2022 年2—12 月，瑞金醫(yī)院門急診/住院部2.42萬血型鑒定患者中，檢出7 例ABO 亞型(編號1—7)。 外院送檢瑞金醫(yī)院的ABO 疑難血型鑒定10 例標本中，共鑒定出2 例ABO 亞型:編號Ⅰ-1、Ⅱ-1(第3 例鑒定為正常A 型，故未納入亞型統(tǒng)計結果內)。 一共檢出的9 例ABO 亞型中含Ael亞型2 例、B3亞型3 例、B(A)亞型1 例、Bweak亞型2 例、A2Bweak亞型1 例。 其中B 亞型6 例，占比67%(6/9)，A 亞型2 例，占比22%(2/9)，血清學鑒定結果如表1。

表1 9 例ABO 亞型血清學鑒定結果Table 1 Results of serological identification of ABO subgroup in 9 cases

2.2 ABO 亞型的基因型檢測

9 例ABO 亞型標本，經(jīng)DNA 直接測序、克隆后測序共鑒定出7 種罕見等位基因，9 例ABO 亞型的表型及其對應基因型分別為:1 例Ael(AEL.02/O.01.02)、1 例AeB(AEL.05/B.01)、3 例B3(2 例B3.03/O.01.01、1 例B3.03/O.01.02)、1 例B(A)(BA.02/O.01.01)、1 例ABweak(A1.02/BW.07)、1 例Bweak(BW.31/O.01.02)、1 例A2Bweak(A2.05/BW.31)，見表2。

表2 9 例ABO 亞型基因型鑒定結果Table 2 Results of genotype identification of ABO subgroup in 9 cases

2.3 7 例類孟買血型鑒定

來自外院送檢瑞金醫(yī)院ABO 疑難血型鑒定10例標本中，共鑒定出7 例類孟買血型，血清學結果及測序結果見表3，其中7 名患者紅細胞上均未檢出A、B、H 抗原，僅通過吸收放散試驗檢出紅細胞上極微弱的A、B 抗原；Lewis 血型鑒定1 例為Lewis(a-b-)，余6 例均為Lewis(a-b＋)，間接證明以上均為分泌型；7 名患者血清中均檢出抗-H。FUT1 的2 個主要突變位點c.547delAG (FUT1*01N.06)、c.880delTT(FUT1*01N.13)的測序結果如圖1。

圖1 FUT1 基因部分測序結果Figure 1 Results of FUT1 gene sequencing

表3 7 例類孟買血型鑒定結果Table 3 Results of para-Bombay blood group identification in 7 cases

3 討論

ABO 血型抗原表達受控于ABO基因，但ABO基因表達的初級產(chǎn)物是α1，3-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(GTA)或α1，3-D-半乳糖基轉移酶(GTB)，在GTA、GTB 催化下，分別將供體底物UDP-Gal-NAc、UDP-Gal 轉移到H 糖鏈上形成A、 B 抗原，人類ABO基因位于9 號染色體，由7 個外顯子和6個內含子組成[20-21]。 目前已知與ABO 亞型有關的ABO基因突變類型包括:點突變、插入、缺失和基因重排等，由于突變類型以及突變位點的不同，導致ABO 亞型產(chǎn)生的機理也不盡相同[14]。 本研究將對工作中檢出的亞型進行表型與基因型關聯(lián)性分析，以探討其潛在的分子機制，從而達到準確鑒定血型，保障臨床輸血、器官移植等安全。

本研究檢出2 例Ael亞型，Ael血清學特點為正定型通常不被抗-A、抗-AB 及抗-A1凝集，但經(jīng)吸收放散試驗?？蓹z出A 抗原[16]；與抗-H 試劑反應凝集強度明顯增強，常與正常O 型紅細胞接近[4]；血清中存在不規(guī)則抗-A，這與正定型的A 亞型或者抗-A 減弱的O 型血清學上常難以區(qū)分，故有必要結合分子生物學對Ael患者血型進行準確鑒定。 我們鑒定的1 例Ael亞型基因型AEL.02/O.01.02，等位基因A1.01 的7 號外顯子上發(fā)生c.467C＞T(p.Pro156Leu)、c.646T＞A(p.Phe216Ile)和c.681G＞A突變，已知c.467C＞T 并不影響酶的活性，而c.681G＞A 為同義突變，因而c.646T＞A 突變是導致GTA活性減弱的主要原因。 相關文獻用3D 模型預測c.646T＞A 突變給GTA 帶來的影響:未引入新的氫鍵，未改變酶的空間結構，但影響了酶的穩(wěn)定性下降是造成酶活性減弱進而導致Ael亞型形成的原因[22]。 檢出的另1 例AelB 亞型基因型AEL.05/B.01，等位基因A1.01 上發(fā)生c.467C＞T 和c.767T＞C(p.Ile256Thr)突變，高晶等[23]利用3D 結構模型分析發(fā)現(xiàn)，在野生型256Ile 和突變型256Thr 這2 個蛋白結構中，均是256 位氨基酸的主鏈氧和Arg248位的側鏈氫之間形成氫鍵，突變部位局部結構變化不大，但突變后的熱動力學穩(wěn)定性改變值達到2.83 kcal/moL，因而很可能是突變導致酶的穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生Ael表型。

檢出3 例B3亞型，B3是指紅細胞上的B 抗原與抗-B 和抗-AB 試劑發(fā)生2＋及以上的特征性混合視野，而血清中一般無抗-B，唾液中含有正常量的B 物質和H 物質[1]。 這類亞型與血液疾病導致的獲得性血型變異及血型嵌合體外觀上難以區(qū)分，均有混合型凝集現(xiàn)象，故難以進行血清學分類，基因水平上的進一步研究成為必要。 隨后我們對此3例標本進行了基因型鑒定，鑒定均為等位基因B3.03，是發(fā)生在內含子3 上的c.155＋5G＞A 突變。 c.155＋5G＞A 最早由2012 年Chen 等[24]報道并闡述了其導致B3亞型的分子機制:c.155＋5G＞A 突變引起剪接錯誤，產(chǎn)生至少7 種可變剪接類型，但超過99%的剪接轉錄物不產(chǎn)生功能性蛋白，并且預測具有外顯子3 缺失的剪接轉錄物中不到1%的能產(chǎn)生功能性GTB，而此GTB 糖基轉移酶僅具有正常GTB 功能的一半。 這2 種相互作用機制共同解釋了弱B 抗原表達的機理，并最終導致B3典型混合視野。

檢出1 例B(A)，B(A)血型如同cisAB 一般特殊，其血型表觀學不符合孟德爾遺傳規(guī)律，而是以順式遺傳為特點，紅細胞上含有接近正常含量的B抗原和弱A 抗原[25]。BA與不同的A基因或者B基因存在時，由于等位基因的競爭作用，除了表現(xiàn)出經(jīng)典的B(A)表型外，還會表現(xiàn)出不同的血清學特點，比如與A基因共表達時會出現(xiàn)ABx 表型甚至出現(xiàn)正常的AB 型，而與B基因共表達時會出現(xiàn)AxB 表型[14]，加上不同實驗室所用抗血清效價差異，使得復雜的B(A)表型與AxB、ABx 亞型很難在血清學上區(qū)分開來。 目前B(A)亞型等位基因共有6 種(BA.01—BA.06)，具有基因型種類集中、明確的特性。 已知BA.02 是在等位基因B.01 基礎上發(fā)生c.700C＞G(p.Pro234Ala)突變。 縱觀等位基因BA.01 至BA.06，我們發(fā)現(xiàn)，除了GTA 和GTB 酶自身區(qū)別的4 個氨基酸外，只有2 個位點氨基酸(214和234) 的突變會改變酶的特異性:BA.02(p.Pro234Ala)、BA.04(p.Met214Val) 和BA.05(p.Met214Thr)，而且這2 個位點的突變均是在GTB上，使得B等位基因具有編碼雙功能酶能力，產(chǎn)生了弱的GTA 酶活性，從而合成弱A 抗原，產(chǎn)生B(A)表型。

3 例涉及Bw的表型，分別為:ABw1 例(A1.02/BW.07)，Bw1 例(BW.31/O.01.02)，A2Bw1 例(A2.05/BW.31)。 迄今為止國際上共發(fā)現(xiàn)34 種BW等位基因:BW.01—BW.34。BW.07 是在等位基因B.01 基礎上發(fā)生c.1055G ＞A(p.Arg352Gln)基因突變，血清學呈ABw，這與國內相關報道一致[26]。BW.31 是母子兩人，再次證明ABO 亞型突變等位基因呈遺傳性繼承，其突變位點是c.900G ＞C(p.Trp300Cys)。BW這些等位基因我們可以看出突變未造成GTB 酶的特異性改變，但卻很可能改變了酶局部結構，降低了酶的穩(wěn)定性，進而削弱了酶的活性，造成了紅細胞上B 抗原合成的減弱，這也從客觀上部分解釋了抗原抗體在質和量上出現(xiàn)差異性的原因[27]。

本研究共檢出7 例類孟買血型，類孟買血型具有復雜的基因多態(tài)性和遺傳異質性特點，我們需要聯(lián)合基因檢測對其血清進行準確鑒定并探討其發(fā)生的可能機制，從而為臨床安全供血提供依據(jù)。 目前發(fā)現(xiàn)FUT1 有60 多種等位基因，大致分為3 類:H＋、H＋weak及H-基因型，類孟買血型屬于H-(Null alleles)基因型，最常見的是:h1(c.547delAG)、h2(c.880delTT)、h3(c.658C ＞T)和h4(c.35C ＞T)型[28]。 本研究共檢出1 例h1h1、4 例h1h2 和2 例h2h2。 其中h1 分子機制:堿基AG 缺失，閱讀框移碼突變，終止密碼子前移，不僅影響了第184—267位氨基酸，而且在第268 位氨基酸處終止合成鏈，形成截短的酶，H-巖藻糖基轉移酶失去活性，不能合成H 抗原，使得紅細胞上的ABH 抗原缺失或極弱表達[29]。 同樣h2 也是堿基的缺失發(fā)生框移突變，終止密碼子前移，在第333 位氨基酸處終止合成鏈，合成后的氨基酸鏈長度只有正常的90%[30]，突變使得酶的活性嚴重降低或者失活，不能合成H抗原，產(chǎn)生類孟買血型。 7 例類孟買血型患者的FUT2 均存在c.357C＞T 突變，該突變在我們漢族人群中普遍存在，未改變編碼氨基酸(天冬酰胺)，屬于同義突變，不影響SE-巖藻糖基轉移酶活性，仍為分泌型。 另外FUT2 我們還檢出含c.716G＞A 雜合突變4 例，純合突變2 例，雖然該點突變屬于錯義突變，氨基酸由p.Arg239Gln 置換，但該突變不會導致SE-巖藻糖基轉移酶活性改變，只是增加了SE基因的多態(tài)性[31]。 故本研究的7 例類孟買血型均是由FUT1 基因缺陷導致，而FUT2 正常的H 抗原缺失的分泌型。

綜上所述，我們共鑒定出9 例ABO 亞型、7 例類孟買血型，闡述了表型與基因型之間關聯(lián)性，揭示了這2 種血型產(chǎn)生的可能分子機制，為ABO 血型的準確鑒定與預判提供精確的基因檢測靶點和理論依據(jù)，從而為臨床安全輸血、器官移植、胎母免疫性溶血病的預測與防治提供參考。