賈雪梅 邵樹軍 周璐潔 杜丹心 盧煌瑩 陳誠 夏榮

(1.復旦大學附屬華山醫(yī)院 輸血科，上海 200040；2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院 輸血科)

血栓性疾病(包括動脈血栓栓塞性疾病和靜脈血栓栓塞性疾病)是嚴重威脅人類健康的疾病，其病死率高，對此類疾病的管理治療也已成為醫(yī)療系統(tǒng)的嚴重負擔。 血栓疾病的發(fā)生風險隨著年齡的增加逐漸上升，其中年齡超過70 歲被認為是靜脈血栓的高危發(fā)病因素[1]，男性年齡超過45 歲，女性年齡超過55 歲被認為是動脈粥樣硬化性心血管病發(fā)生的高危因素[2]。 血小板在血栓形成中發(fā)揮著重要作用，已有多項研究表明，隨著年齡的增加，血小板的活性出現增加，血栓形成能力增強，因此，尋找機體衰老過程中血小板功能的調控機制對于血栓性疾病的臨床治療與疾病管理將發(fā)揮至關重要的作用。

去泛素化酶廣泛存在于機體中，可水解被泛素化標記的蛋白質，維持蛋白穩(wěn)定性或傳遞細胞內信號，從而對細胞的生長增殖及功能調控發(fā)揮作用[3]。 已有研究表明，血小板中有完整的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，表達多種泛素化酶及去泛素化酶，并參與調控血小板活化[3-4]。 去泛素化酶 9X(USP9X)是1 種高豐度表達的去泛素化酶，目前研究發(fā)現USP9X 參與細胞內吞、免疫應答及神經發(fā)育等生命過程，并在多種腫瘤中呈現高表達狀態(tài)[5-8]。 2014 年，Siman 等[9]對154 名健康成年人的血小板進行測序分析發(fā)現，USP9X 的mRNA 的表達與年齡呈現明顯正相關。 在本研究中，我們首先從蛋白質和RNA 水平上驗證了血小板中USP9X的表達，之后采用USP9X 特異性抑制劑檢測了其對血小板功能的影響，包括聚集、釋放及鋪展功能，最后通過免疫印跡的方法檢測了USP9X 對血小板下游信號通路的改變，現將研究結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 血小板來源

1.1.1小鼠

C57/BL6 小鼠若干只，老年小鼠年齡均＞18 個月；年輕小鼠為2 ～3 個月。 所有小鼠均購自維通利華公司，實驗動物的飼養(yǎng)及操作均符合實驗動物倫理學標準。

1.1.2健康志愿者

健康志愿者5 名，年齡18 ～25 歲，在2 周內未服用阿司匹林、氯吡格雷等影響血小板功能的藥物。

1.2 試劑與儀器

血細胞激動劑:ADP(貨號:＃P/N 384，批號:3526)，膠原(貨號:P/N 385，批號:3523)，凝血酶(貨號:P/N 386，批號:3524)，熒光素酶(貨號:P/N 387，批號:3525)，以上試劑均為Chrono-Log 公司產品； USP9X 抗體(貨號:55054-1-AP)，GAPDH 抗體(貨號:60004-1-Ig)，Akt 抗體(貨號:60203-2-Ig)，磷酸化Akt 抗體(貨號:66444-1-Ig)，以上試劑均為Proteintech 公司產品；USP9X 抑制劑FT709(MCE公司，貨號:HY-145967；批號:256350)；Trizol 提取試劑(碧云天公司，貨號:R0016)；逆轉錄試劑(Takara 公司，貨號:RR037B)；400VS 型雙通道血小板聚集儀(Chrono-Log 公司)；DM5500 Q 熒光顯微鏡(Leica 公司)；BC-2800Vet 動物血細胞計數儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1全血標本采集

人:從志愿者的肘正中靜脈中采集枸櫞酸鈉抗凝全血，15 mL/管；小鼠:麻醉后開腹充分暴露腹部結構，抽取腹主動脈枸櫞酸鈉抗凝全血，每只抽1管，1 mL/管。 具體采集管數依相應試驗需要確定。除免疫印跡試驗用標本部分采自老年小鼠(用于與年輕小鼠對比)外，其余試驗標本均采自年輕小鼠。

1.3.2血小板制備

1.3.2.1人血小板

參照文獻[10]的方法，將人抗凝全血通過密度梯度離心(300×g，10 min)獲得富血小板血漿(離心后的上層液體)，之后再次離心(600×g，5 min)獲得血小板沉淀，并用臺氏液重懸獲得洗滌血小板。 洗滌血小板靜置30 min 后方可用于后續(xù)檢測。

1.3.2.2小鼠血小板

將小鼠抗凝全血通過密度梯度離心(300×g，2 min)獲得富血小板血漿(離心后的上層液體)，之后再次離心(500×g，5 min)獲得血小板沉淀，并用臺氏液重懸獲得洗滌血小板。 洗滌血小板靜置30 min 后方可用于后續(xù)檢測。

1.3.3外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)制備

將2 管人抗凝全血或2 管小鼠抗凝全血分別加入等體積的生理鹽水，稀釋血液；取無菌離心管1 個，向其中加入Ficoll 分離液，并將上述稀釋好的血液按照1 ∶2的比例輕柔加入分離液中，隨后800×g，離心20 min，輕柔吸取中間的PBMCs 層，并分別將其轉移到1 個新的離心管中，向離心管中加入洗滌緩沖液15 mL，再次離心600×g，5 min，后使用PBS 重懸細胞，重復離心步驟1 次，最后獲得PBMCs。

1.3.4血小板RNA 提取及逆轉錄

按照試劑說明書方法，用Trizol RNA 提取試劑提取人血小板與小鼠血小板中的RNA，并用Takara逆轉錄試劑將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，之后通過聚合酶鏈式反應(PCR)，完成mRNA 表達的檢測。 引物序列見表1。

表1 RT-PCR 中所用引物序列Table 1 Primer sequence used in RT-PCR

1.3.5血小板蛋白免疫印跡試驗

參照文獻[11]的方法，將前述制備好的人與小鼠洗滌血小板分別與FT709(USP9X 抑制劑)孵育30 min 后，加入膠原(1.5 μg/mL)誘導血小板聚集，在特定的聚集時間點下(0 s、30 s、90 s、180 s)，加入血小板裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，冰上裂解10 min 后，加入上樣緩沖液，并于100℃金屬浴中煮樣10 min，完成免疫印記的蛋白標本制備。 采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白標本，再將分離開的SDS-PAGE 膠轉到PVDF 膜上，采用脫脂牛奶封閉1 h 后，孵育相應的一抗12 h，過夜之后，洗滌一抗并孵育二抗1 h，最后通過顯像儀器可視化PVDF 條帶。 免疫印記的圖像處理最終通過Image J 軟件完成。

1.3.6血小板聚集與釋放檢測

將人與小鼠的洗滌血小板分別與0.1% DMSO(對照組)和100 μmol/L FT709(實驗組)在37℃下孵育30 min，之后采用不同濃度(0.8 μg/mL 和1.5 μg/mL)的膠原誘導血小板聚集，并在聚集儀下觀察血小板的聚集反應，記錄血小板的最大聚集率。參照文獻[12]的方法，在血小板聚集檢測的同時通過添加熒光素酶來檢測血小板中ATP 的釋放，并記錄血小板釋放水平，本試驗重復做3 次。

1.3.7血小板鋪展檢測

參照文獻[13]中的方法，將配置好的100 μL纖維蛋白原溶液(100 μg/mL)提前12 h 包被于玻片上，將人和小鼠的洗滌血小板懸液調整到(30 ～50)×109/L 的濃度后，輕柔滴定100 μL 于包被有纖維蛋白原的玻片上，45 min 后對粘附在玻片上的血小板進行固定破膜并采用鬼筆環(huán)肽標記血小板，1 h 后PBS 清洗3 次并于熒光顯微鏡下觀察血小板的鋪展形態(tài)，通過Image J 軟件統(tǒng)計血小板的鋪展面積。 本試驗重復做3 次。

1.4 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 10.0.2 軟件完成數據統(tǒng)計分析。 聚集釋放及鋪展實驗結果以±s的形式表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人血小板與小鼠血小板表達USP9X 的情況

經過RT-PCR 擴增，與陽性對照(PBMCs)相比，人血小板與小鼠血小板均表達USP9X 的mRNA(圖1、圖2)與蛋白(圖3、圖4)。

圖1 人血小板表達USP9X 的mRNA 擴增結果Figure 1 PCR detection of USP9X in human platelets

圖2 小鼠血小板表達USP9X 的mRNA 擴增結果Figure 2 PCR detection of USP9X in mouse platelets

圖3 人血小板中USP9X 的免疫印記結果Figure 3 Western blot results of USP9X in human platelets

圖4 小鼠血小板中USP9X 的免疫印記結果Figure 4 Western blot results of USP9X in mouse platelets

2.2 不同年齡小鼠血小板中USP9X 的表達比較

免疫印跡檢測結果顯示老年小鼠的血小板中USP9X 的表達水平(0.87±0.099vs1.05±0.980)明顯高于年輕小鼠(t＝2.81，P＜0.05)，見圖5、圖6。

圖5 年輕小鼠血小板和老年小鼠血小板中USP9X 的免疫印記結果Figure 5 Western blot results of USP9X in platelets from both young and old mice

圖6 年輕小鼠血小板和老年小鼠血小板中USP9X 的免疫印記統(tǒng)計結果Figure 6 Statistical results of USP9X in platelets from both young and old mice

2.3 血小板聚集與釋放檢測結果

FT709 可濃度梯度依賴性地減弱低濃度(0.8 μg/mL)膠原誘導的人血小板的聚集(圖7 和圖8)，可增強高濃度(1.5 μg/mL)膠原誘導的人血小板的聚集(圖9、圖10)，并在人血小板活化過程中減弱人血小板ATP 的釋放(圖11、圖12)； FT709可濃度梯度依賴性地減弱低濃度(0.8 μg/mL)膠原誘導的小鼠血小板的聚集(圖13、圖14)，可減弱高濃度(1.5 μg/mL)膠原誘導的鼠血小板的聚集(圖15、圖16)，并在小鼠血小板活化過程中減弱鼠血小板ATP 的釋放(圖17、圖18)。

圖7 不同濃度FT709 處理人血小板后的聚集結果Figure 7 Aggregation results of human platelets treated with different concentration of FT709

圖8 不同濃度FT709 處理人血小板后的統(tǒng)計結果Figure 8 Aggregation statistics of human platelets treated with different concentration of FT709

圖9 FT709 處理人血小板后的聚集結果(1.5 μg/mL 膠原激動)Figure 9 Aggregation results of human platelets treated with FT709 (stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖10 FT709 處理人血小板后的聚集統(tǒng)計結果(1.5 μg/mL膠原激動)Figure 10 Aggregation statistics of human platelets treated with FT709(stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖11 FT709 處理人血小板后的釋放結果(1.5 μg/mL 膠原激動)Figure 11 ATP releasing curve of human platelets treated with FT709 (stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖12 FT709 處理人血小板后的釋放統(tǒng)計結果(1.5 μg/mL膠原激動)Figure 12 Statistical results of ATP releasing of human platelets treated with FT709 (stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖13 不同濃度FT709 處理小鼠血小板后的聚集結果Figure 13 Aggregation results of mouse platelets treated with different concentration of FT709

圖14 不同濃度FT709 處理小鼠血小板后的聚集統(tǒng)計結果Figure 14 Aggregation statistics of mouse platelets after treatment with different concentrations of FT709

圖15 FT709 處理小鼠血小板后的聚集結果(1.5 μg/mL膠原激動)Figure 15 Aggregation results of mouse platelets treated with FT709 (stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖16 FT709 處理小鼠血小板后的聚集統(tǒng)計結果(1.5 μg/mL 膠原激動)Figure 16 Aggregation statistics of mouse platelets after treatment with FT709 (stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖17 FT709 處理小鼠血小板后的釋放結果(1.5 μg/mL膠原激動)Figure 17 ATP releasing curve of mouse platelets treated with FT709(stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

圖18 FT709 處理小鼠血小板后的釋放統(tǒng)計結果(1.5 μg/mL 膠原激動)Figure 18 ATP releasing statistics of mouse platelets after treatment with FT709(stimulation with 1.5 μg/mL collagen)

2.4 血小板鋪展檢測結果

FT709 可顯著減少人血小板與小鼠血小板在纖維蛋白原表面的黏附面積(圖19、圖20)，表明USP9X 參與介導血小板的“外向內”信號通路。

圖19 100 μmol/L FT709 處理人血小板后的鋪展結果Figure 19 Spreading results of human platelets treated with 100 μmol/L FT709

圖20 100 μmol/L FT709 處理小鼠血小板后的鋪展結果Figure 20 Spreading results of mouse platelets treated with 100 μmol/L FT709

2.5 USP9X 對血小板Akt 磷酸化水平的影響

使用膠原激動血小板，并在血小板活化的指定時間點收樣(圖21)。 免疫印記結果顯示，相比于對照組，FT709 可導致血小板中Akt 的磷酸化水平明顯下降(圖22)，表明FT709 可以減弱血小板Akt的磷酸化。

圖21 收樣模式圖Figure 21 Schematic figure of platelets sample collection

圖22 FT709 處理后血小板后不同時間點Akt 磷酸化的免疫印記結果Figure 22 Western blot results of Akt phosphorylation at different time points after platelets activation

3 討論

血小板中USP9X 的表達與功能的相關研究目前尚未見報道，本研究可為USP9X 在臨床血栓疾病干預中的潛在應用提供數據支持。

在血小板的活化中，蛋白質的磷酸化是目前研究最廣泛的蛋白質修飾方式，磷酸化與去磷酸化的相互協調對于維持血小板功能的穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。 除了蛋白質的磷酸化外，血小板中還存在其他的翻譯后修飾過程，如蛋白質的泛素化修飾[13-14]。 泛素是由76 個氨基酸組成的多肽片段，可連接到蛋白質的賴氨酸殘基，參與維持蛋白質穩(wěn)定性或信號轉導的功能。 血小板中包含有泛素蛋白酶體機制，臨床工作中發(fā)現蛋白酶體抑制劑Bortezomib 可導致凝血酶、膠原及ADP 誘導的血小板功能出現抑制[15-16]，并可抑制三氯化鐵誘導的動脈血栓的形成。 這些結果均表明蛋白酶體在血小板活化中發(fā)揮著重要作用。 此外，還有研究表明去泛素化酶的抑制劑可抑制體外血小板功能及體內動脈血栓的形成[4]。 本研究中，我們首次檢測了USP9X 在人血小板與小鼠血小板中的表達，并首次發(fā)現抑制USP9X 可抑制體外血小板活化。 我們的前期研究表明血小板中表達多種去泛素化酶，這些去泛素化酶對于血小板信號傳導及蛋白穩(wěn)定性的維持發(fā)揮了重要作用，后期研究我們仍需確定USP9X 對血小板中具體蛋白的調控作用，并借助體外的細胞實驗完成后續(xù)驗證工作。

機體的衰老是隨著年齡增加出現的機體功能的障礙。 已有文獻總結了衰老過程中的多項變化，其中包括蛋白質的穩(wěn)態(tài)性下降[17-18]。 Davizon-Castillo 等[19]的研究結果顯示，泛素蛋白酶體通路在巨核細胞衰老中發(fā)揮著重要的作用，Simon 等[9]從154 名健康志愿者中分離獲得洗滌血小板，并采用測序技術檢測了人血小板中高豐度表達的mRNA，多因素回歸結果顯示USP9X 的mRNA 表達水平與年齡呈現明顯正相關。 本研究首次驗證了人血小板與小鼠血小板中均表達USP9X，同時發(fā)現老年小鼠的血小板中USP9X 的蛋白表達量明顯高于年輕小鼠(P＜0.05)，這一結果與Simon 等的研究結果一致，但對于USP9X 的mRNA 和蛋白水平增高的原因仍需進一步探索，例如，是否是衰老機體中USP9X 的轉錄因子表達升高，或者影響USP9X 表達的蛋白激酶的水平發(fā)生變化，對于上述假設的證明將為USP9X 在機體中的作用發(fā)揮提供重要證據。

血小板的活化過程受多個信號通路的調控，其中PI3K-Akt[脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)]信號發(fā)揮重要作用。 Akt 是PI3K 下游的關鍵分子，Akt 的磷酸化和活化對血小板聚集和顆粒物質釋放起到重要調控作用。 Akt 可被PI3K 募集到細胞膜上，并發(fā)生磷酸化，參與調控下游分子信號。 Akt 家族有3 個成員Akt1、Akt2、Akt3，在人血小板中表達Akt1 和Akt2[20-21]。 既往研究顯示，血小板中Akt 參與調節(jié)GPCR、GPVI 和GPIb-IX 等受體介導的下游信號通路，最終誘導整合素活化和顆粒物質釋放，并因此影響血小板的二相聚集(second wave platelet aggregation)[22-24]。 在本研究中，我們發(fā)現FT709 可減弱血小板的聚集率和ATP 釋放水平，進一步我們發(fā)現，FT709 可減弱Akt 的磷酸化，盡管目前尚未明確USP9X 在血小板中的具體作用靶點，但根據現有結果我們推測USP9X 可通過影響Akt 的磷酸化，最終影響血小板活化。 對于上述推測，進一步研究仍需從分子機制水平詳細闡述。

綜上所述，本研究首次驗證了人血小板與小鼠的血小板均表達USP9X，且USP9X 的特異性抑制劑FT709 可抑制人血小板與小鼠血小板的聚集釋放及鋪展功能。 但本研究未能明確USP9X 對于血小板中具體蛋白的調控作用，后續(xù)仍需要通過實驗動物和免疫沉淀的方法確定下游機制。