陳曉麗，王 霞，尚培中，李 偉，王 金，趙 臣

(1.中國(guó)人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 普通外科，河北 張家口 075000；2.懷來(lái)世濟(jì)醫(yī)院 門(mén)診部，河北 懷來(lái) 075400；3.中國(guó)人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 檢驗(yàn)病理科，河北 張家口 075000)

肝外膽管癌發(fā)病隱匿，出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)常已發(fā)生淋巴結(jié)和(或)神經(jīng)組織轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)者常累及第一肝門(mén)血管及肝臟組織。由于對(duì)化療、放療均不敏感，目前有效的治療方法仍然是根治性切除，但預(yù)后差，遠(yuǎn)期生存率較低，僅少數(shù)切緣陰性(R0)患者可獲5年生存[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管癌發(fā)生發(fā)展存在多種腫瘤標(biāo)記物的異常表達(dá)。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)具有鈣依賴(lài)性磷脂結(jié)合功能，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等，與多種腫瘤惡性發(fā)展相關(guān)[2]；X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)屬于凋亡抑制蛋白家族，對(duì)細(xì)胞凋亡起始及效應(yīng)2個(gè)階段均具有抑制功能[3]。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色技術(shù)檢測(cè)ANXA1和XIAP在肝外膽管癌及癌旁膽管組織中的表達(dá)，探討ANXA1和XIAP與肝外膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2015-10-2020-12月中國(guó)人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院收治的58例肝外膽管癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，其中男35例，女23例，男女比例為1.5∶1；年齡44～84歲，平均(62.8±6.2)歲；≤60歲21例，>60歲37例；癌灶大小≤1.5 cm 29例，>1.5 cm 29例；分化等級(jí)：高分化癌18例，中分化癌25例，低分化癌15例；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期31例，Ⅳ期3例；有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移(存在肝臟浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、肝十二脂腸韌帶及其周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移或脈管癌栓等)31例，無(wú)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移27例。58例中隨訪滿3年者42例，生存23例，死亡19例。癌旁對(duì)照30例切取距癌灶邊緣超過(guò)5 mm、且病理證實(shí)無(wú)癌殘留的膽管組織，高位膽管癌切取癌灶尾側(cè)膽管，低位膽管癌切取癌灶頭側(cè)膽管。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理和IHC判定及分類(lèi)明確的原發(fā)性肝外膽管癌；②臨床資料齊全，超聲、MSCT、MRI具有肝外膽管癌影像學(xué)特征；③術(shù)前未接受過(guò)化療、放療及其它抗癌治療措施。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝外膽管腺癌之外的其他少見(jiàn)類(lèi)型，如鱗癌、肉瘤等；②肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌；③原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌侵及肝門(mén)部膽管；④膽囊癌侵及肝外膽管；⑤胃、十二指腸腺癌侵及肝外膽管；⑥胰腺癌侵及肝外膽管；⑦并發(fā)其它惡性腫瘤的多源癌；⑧合并急性膽管炎或其它部位嚴(yán)重的炎性疾??；⑨并發(fā)其它嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。

1.2 研究方法

應(yīng)用IHC染色EliVisionTM plus二步法檢測(cè)肝外膽管癌組織及癌旁膽管組織中ANXA1和XIAP的表達(dá)。EliVision試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色劑、鼠抗人ANXA1單克隆抗體、兔抗人XIAP單克隆抗體均購(gòu)自于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。手術(shù)標(biāo)本封蠟切片厚4 μm，采用微波儀修復(fù)抗原，IHC染色時(shí)選取與蘇木素-伊紅(HE)染色相鄰切片，詳細(xì)操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。陽(yáng)性對(duì)照采用ANXA1和XIAP陽(yáng)性染色片，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液代替第一抗體。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

IHC染色呈棕黃色或棕褐色者為陽(yáng)性顆粒，依據(jù)色度深淺和染色癌細(xì)胞占比2項(xiàng)指標(biāo)判分定性：①色度深淺：無(wú)色、棕黃色、棕褐色分別判定為0分、1分、2分；②癌細(xì)胞占比≤5%、6%～30%、31%～69%、≥70%分別判定為0分、1分、2分、3分。根據(jù)①+②總分定性：0分、1～3分、4～5分，分別判定為陰性(-)、陽(yáng)性(+)、強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.4 觀察指標(biāo)

①ANXA1和XIAP在肝外膽管癌組織及癌旁膽管組織中的表達(dá)部位及陽(yáng)性率；②ANXA1和XIAP表達(dá)與患者性別、年齡、癌灶大小、分化等級(jí)、TNM分期、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及3年生存率7項(xiàng)臨床病理特征的相關(guān)性；③肝外膽管癌組織ANXA1和XIAP表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。IHC染色判定為ANXA1和XIAP陽(yáng)性組或陰性組例數(shù)采用n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，通過(guò)χ2值計(jì)算列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝外膽管癌組織和癌旁膽管組織ANXA1和XIAP的表達(dá)比較

ANXA1和XIAP在肝外膽管癌組織和癌旁膽管組織主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核。癌組織與癌旁膽管組織比較，ANXA1和XIAP陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 肝外膽管癌組織及癌旁膽管組織ANXA1和XIAP表達(dá)比較 n(%)

2.2 肝外膽管癌臨床病理特征與ANXA1和XIAP表達(dá)的關(guān)系

ANXA1和XIAP表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。在癌灶>1.5 cm、TNM(Ⅲ+Ⅳ)期、有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和3年內(nèi)死亡患者中ANXA1和XIAP表達(dá)顯著高于癌灶≤1.5 cm、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期、無(wú)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和3年內(nèi)生存患者(均P<0.05)。在(高+中)分化與低分化2組間，ANXA1陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.054，XIAP陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.030(表2)。

表2 肝外膽管癌臨床病理特征與ANXA1和XIAP表達(dá)的關(guān)系 n(%)

2.3 肝外膽管癌組織ANXA1和XIAP表達(dá)的相關(guān)性

58例患者ANXA1和XIAP共陽(yáng)性率為77.6%(45/58)，共陰性率為12.1%(7/58)，經(jīng)相關(guān)性分析，ANXA1和XIAP在肝外膽管癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.54)(表3)。

3 討 論

迄今尚未發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌特異強(qiáng)的腫瘤標(biāo)記物，其生物學(xué)特性與多種標(biāo)記物的網(wǎng)狀調(diào)控、協(xié)同表達(dá)或拮抗作用密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)歸與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，一旦后者發(fā)生紊亂，腫瘤細(xì)胞會(huì)不同程度增殖。ANXA1和XIAP均與癌細(xì)胞凋亡及癌灶浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是目前靶向治療的研究熱點(diǎn)[5-6]。我們分析了58例肝外膽管癌組織及30例癌旁膽管組織IHC染色結(jié)果，證實(shí)癌組織ANXA1和XIAP陽(yáng)性率均顯著高于癌旁膽管組織，表明兩者表達(dá)狀況有助于判斷膽管良、惡性病變。

3.1 肝外膽管癌組織ANXA1表達(dá)與患者性別、年齡、癌灶大小、分化等級(jí)、TNM分期的關(guān)系

近年研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1在多種腫瘤組織及血清中呈異常高表達(dá)[7-8]，其表達(dá)水平與惡性腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性及患者預(yù)后顯著相關(guān)[9-11]。樊又菠等[12]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤內(nèi)ANXA1的表達(dá)水平與動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振灌注參數(shù)Ktrans值呈正相關(guān)，有助于鑒別高級(jí)別膠質(zhì)瘤與低級(jí)別膠質(zhì)瘤。有研究[13-16]報(bào)道ANXA1高表達(dá)與膽管癌灶大小、腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性發(fā)展行為顯著相關(guān)，具有判定患者預(yù)后的臨床實(shí)用價(jià)值。本研究通過(guò)對(duì)49例ANXA1陽(yáng)性表達(dá)的肝外膽管癌進(jìn)行分組對(duì)比，結(jié)果表明，ANXA1表達(dá)與男女性別、年齡大小無(wú)關(guān)(均P>0.05)。在癌灶>1.5 cm、TNM(Ⅲ+Ⅳ)期患者中ANXA1表達(dá)顯著高于癌灶≤1.5 cm、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期患者(均P<0.05)，表明ANXA1表達(dá)上調(diào)預(yù)示肝外膽管癌癌灶較大，臨床及病理分期晚。在(高+中)分化與低分化2組間，ANXA1陽(yáng)性率比較P值略大于0.05，可能與本研究樣本較少有關(guān)，需進(jìn)一步積累更多病例開(kāi)展更大樣本研究。

3.2 肝外膽管癌組織XIAP表達(dá)與患者性別、年齡、癌灶大小、分化等級(jí)、TNM分期的關(guān)系

近年研究表明，XIAP在多種腫瘤組織及血清中呈異常高表達(dá)[3，6，17]。下調(diào)XIAP基因表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路，可增強(qiáng)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)誘導(dǎo)的多種癌細(xì)胞凋亡[18-19]。在膽囊癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌也有類(lèi)似的研究報(bào)道[20-21]。一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，XIAP蛋白與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其高表達(dá)患者分化級(jí)別低，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，總體生存率低于低表達(dá)或不表達(dá)患者[22-23]。本研究通過(guò)對(duì)47例XIAP陽(yáng)性表達(dá)的肝外膽管癌進(jìn)行分組對(duì)比，結(jié)果表明，XIAP表達(dá)在不同性別和年齡組(≤60歲與>60歲)之間表達(dá)的差異性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在癌灶≤1.5 cm與>1.5 cm、(高+中)分化與低分化、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期與(Ⅲ+Ⅳ)期的分組患者中，各組間陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，表明XIAP高水平表達(dá)預(yù)示肝外膽管癌癌灶較大，惡性程度及病理分期高，臨床進(jìn)展快。

3.3 肝外膽管癌組織ANXA1和XIAP表達(dá)與轉(zhuǎn)移、生存的關(guān)系

癌灶浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移影響患者生存質(zhì)量和生存期，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移潛能越大，病情發(fā)展越快。本研究中我們探討了ANXA1和XIAP表達(dá)與肝外膽管癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及生存期的關(guān)系，具有肝臟浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、肝十二脂腸韌帶及其周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓等浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移特征的患者，ANXA1和XIAP陽(yáng)性率顯著高于無(wú)上述浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移特征的患者，3年內(nèi)死亡患者ANXA1和XIAP陽(yáng)性率顯著高于3年內(nèi)生存患者，表明ANXA1和XIAP高表達(dá)的肝外膽管癌侵襲性強(qiáng)，生存期短。近年來(lái)，針對(duì)ANXA1陽(yáng)性腫瘤干預(yù)其表達(dá)，為延緩浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、提高化療敏感性及免疫治療效果、減少耐藥性等提供了新途徑[2，5-7]。Kwuntida等[12]認(rèn)為，對(duì)ANXA1陽(yáng)性膽管癌下調(diào)ANXA1基因表達(dá)或抑制ANXA1蛋白活性，可作為預(yù)防其轉(zhuǎn)移的策略之一。另一方面，針對(duì)XIAP陽(yáng)性肝外膽管癌的試驗(yàn)治療也有較多報(bào)道，Clawson等[24]聯(lián)合應(yīng)用雷公藤甲素和TNF相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)劑(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡。Yin等[25]對(duì)XIAP高表達(dá)的膽管癌應(yīng)用聯(lián)苯二氟酮EF24[3，5-bis(2-flurobenzylidene)piperidin-4-one]抑制XIAP相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡，延緩癌灶生長(zhǎng)。Wehrkamp等[26]研究發(fā)現(xiàn)，XIAP拮抗劑embelin可降低膽管癌細(xì)胞系XIAP表達(dá)。雖然迄今膽管癌的診治效果仍不令人滿意，但隨著對(duì)其生物學(xué)特性的深入研究以及對(duì)膽管癌相關(guān)基因組和蛋白組信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)字化智能檢測(cè)的不斷豐富，個(gè)體化精準(zhǔn)診療方案顯然值得期待。

綜上，ANXA1和XIAP高表達(dá)均與肝外膽管癌的惡性發(fā)展密切相關(guān)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)ANXA1和XIAP在癌組織及血清中的表達(dá)，對(duì)評(píng)估肝外膽管癌惡性程度、病情進(jìn)展及預(yù)后、術(shù)后是否殘留癌組織、動(dòng)態(tài)觀察臨床療效等均具有一定價(jià)值，相信針對(duì)兩者的個(gè)體化分子精準(zhǔn)治療將提高膽管癌的綜合診治水平。