汪海燕，李玟君，李玉蝶，宋青云，龐子皓，肖一郎，汪超，李瑋

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430000）

花生蛋白由90%的鹽溶性蛋白和10%的水溶性蛋白組成，而鹽溶蛋白中含有73% 的花生球蛋白[1]?；ㄉ械那虻鞍拙哂辛己玫臒岱€(wěn)定性、復(fù)雜的空間構(gòu)象以及維持空間構(gòu)象所需要的疏水鍵、二硫鍵和離子鍵等功能性官能團，可作為一種優(yōu)良原料廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2]?；ㄉ虻鞍资腔ㄉ鞍字凶钪匾慕M分，直接影響花生蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。因此花生球蛋白更適于花生蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)改性機理的深入研究。

花生在日常貯藏和加工過程中，容易發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)品保質(zhì)期縮短并產(chǎn)生異味，影響食用價值。蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后羰基化合物含量增加，蛋白的分子間作用力被破壞，高級結(jié)構(gòu)改變并形成交聯(lián)聚集，因此通過研究蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、光譜特征、反應(yīng)位點等可反映氧化對蛋白質(zhì)的作用規(guī)律[3]。已有研究人員使用了各種活性氧或脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物來模擬蛋白質(zhì)氧化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氧化會影響食物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，例如肉蛋白[4]和大豆蛋白[5]。另外李志豪[6]研究2，2′-鹽酸脒基丙烷對瓜籽蛋白的影響發(fā)現(xiàn)，在低氧化度（0～1 mmol/L）時，籽瓜種仁分離蛋白質(zhì)產(chǎn)生可溶性聚集體。隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，共價鍵交聯(lián)可能導(dǎo)致這些可溶性聚集體進一步聚集，產(chǎn)生不溶性聚集體，導(dǎo)致籽瓜種仁分離蛋白質(zhì)溶解度降低。

目前，對于花生球蛋白的改性研究主要集中在物理研究方面，如熱處理和高壓處理[7]，而對花生球蛋白氧化的研究較少。2，2′-鹽酸脒基丙烷[2，2′-azobis（2-amidinopropane），AAPH]有氧熱分解產(chǎn)生的過氧自由基是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中最主要的自由基中間體[8]。因此，本研究采用AAPH 在有氧條件下熱分解產(chǎn)生的過氧自由基代表花生蛋白氧化酸敗中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，研究脂質(zhì)自由基氧化對花生球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以期更深入地了解花生蛋白的氧化機理，為合理開發(fā)花生蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉：上海源葉生物科技有限公司；AAPH：上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、甘氨酸：廣州賽國生物科技有限公司；硫酸銨、無水磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone12L 真空冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；F-7000 熒光分光光度計：日本日立公司；M200 PRO 酶標(biāo)儀：瑞士Tecan 公司；Zetasizer Nano-ZS 型納米粒度和Zeta 電位分析儀：英國Malvern 公司；JSM-6390LV 掃描電子顯微鏡：日本電子JEOL 公司；Vertex 70 傅里葉紅外光譜儀：德國Bruker 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生球蛋白的提取

參考陳鵬梟等[9]的方法并加以修改，稱取適量花生蛋白粉溶于0.5 mol/L NaCl、pH7.9 的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌2 h 后，于4 ℃環(huán)境下，以4 000 r/min離心30 min，取沉淀用上述磷酸鹽緩沖液按1∶5（g/mL）復(fù)溶，然后透析48 h，凍干備用。

1.3.2 過氧自由基氧化花生球蛋白的制備

參考楊曦等[10]的方法并略加修改，稱取1 g 花生球蛋白溶于100 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH7.4），分別加入濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 mmol/L 的AAPH，37 ℃避光反應(yīng)24 h 后，冰浴降溫至4 ℃，于4 ℃透析72 h，凍干后為氧化花生球蛋白，以不加AAPH 的花生球蛋白作為空白對照。

1.3.3 花生球蛋白濁度的測定

稱取10 mg 樣品溶于10 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH7.0），在40 ℃的水浴鍋中水浴30 min 后取出，冷卻后在600 nm 處測定吸光度，以吸光度代表濁度。

1.3.4 游離巰基含量的測定

參考范婷等[11]的方法并略加修改，稱取9 mg 的樣品溶于3 mL 的Tris-甘氨酸緩沖液（pH8.0）中，取2.5 mL上述溶液并在其中加入20 μL DTNB 試劑，混合均勻避光反應(yīng)10 min，在412 nm 處測上清液吸光度。游離巰基含量（X，μmol/g）的計算公式如下。

X=73.53×A412nm×D/C

式中：A412nm為吸光度；D為稀釋倍數(shù)，1.01；C為蛋白濃度，mg/mL。

1.3.5 粒徑的測定

參考楊晨[12]的方法并略加修改，稱取10 mg 樣品溶于10 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH7.0），攪拌均勻后4 000 r/min 離心20 min，取上清液，然后將上清液通過0.45 μm 濾膜除去不溶性的雜質(zhì)后進行粒徑的測定。

1.3.6 Zeta 電位的測定

參考李學(xué)鵬等[13]的方法并略加修改，稱取10 mg樣品溶于10 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH7.0），攪拌均勻后4 000 r/min 離心20 min 取上清液，然后將上清液通過0.45 μm 濾膜除去不溶性的雜質(zhì)后進行Zeta 電位的測定，測定溫度為25 ℃，溫度平衡時間為2 min。

1.3.7 內(nèi)源熒光的測定

參考朱增芳[14]的方法并略加修改，稱取10 mg 樣品溶于10 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH7.0），使用熒光分光光度計測定蛋白質(zhì)的固有發(fā)射熒光光譜，在290 nm 處激發(fā)，掃描波段為300～400 nm，狹縫寬為5 μm，靈敏度為1，記錄光譜的最大發(fā)射波長以進行分析。

1.3.8 傅里葉紅外光譜的測定

參考沈明娟等[15]的方法略作修改，稱取1 mg 凍干氧化花生球蛋白和100 mg 干燥的KBr 粉末在研缽中混勻并充分研磨，稱取適量進行壓片，在4 000～400 cm-1內(nèi)測定紅外吸收光譜，吸光分辨率2 cm-1，掃描次數(shù)32 次，利用OMNIC 軟件對圖譜進行分析，并利用Peakfit Version 4.12 軟件對圖譜中酰胺Ⅰ區(qū)（1 700～1 600 cm-1）進行解析，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)分區(qū)計算各區(qū)域內(nèi)子峰面積占總峰面積之比，確定蛋白質(zhì)4 種二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.9 掃描電子顯微鏡測定

參考王莉[16]的方法略作修改，采用掃描電子顯微鏡，取凍干后少量花生球蛋白樣品，將樣品均勻涂抹在帶導(dǎo)電膠的干凈樣品臺上，隨后樣品經(jīng)噴金處理30 min，在20 kV 電壓下用掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌，放大倍數(shù)為800 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均重復(fù)3 次以上，試驗結(jié)果采用Origin Pro 2021 軟件分析作圖，SPSS 25.0 軟件進行顯著性分析。P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧自由基氧化對花生球蛋白濁度的影響

濁度是指溶液對光線通過時所產(chǎn)生的阻礙程度，包括懸浮物對光的散射和溶質(zhì)分子對光的吸收，可以反映氧化過程中蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)。樣品在600 nm下的吸光度表示其濁度，其結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白濁度的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AAPH on the turbidity of arachin

由圖1 可知，花生球蛋白隨濃度的增加其濁度也顯著增加（P<0.05），表示其濁度的吸光度由0.20±0.01增加至0.44±0.01，15.0 mmol/L 氧化時導(dǎo)致濁度上升程度最高，上升了1.2 倍。氧化后的花生球蛋白濁度明顯上升，說明羥自由基氧化使蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白溶液光學(xué)密度增加[15]。這表明氧化使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，形成了小分子聚集體，且隨氧化程度的上升，小分子聚集體逐漸增多，濁度上升，這也與Jiang 等[17]的結(jié)果一致。魏娜[18]的研究結(jié)果也表明，在同一溫度下，鴨肉肌原纖維蛋白的濁度大小與羥自由基濃度成正比，氧化作用會影響鴨肉肌原纖維蛋白不可溶聚集體的生成，導(dǎo)致其濁度的增加。

2.2 過氧自由基氧化對花生球蛋白游離巰基的影響

巰基以自由基形式存在或形成二硫鍵，在蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。游離巰基含量可以用來表征花生球蛋白的氧化程度，不同濃度的AAPH對花生球蛋白的游離巰基的影響如圖2 所示。

圖2 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白游離巰基的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AAPH on free sulfhydryl group of arachin

由圖2 可知，隨著氧化程度的增加，花生球蛋白的游離巰基含量顯著下降（P<0.05），從（14.62±0.08）μmol/g 下降到（7.77±0.25）μmol/g。當(dāng)AAPH 濃度為15.0 mmol/L 時，游離巰基含量相比對照組降低了48.62%，表明花生球蛋白經(jīng)AAPH 氧化后，可能會發(fā)生可逆的氧化反應(yīng)，使巰基氧化為二硫鍵和次磺酸狀態(tài)，同時也可能發(fā)生不可逆的氧化，導(dǎo)致花生球蛋白游離巰基的下降[3]。楊曦等[19]也發(fā)現(xiàn)自由基氧化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的游離巰基含量降低，自由基氧化可影響巰基和二硫鍵交互反應(yīng)平衡常數(shù)的改變。巰基是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要的作用力，巰基含量的降低意味著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.3 過氧自由基氧化對花生球蛋白粒徑的影響

不同濃度的AAPH 對花生球蛋白粒徑的影響如圖3 所示。

圖3 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白粒徑的影響Fig.3 Effect of different concentrations of AAPH on the particle size of arachin

由圖3 可知，不同AAPH 濃度下，花生球蛋白的粒徑總體分布在100～1 000 nm 之間，未氧化的花生球蛋白的粒徑明顯低于氧化后的花生球蛋白的粒徑，且隨著AAPH 濃度的增加氧化花生球蛋白粒徑分布開始向大尺寸方向移動，平均粒徑也從（153.94±3.31）nm增加到（196.80±3.06）nm。這可能是氧化使蛋白分子的疏水基團暴露，在二硫鍵和次級鍵的作用下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生交聯(lián)，生成較大的蛋白質(zhì)聚集體，表現(xiàn)為蛋白的平均粒徑增大[3]。Ye 等[20]的研究也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果，AAPH 氧化可導(dǎo)致形成花生蛋白可溶性聚集體。尤翔宇[21]在采用AAPH 氧化米糠蛋白時，氧化米糠蛋白粒徑分布也隨AAPH 濃度的增加呈上升趨勢。本研究中，濁度的試驗結(jié)果與粒徑變化的結(jié)果一致，進一步說明氧化會使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，從而使其粒徑增大。

2.4 過氧自由基氧化對花生球蛋白Zeta 電位的影響

Zeta 電位的絕對值可以表征溶液的穩(wěn)定性。氧化花生球蛋白的電位變化如圖4 所示。

圖4 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白Zeta 電位的影響Fig.4 Effect of different concentrations of AAPH on Zeta potential of arachin

由圖4 可知，加入0.5 mmol/L AAPH 后，電位絕對值開始降低，當(dāng)AAPH 濃度為1.0 mmol/L 時，電位絕對值降低幅度明顯沒有AAPH 濃度為0.5 mmol/L 時降低幅度大，說明氧化改變了花生球蛋白的電位絕對值，從而改變了蛋白溶液的穩(wěn)定性。然而隨著AAPH濃度的增加，電位絕對值又呈現(xiàn)不同程度的下降，在AAPH 濃度為15.0 mmol/L 時，電位絕對值降低幅度最大，從（24.17±0.06）mV 下降到（15.93±0.05）mV，降低了34.09%（P<0.05），說明高濃度的氧化劑會較大程度地影響溶液的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)帶電荷主要是因為氨基酸帶電荷，蛋白質(zhì)在過氧自由基的攻擊下，一些氨基酸被氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷絕對值降低，由于所帶電荷絕對值的減少，蛋白質(zhì)之間靜電相互作用力減小，這也是蛋白質(zhì)在氧化后溶解度降低的原因之一[22]，此結(jié)果與本試驗的氧化后花生球蛋白濁度的變化相互印證。這說明AAPH 氧化使得花生球蛋白氨基酸殘基發(fā)生變化，從而破壞花生球蛋白溶液的穩(wěn)定性，改變花生球蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.5 過氧自由基氧化對花生球蛋白熒光光譜的影響

色氨酸最大熒光發(fā)射波長可以表示色氨酸殘基在蛋白質(zhì)中的相對位置，通常用作檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[23]的標(biāo)記物。色氨酸殘基在290 nm 激發(fā)下，可以在300～400 nm 內(nèi)發(fā)出熒光[5]。不同濃度的AAPH 對花生球蛋白熒光掃描圖譜的影響如圖5 所示。

圖5 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白熒光掃描圖譜的影響Fig.5 Effect of different concentrations of AAPH on fluorescence scanning spectra of arachin

由圖5 可知，在0～1.0 mmol/L AAPH 之間，最大發(fā)射波長從301.4 nm 逐漸增加到301.6 nm，然后在5.0 mmol/L AAPH 時開始下降，在15.0 mmol/L AAPH下，最大發(fā)射波長降到300.1 nm。熒光發(fā)射向較長波長的位移（紅移）表明發(fā)色團（色氨酸殘基）更容易暴露于親水環(huán)境中，而較短的波長（藍移）更容易暴露于疏水環(huán)境中[23]。這可能是因為在較低的氧化劑濃度時，花生球蛋白暴露出色氨酸殘基，隨著AAPH 濃度的增加，一些暴露的疏水基團參與了疏水作用，形成了不可溶性聚集體，這也與前面的試驗結(jié)果（濁度增加、粒徑增大）相一致，說明氧化致使花生球蛋白發(fā)生聚集。

2.6 過氧自由基氧化對花生球蛋白紅外掃描光譜的影響

傅里葉變換紅外光譜表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)方法之一，酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1），是反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化最常用的譜帶[24]。紅外光譜中蛋白酰胺Ⅰ帶常被劃分為β-折疊（1 636～1 620 cm-1，1 696～1 677 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1 648～1 640 cm-1）、α-螺旋（1 658～1 649 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 670～1 659 cm-1）[15]。經(jīng)AAPH 氧化后，花生球蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化如圖6所示。

圖6 不同濃度的AAPH 對花生球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of different concentrations of AAPH on the secondary structure of arachin

由圖6 可知，隨著AAPH 濃度的上升，α-螺旋明顯下降，β-折疊和無規(guī)則卷曲明顯上升，說明氧化使花生球蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，呈現(xiàn)由α-螺旋向β-折疊和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變的趨勢。陳曉思等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著AAPH 濃度的升高，兔肉肌原纖維蛋白的α-螺旋含量逐漸降低，這與本研究結(jié)果一致。α-螺旋結(jié)構(gòu)主要依靠蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵維持，而自由基攻擊蛋白質(zhì)的氨基使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵減少，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊化[25]。魏娜[18]的研究表明過氧自由基氧化可使鴨肉肌原纖維蛋白的α-螺旋的含量減小，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增大，表明過氧自由基能促進氫鍵的斷裂，使鴨肉肌原纖維蛋白朝著不穩(wěn)定的方向轉(zhuǎn)變。

為進一步研究氧化后花生球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，繪制了AAPH 濃度與花生球蛋白二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性熱圖，如圖7 所示。

圖7 AAPH 濃度與花生球蛋白二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性熱圖Fig.7 Heatmap of correlation between AAPH concentration and the secondary structure of arachin

熱圖中顏色越接近紅色，表示相對值越高，越接近藍色，表示相對值越低。從圖7 可看出，AAPH 濃度與β-折疊和無規(guī)則卷曲的變化有較強的正相關(guān)，與α-螺旋有較強的負相關(guān)。

2.7 過氧自由基氧化對花生球蛋白微觀形態(tài)的影響

花生球蛋白過氧自由基氧化的微觀形態(tài)如圖8所示。

圖8 不同濃度的AAPH 氧化后花生球蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig.8 Scanning electron microscope of arachin oxidized by different concentrations of AAPH

由圖8 可知，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.5 mmol/L AAPH氧化后，花生球蛋白明顯聚集起來；當(dāng)AAPH 濃度為1.0 mmol/L 時，花生球蛋白分子聚集變得更加緊實；5.0 mmol/L 時，可看出蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸變得松散；當(dāng)AAPH 濃度為15.0 mmol/L 時，相比AAPH 濃度為10.0 mmol/L 花生球蛋白表面孔隙明顯增大，且呈現(xiàn)明顯的“蜂窩”狀結(jié)構(gòu)，這與張雪春等[3]的研究結(jié)果相似?？赡苁茿APH 氧化使花生球蛋白分子結(jié)構(gòu)變化，內(nèi)部松散結(jié)構(gòu)伸展，巰基和疏水基團暴露，并發(fā)生相互作用，形成聚集體，這也與花生球蛋白經(jīng)氧化游離巰基含量逐漸降低，濁度逐漸上升，粒徑增大的結(jié)果相對應(yīng)。周非白[26]研究的豬肉肌原纖維蛋白氧化后的微觀形態(tài)也呈現(xiàn)同樣的結(jié)果，表明氧化使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

3 結(jié)論

本研究通過AAPH 氧化花生球蛋白，分析其對花生球蛋白結(jié)構(gòu)和聚集行為的影響。結(jié)果表明，經(jīng)AAPH氧化后花生球蛋白溶液濁度顯著增加（P<0.05），這是由氧化后形成蛋白聚集體所造成，這與氧化后花生球蛋白的粒徑顯著增加，形貌孔徑顯著增大的現(xiàn)象相一致。同時AAPH 對花生球蛋白的氧化使其游離巰基含量和電位絕對值下降，降低了花生球蛋白的穩(wěn)定性，經(jīng)氧化后花生球蛋白的二級結(jié)構(gòu)顯示由α-螺旋向β-折疊和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化的趨勢。氧化后花生球蛋白熒光最大發(fā)射波長的藍移與紅移，與花生球蛋白中色氨酸及其殘基在低濃度氧化劑下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低、高濃度氧化劑下參與聚集體有關(guān)。由此可見，花生球蛋白經(jīng)過AAPH 氧化后會發(fā)生聚集且其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，可對花生球蛋白的改性機理研究提供依據(jù)。