楊柳，項芳琴，王海霞，姜海莘，李柏良

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

在人體微生物組成中，腸道菌群是一個微小但起著關鍵作用的部分，它參與調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的平衡，對宿主體內(nèi)的生理功能產(chǎn)生影響[1]。近年來，越來越多的研究者將目光聚集到腸道菌群，對不同健康狀態(tài)的菌群進行分析，研究結果表明，腸道菌群在腸道健康和各種疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]，其中副干酪乳酪桿菌是重要的一環(huán)。

副干酪乳酪桿菌是乳桿菌屬中的重要成員，它是一種革蘭氏陽性菌。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳酪桿菌在人體腸道中大量存在且對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，在發(fā)酵乳制品和發(fā)酵蔬菜肉中也有大量存在[3]。副干酪乳酪桿菌具有多種功能，可以有效抑制致病菌和腐敗菌的繁殖，通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，降低免疫激活作用，從而降低腸易激綜合征的炎癥反應[4]。此外，副干酪乳酪桿菌還能促進消化和吸收，它可以分解食物中的復雜碳水化合物和蛋白質(zhì)，釋放出營養(yǎng)物質(zhì)，提高食物的可利用性。同時，副干酪乳酪桿菌還具有保護腸道黏膜、維持腸道菌群平衡的作用，有助于改善腸道健康。除了在食品領域的應用，副干酪乳酪桿菌還被廣泛應用于保健品、藥品和化妝品等領域[5]。

副干酪乳酪桿菌在腸道系統(tǒng)中能夠固定生存繁殖并且在此過程中對腸道有良性影響，從而對機體進行正向調(diào)節(jié)[6]。Marzotto 等[7]將副干酪乳酪桿菌混合在酸乳中喂食給1～2 歲嬰兒，發(fā)現(xiàn)92%實驗對象糞便中含有副干酪乳酪桿菌并且含量最高，這說明副干酪乳酪桿菌能夠在人體內(nèi)定植。Verdenelli 等[8]對成年人進行分組實驗，研究結果顯示，成年人在攝入副干酪乳酪桿菌后，腸道蠕動明顯增強，表明副干酪乳酪桿菌在調(diào)節(jié)人體排便方面起到積極的作用。

本研究以副干酪乳酪桿菌Glory LP16 為研究對象，參考保健食品功能評價檢驗方法進行實驗。通過研究副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質(zhì)量和腸道菌群豐度的影響，組織病理學分析、腸道屏障的測定、腸道通透性的測定和短鏈脂肪酸的測定，進而研究副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸道健康調(diào)節(jié)效果，以期為進一步開展和副干酪乳酪桿菌在食品方面應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 凍干粉（實驗室檢測菌株規(guī)格為1.4×1011CFU/g）：金華銀河生物科技有限公司；普通滅菌飼料、墊料：北京維通利華實驗動物技術有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）檢測試劑盒、D-乳酸檢測試劑盒：泉州科諾迪生物科技有限公司；5～6 周齡雄性BALB/c 小鼠[（無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級]：斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（DL-CJ-2NDI）：蘇州安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（BG-160）：上海一恒科技有限公司；立式蒸汽滅菌器（LS-28HD）：上海申安醫(yī)療器械廠；臺式高速離心機（TGL-16G）：上海安亭科技儀器廠；超低溫冰箱（DW150）：青島海爾集團；酶標儀（Multiskan GO）、熒光定量聚合酶鏈式反應儀（abi 7500）：美國賽默飛公司；糞便處理儀（PhenoMaster）：德國TSE Systems 公司；光學顯微鏡（CX21）：日本奧林巴斯公司；氣相色譜（7890B）：美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物

48 只BALB/c 小鼠，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22 ℃、濕度50%，12 h 光照，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應性飼養(yǎng)1 周，隨機將實驗動物分成4 組，每組12 只。實驗過程中所有動物操作均按照東北農(nóng)業(yè)大學《實驗動物管理條例》進行，經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準。

1.3.2 劑量分組及受試樣品給予時間

小鼠被隨機分為4 組：對照組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 低劑量組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 中劑量組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 高劑量組。其中對照組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，各組樣品進行14 d實驗。具體分組見表1。

表1 實驗分組Table 1 Experimental grouping

1.3.3 樣品準備

在每日灌胃前，分別取一定量的副干酪乳酪桿菌Glory LP16 菌粉按照濃度溶解在生理鹽水中。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 體質(zhì)量變化

記錄小鼠實驗結束時空腹體質(zhì)量。

1.3.4.2 腸道菌群變化

在每天給小鼠進行灌胃前，在無菌環(huán)境中，從小鼠的肛門內(nèi)獲取0.1 g 的糞便樣品，并進行10 倍系列稀釋，分別接種在雙歧桿菌瓊脂、乳酸桿菌選擇性瓊脂、伊紅美藍瓊脂、疊氮鈉-結晶紫七葉苷瓊脂和胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂平板，檢測糞便中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)期莢膜梭菌數(shù)量。培養(yǎng)結束后，通過觀察菌落形態(tài)、進行革蘭氏染色和生化反應等鑒定方法，計算出每克濕便中的菌落數(shù)量，公式如下。

C= lg(T×N/M)

式中：C為菌落數(shù)量，lg（CFU/g）；T為平均菌落計數(shù)，CFU/g；N為稀釋倍數(shù)；M為取樣質(zhì)量，g。

在最后一次灌胃后的24 h 內(nèi)，使用相同的方法進行樣品采集和檢測。觀察并記錄雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的變化情況。

1.3.4.3 組織病理學分析

經(jīng)過蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后通過顯微鏡觀察腸道病理結構。

1.3.4.4 腸道屏障的測定

利用實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測腸道黏蛋白1（mucin1，MUC1）、黏蛋白2（mucin2，MUC2）和緊密連接蛋白[閉鎖小帶蛋白1（zonulaoccludens1，ZO-1）、Occludin和Claudin-1]相關基因的mRNA 表達水平而測定腸道屏障。

1.3.4.5 腸道通透性的測定

利用試劑盒測定腸道中LPS 和D-乳酸的含量。

1.3.4.6 短鏈脂肪酸的測定

在糞便樣本盒中放入盲腸內(nèi)容物1 g。用糞便處理儀處理樣品并配制懸濁液（質(zhì)量分數(shù)10%）。將1 mL懸濁液和200 μL 巴豆酸與偏磷酸混合溶液混合均勻并在-20 ℃下冷凍1 d。解凍后，離心3 min（8 000 r/min，4 ℃），蛋白質(zhì)被清除分離。最后用0.22 μm 過濾器過濾上清液后得到待測樣品，樣品用氣相色譜進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，利用SPSS 26.0 軟件進行Duncan′s test 差異顯著性分析。當P<0.05 時，表示差異顯著；P<0.01 為差異極顯著，P>0.05 為差異不顯著。使用Graph Pad 軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質(zhì)量的影響

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質(zhì)量的影響如圖1 所示。

圖1 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus paracasei Glory LP16 on body weight of mice

由圖1 可知，干預前，各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異。與干預前相比，干預14 d 后各組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P<0.05），但各組之間無明顯差異，這意味著副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠的消化吸收、代謝或者其他生理過程產(chǎn)生了積極的影響，對小鼠的生長無不良影響[9]。

2.2 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸道菌群的影響

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道菌群的影響如圖2 所示。

圖2 小鼠腸道菌群的變化Fig.2 Changes in intestinal flora of mice

由圖2 可知，小鼠在干預前，小鼠糞便中各類菌含量無顯著差異（P>0.05），這表明不同組的小鼠腸道菌群較為一致。干預前后相比，對照組小鼠糞便中的腸道菌群無顯著差異（P>0.05）；各組小鼠灌胃給予副干酪乳酪桿菌Glory LP16 14 d 后，小鼠糞便內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌均顯著增加（P<0.05）；腸桿菌和腸球菌未見顯著變化（P>0.05）；產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著減少（P<0.05）。干預后與對照組相比，灌胃給予副干酪乳酪桿菌Glory LP16 14 d 后，低、中、高劑量組小鼠糞便雙歧桿菌極顯著升高（P<0.01）；中、高劑量組小鼠糞便乳桿菌極顯著升高（P<0.01），產(chǎn)氣莢膜梭菌極顯著降低（P<0.01）；低劑量組小鼠糞便乳桿菌顯著升高（P<0.05），產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著降低（P<0.05）；其他組別小鼠糞便菌群無顯著性差異（P>0.05）。這可能與小鼠的周齡有關，隨著周齡的增長，小鼠的腸道容量也增加，從而導致腸道菌群種類和數(shù)量以及腸道環(huán)境發(fā)生變化，但總體趨勢是益生菌的含量增加，致病菌含量減少[10-11]。根據(jù)保健食品檢驗與評價技術規(guī)范中的判定標準，如果雙歧桿菌或乳桿菌明顯增加，而腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌減少或無明顯變化或增加幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌的增加幅度，則可以判定樣品在調(diào)節(jié)腸菌群功能方面具有陽性效果。根據(jù)干預后腸道菌群變化符合陽性結果判定標準的推論，可以得出,副干酪乳酪桿菌LP16 具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

2.3 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道組織病理分析

HE 染色的結果反映了各實驗組小鼠小腸的組織病理變化情況，并可以以此來評價副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸黏膜組織結構的影響。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道組織病理分析如圖3所示。

圖3 小鼠結腸組織病理學（HE 染色）Fig.3 Mouse colon histopathology（HE staining）

由圖3 可知，與對照組相比，低、中、高劑量組的小鼠結腸黏膜腺體排列整齊，上皮組織完整清晰，隱窩、杯狀細胞無損傷，無炎癥細胞浸潤，無潰瘍面。因此，可以推斷副干酪乳酪桿菌Glory LP16 沒有破壞腸黏膜組織結構，維持了腸道組織完整性，這與Pachlová 等[12]研究結果一致。

2.4 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道屏障的影響

根據(jù)已有研究，黏蛋白1（MUC1）、黏蛋白2（MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）的mRNA 表達量可以間接反映腸道屏障的功能。各組小鼠黏蛋白和緊密連接蛋白的相關mRNA 表達量表達水平比較如表2 所示。

表2 各組小鼠黏蛋白和緊密連接蛋白的相關mRNA 表達量表達水平比較Table 2 Expression of mRNAs related to mucin and tight junction proteins in mice of each group

由表2 可知，與對照組相比，副干酪乳酪桿菌組小鼠腸道MUC1、MUC2、Occludin、ZO-1與Claudin-1蛋白的mRNA 表達量都增加，差異呈顯著性（P<0.05）。隨著副干酪乳酪桿菌劑量的增加，黏蛋白和緊密連接蛋白的mRNA 表達量也隨之增加。這表明副干酪乳酪桿菌還能夠調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達，增強腸道上皮細胞之間的連接性，加強腸道屏障的完整性，副干酪乳酪桿菌通過多種機制，促進腸道屏障的功能，有助于維護腸道健康和預防腸道疾病[13]。

2.5 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道通透性的影響

在分子水平上，LPS 和D-乳酸是評估腸道屏障損傷的重要指標。LPS 通常存在于革蘭氏陰性菌的外膜中，可以增加胃腸黏膜上皮的通透性，使內(nèi)毒素能夠通過細胞旁透作用進入腸內(nèi)，從而引起細胞因子的失控性表達，加劇腸道炎癥[14]。體內(nèi)脂多糖炎癥模型是目前較為常見的腸黏膜損傷免疫應激模型[15]。本研究使用LPS 檢測試劑盒和D-乳酸檢測試劑盒分別檢測小鼠血清中LPS 和D-乳酸的含量，從而探究副干酪乳酪桿菌對小鼠腸道屏障通透性的影響，結果如圖4 所示。

圖4 腸道通透性測定Fig.4 Measurement of intestinal permeability

由圖4 可知，與對照組相比，副干酪乳酪桿菌組中LPS 和D-乳酸的含量顯著降低（P<0.05）。這表明副干酪乳酪桿菌可以有效提升腸道屏障，減少LPS 和D-乳酸的泄漏。結果表明副干酪乳酪桿菌對維護腸道屏障功能有積極影響。

2.6 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

腸道短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）也稱作揮發(fā)性脂肪酸，作為一種重要的微生物代謝產(chǎn)物，由難消化多糖的糖酵解產(chǎn)生[16]，在宿主局部環(huán)境和系統(tǒng)環(huán)境中的多個靶標中發(fā)揮著關鍵作用，特別是在腸道屏障和免疫中[17]。SCFAs 的種類和數(shù)量決定于腸道菌群和機體生理狀態(tài)等因素[18]。腸道內(nèi)SCFAs 的含量不僅可以反映腸道細菌的活力，還強烈影響著腸道細胞代謝[19]。其中乙酸、丙酸和丁酸是常見的代謝產(chǎn)物。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量如圖5 所示。

圖5 小鼠腸道短鏈脂肪酸含量Fig.5 Content of short-chain fatty acid

由圖5 可知，與對照組相比，干預14 d 后短鏈脂肪酸含量顯著提高（P<0.05）。乙酸含量明顯高于丁酸及丙酸的含量，這可能是由于副干酪乳酪桿菌通過糖類的代謝途徑產(chǎn)生乙酸。在糖類的代謝過程中，副干酪乳酪桿菌Glory LP16 將糖類分解為較小的分子，然后進一步代謝產(chǎn)生乙酸。這個過程需要多個酶的參與，包括糖類分解酶、乙酰輔酶A 合成酶等[20]。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可能具有較高的糖類代謝酶活性，導致乙酸的生成量較高[21]。丁酸和丙酸含量相對較低可能是因為副干酪乳酪桿菌Glory LP16 在其他代謝途徑上的酶活性不夠優(yōu)化。除了糖類代謝途徑，副干酪乳酪桿菌還可以通過其他代謝途徑產(chǎn)生SCFAs，如蛋白質(zhì)和脂肪的代謝[22]。然而，副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可能在這些代謝途徑上的酶活性相對較低，導致丁酸和丙酸的生成量較低。這表明副干酪乳酪桿菌Glory LP16 有助于小鼠腸道中乙酸、丙酸和丁酸的合成。

3 討論

腸道健康是當下世界持續(xù)關注的重點健康問題，維持腸道菌群在數(shù)量上和分布上的平衡狀態(tài)對維護機體健康具有重要意義[23]。本研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠生長具有積極作用，對能量的攝取和利用起著重要調(diào)節(jié)作用。攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的小鼠小腸黏膜組織結構完好，腺體排列整齊，這與田豐偉等[24]關于副干酪乳酪桿菌LC01 調(diào)節(jié)人體腸道菌群的結果一致。攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的小鼠促進了腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，根據(jù)保健食品檢驗與評價技術規(guī)范中調(diào)節(jié)腸道菌群和通便功能評價方法，可推測攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對于改善腸道微生態(tài)，促進腸道健康具有積極的作用。

腸道屏障功能對于腸道炎癥的發(fā)展至關重要[25]。黏蛋白（MUC1、MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）是構成腸黏膜屏障的重要成分，影響著腸道黏膜的通透性和完整性。黏蛋白在腸道上皮細胞表面形成黏膜屏障，當其異常表達導致屏障結構破壞時，會引發(fā)腸道炎癥的發(fā)生[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的攝入可以顯著提高黏蛋白（MUC1、MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）的mRNA 表達水平。此外，高劑量組小鼠血清中LPS 和D-乳酸的含量顯著降低，短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）含量增加。這均表明副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可以通過提高腸道屏障功能來發(fā)揮作用，從而維護腸道的完整性和健康。這一研究結果與其他類似的研究結果相似，進一步驗證了副干酪乳酪桿菌Glory LP16 在腸道屏障保護方面的作用[27-28]。

4 結論

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠生長和調(diào)節(jié)腸道菌群方面具有積極的作用，同時還能夠維護小鼠腸道組織的完整性、增強腸道屏障、改善腸道通透性，并且提高短鏈脂肪酸的含量。本研究結果為副干酪乳桿菌Glory LP16 益生菌制劑的合理應用以及保健食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。