姜佩蕓，王玉山，許舜瀅，李書紅，陳野，陳桂蕓

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

豌豆（PisumsativumL.）是全球重要栽培作物之一，富含23.10%～30.90%的蛋白質(zhì)和其他重要營養(yǎng)成分，如碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等[1-3]。豌豆蛋白是一種全價蛋白質(zhì)，包含所有人體必需的氨基酸，且賴氨酸含量豐富[4-5]。其結(jié)構(gòu)主要包括11S 球蛋白（300～400 kDa）、7S 球蛋白（150～180 kDa）以及清蛋白（5～80 kDa）[6-8]。近年來，豌豆蛋白因價格低廉、低致敏性、氨基酸譜均衡等優(yōu)點，在食品包裝、人造肉、生物材料等領(lǐng)域受到廣泛應(yīng)用。例如，豌豆蛋白制成的生物膜可替代傳統(tǒng)塑料包裝，延長食品保質(zhì)期，提高食品安全性[9-10]。在人造肉方面，由于豌豆蛋白價格低廉、無轉(zhuǎn)基因風(fēng)險、致敏性低，成為動物蛋白質(zhì)替代品的主要來源[11]。在營養(yǎng)遞送方面，豌豆蛋白可作為活性成分如益生菌、姜黃素、多酚、維生素等的載體[12]。雖然豌豆蛋白成本低、營養(yǎng)價值高、使用安全且不會引起過敏反應(yīng)，但豌豆蛋白中高含量的球蛋白（65.00%～80.00%）導(dǎo)致其溶解性差，進(jìn)而影響乳化、起泡、凝膠等功能[13]，限制了其在食品工業(yè)的深加工與開發(fā)。

為提高豌豆蛋白在工業(yè)中的利用率，有研究對豌豆蛋白進(jìn)行物理、化學(xué)和酶的改性。例如，Jiang 等[14]研究了pH 值轉(zhuǎn)換和超聲聯(lián)合過程對豌豆蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)的影響。黃科禮[15]發(fā)現(xiàn)淀粉酶酶解輔助噴射蒸煮處理工藝可制備高溶解性的豌豆蛋白。Shah等[16]通過改變豌豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，提高其溶解度、發(fā)泡能力和穩(wěn)定性、乳液穩(wěn)定性和持水性。因此，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可改善豌豆蛋白功能特性，進(jìn)一步拓寬其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

離子液體又被稱為低溫熔融鹽，是一種在室溫下呈液態(tài)的化合物，通常由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成。因其綠色、多用途的特性，被視為生物分子（如蛋白質(zhì)）的優(yōu)質(zhì)溶劑[17]。近年來，離子液體在有機(jī)合成、材料制備、萃取分離和氣體收集等領(lǐng)域展示出廣闊的應(yīng)用前景，特別在食品領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)處理方面。例如，趙剛[18]采用聚合物固載離子液體進(jìn)行生物樣品蛋白質(zhì)的分離純化。張澤宇等[19]在離子液體中制備大豆蛋白膠黏劑。張文學(xué)[20]使用超聲輔助離子液體誘導(dǎo)大豆分離蛋白分子解離和重聚集，提高其溶解度。陳甜[21]從魚鱗中提取膠原蛋白，并利用離子液體對其進(jìn)行改性處理。

目前，常用的咪唑類和吡啶類離子液體展現(xiàn)出中等或高等毒性，為了滿足綠色和安全的需求，離子液體的研究和制備逐漸向利用天然產(chǎn)物或其衍生物為原料的方向發(fā)展。膽堿是人體必需的微量營養(yǎng)素，也是一種綠色溶劑，其具有較好的溶解能力，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和食品工業(yè)中。膽堿是強(qiáng)堿，能與各種酸中和生成膽堿類離子液體，其毒性比常見的咪唑類或吡啶類離子液體低約兩個數(shù)量級[22]。張博[23]采用膽堿類離子液體溶解蠶蛹，發(fā)現(xiàn)其能易于打開蛋白質(zhì)本身的氫鍵和二硫鍵，增加其溶解性。李志勇[24]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在膽堿類離子液體中的溶解特性主要由靜電作用力和疏水作用力驅(qū)動。

本研究以豌豆蛋白為原料，研究56.00%膽堿類離子液體對提高豌豆蛋白溶解性的作用，考察氯化膽堿（[Ch][Cl]）、乙酸膽堿（[Ch][Ac]）、乳酸膽堿（[Ch][La]）、磷酸膽堿（[Ch][Ph]）、檸檬酸膽堿（[Ch][Ci]）離子液體中豌豆蛋白溶解特性、平均粒徑與泡沫穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，并通過研究豌豆蛋白的紅外光譜、紫外光譜與微觀形貌，分析膽堿類離子液體中豌豆蛋白聚集狀態(tài)與結(jié)構(gòu)變化，以期為擴(kuò)大豌豆蛋白應(yīng)用，開發(fā)高品質(zhì)食品可食包裝、組織材料提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆分離蛋白：嘉吉食品（天津）有限公司；牛血清白蛋白：北京索萊寶科技有限公司；磷酸、乳酸、乙酸（均為分析純）：天津市津科精細(xì)化工研究所；氫氧化膽堿、氯化膽堿、檸檬酸膽堿（均為分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平（BL-200A）：丹納赫西特傳感工業(yè)控制（天津）有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-200）：天津普瑞斯儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)（FD-10）：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（VECTOR22）：德國布魯克公司；粒度儀（BT-90）：丹東市百特儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（SU1510）：日本日立公司；臺式高速離心機(jī)（TD5K）：長沙東旺實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWSY21-K4）：金壇市金城國勝實驗儀器廠；pH 計（PHS-25）：上海今邁儀器儀表有限公司；超聲波清洗機(jī)（JP-040ST）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；多頭磁力加熱攪拌器（HJ-6A）：浙江恒岳儀器有限公司；密度黏度儀（BT90 型）：北京優(yōu)萊博技術(shù)有限公司；高速剪切機(jī)（FA30D）：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離子液體的制備

將氯化膽堿分別與磷酸、乙酸和乳酸3 種溶液按照質(zhì)量比1∶1 兩兩中和，振蕩均勻，配制出質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為56.00%的[Ch][Ph]、[Ch][Ac]和[Ch][La]離子液體。將[Ch][Ci]與[Ch][Cl]粉末溶于蒸餾水中，搖晃均勻，配制濃度均為56.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的[Ch][Ci]與[Ch][Cl]離子液體。

1.3.2 樣品制備

稱取0.3 g 豌豆蛋白分別溶解于10 mL 不同膽堿類離子液體中（[Ch][Cl]、[Ch][Ac]、[Ch][La]、[Ch][Ph]和[Ch][Ci]）。在25 ℃條件下，用磁力攪拌器攪拌2 h，使其充分混勻。隨后將離子液體與豌豆蛋白混合液在120 W 的功率下超聲處理30 min，并且在50 ℃條件下水浴30 min。處理后的離子液體-豌豆蛋白混合液在4 000 r/min 下離心10 min，將離心后的上清液裝入透析袋（分子量8 000～14 000 Da）中，最后將透析袋置于蒸餾水中用多頭磁力加熱攪拌器攪拌，透析48 h 后凍干成粉。相同條件下，將豌豆蛋白溶于蒸餾水作為空白對照組。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度的測定

以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照Bradford 的方法[25]，測定豌豆蛋白的溶解度。將1.3.2 中配制的豌豆蛋白-離子液體在4 000 r/min 條件下離心10 min 取上清液，上清液中蛋白質(zhì)含量與總蛋白質(zhì)含量之比為豌豆蛋白溶解性。

1.3.4 黏度的測定

將豌豆蛋白-離子液體液置于10 mL 量筒中，使用密度黏度儀測定混合液在25 ℃條件下的黏度。

1.3.5 粒徑測定

使用粒度儀測量豌豆蛋白-離子液體中豌豆蛋白的平均粒徑大小。取一定量的豌豆蛋白-離子液體以勻速離心法（4 000 r/min）進(jìn)行固-液分離，并對稀釋50 倍的上清液進(jìn)行平均粒徑測定。

1.3.6 紫外全波長掃描

取1 mg 不同離子液體處理的豌豆蛋白凍干粉復(fù)溶于10 mL 蒸餾水中，隨后將溶液置于石英比色皿中，用紫外-可見分光光度計在波長200～400 nm 范圍掃描。

1.3.7 起泡性測定

取10 mL 豌豆蛋白溶液（記作V0，mL）置于50 mL量筒中，用高速剪切機(jī)將豌豆蛋白溶液以10 000 r/min的速度剪切2 min 后，靜置1 min 并記錄樣品的總體積（標(biāo)記為V1，mL）。待靜置30 min 后重新記錄樣品總體積（標(biāo)記為V2，mL）和剩余液體的體積（標(biāo)記為V3，mL）。豌豆蛋白的起泡性（W1，%）和泡沫穩(wěn)定性（W2，%）按以下公式計算。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)I-IR）測定

將150 mg 溴化鉀與1.0 mg 凍干粉樣品混合，進(jìn)行均勻的研磨和壓片，以確保樣品的一致性。然后，將樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描分析。掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

將復(fù)溶后的豌豆蛋白溶液滴于1 cm2大小的小玻璃板上進(jìn)行充分平鋪，在室溫自然風(fēng)干。等待樣品干燥完全后將其吸附在導(dǎo)電膠上。將導(dǎo)電的樣品樣板表面納入到真空兩級射極沉積器的反傾結(jié)構(gòu)區(qū)，使用蒸發(fā)和鍍金的方式完成處理。使用掃描電子顯微鏡在15 kV 電壓下觀察處理后的豌豆蛋白形貌。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 27 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及顯著性分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同膽堿類離子液體對蛋白質(zhì)溶解度的影響

不同離子液體的pH 值和黏度如表1 所示，蛋白質(zhì)的溶解度如圖1 所示。

表1 膽堿類離子液體的pH 值與黏度Table 1 pH and viscosity of different choline ionic liquids

圖1 不同膽堿類離子溶液中豌豆蛋白的溶解度Fig.1 Solubility of pea protein in different choline ionic liquids

由表1 可知，[Ch][La]和[Ch][Ac]離子液體為強(qiáng)堿性，黏度分別為23.03 mPa·s 和42.10 mPa·s，[Ch][Ph]離子液體為弱堿性，黏度為34.80 mPa·s，[Ch][Cl]為中性，黏度為35.80 mPa·s，而[Ch][Ci]為強(qiáng)酸性，黏度為39.70 mPa·s。

由圖1 可知，空白組的豌豆蛋白溶解度為4.50%，非酸性離子液體（[Ch][La]、[Ch][Ac]、[Ch][Ph]和[Ch][Cl]）對豌豆蛋白的溶解度均有提高，尤其[Ch][Ph]的蛋白質(zhì)溶解度最高為12.70%。這可能與豌豆蛋白結(jié)構(gòu)的展開，以及蛋白質(zhì)間的疏水作用力的減小有關(guān)。有研究指出，在堿性離子液體中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會發(fā)生局部去折疊而形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)，致使蛋白質(zhì)側(cè)鏈相互作用減弱，平均粒徑減小，蛋白質(zhì)與溶液間的靜電作用增強(qiáng)，進(jìn)而顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性[26]。溶解度的提高可能還與離子液體黏度大、可以與豌豆蛋白之間形成作用力更強(qiáng)的氫鍵有關(guān)[23]。但綜合考慮，離子液體的pH 值變化相對于黏度變化而言，對于豌豆蛋白溶解特性的提升貢獻(xiàn)更大。

2.2 不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的平均粒徑

不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的平均粒徑和粒徑分布分別見圖2 和圖3。

圖2 不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白平均粒徑Fig.2 Average particle size of pea protein dissolved in different choline ionic liquids

圖3 溶解于不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of pea protein dissolved in different choline ionic liquids

由圖2、圖3 可知，天然豌豆蛋白在水溶液中的平均粒徑為981 nm。與水溶液中的豌豆蛋白相比，膽堿類離子液體可有效降低蛋白平均粒徑。[Ch][Cl]與[Ch][La]離子液體中蛋白平均粒徑顯著降至447 nm 和423 nm，[Ch][Ac]和[Ch][Ph]降至637 nm 和624 nm。此趨勢也在其他蛋白溶于離子液體研究中被報告。Yang等[27]使用離子液體1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽（[EMIM][Cl]）誘導(dǎo)了膠原蛋白解聚，平均粒徑減小。張文學(xué)[20]使用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM][PF6]）和1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BDMIM][Cl]）促使大豆分離蛋白可溶性增加，平均粒徑減小。然而，[Ch][Ci]中的豌豆蛋白平均粒徑仍為939 nm，與天然豌豆蛋白相比沒有顯著變化，這可能是因為[Ch][Ci]本身呈酸性，離子液體在促使豌豆蛋白由不溶性聚集體轉(zhuǎn)化為可溶性后，在酸性環(huán)境下發(fā)生了重聚集，從而使得[Ch][Ci]平均粒徑幾乎未下降。

2.3 不同膽堿類離子液體對豌豆蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響

溶解于不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性見圖4 和圖5，泡沫穩(wěn)定性宏觀照片見圖6。

圖4 溶解于不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的起泡性Fig.4 Foaming properties of pea protein dissolved in different choline ionic liquids

圖5 溶解于不同膽堿類離子液體中豌豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性Fig.5 Foam stability of pea protein dissolved in different choline ionic liquids

圖6 泡沫穩(wěn)定性宏觀照片F(xiàn)ig.6 Macroscopic pictures of foam stability

蛋白質(zhì)良好的溶解度是提高起泡性與泡沫穩(wěn)定性的條件之一。由圖4 和圖5 可知，天然豌豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性極差。雖然膽堿類離子液體中豌豆蛋白起泡性有所下降，但泡沫穩(wěn)定性顯著提升至600.00%。該結(jié)果表明，離子液體有效改善了豌豆蛋白的界面特性。溶解于不同離子液體中的豌豆蛋白不僅具有良好的泡沫穩(wěn)定性，其所形成的泡沫形態(tài)非常致密。圖6 為6 組樣品靜置30 min 后將其倒置的宏觀照片，可以看出[Ch][Cl]、[Ch][Ac]、[Ch][La]和[Ch][Ph]中的豌豆蛋白泡沫致密，因此可以支撐起溶液，使其無法自然流下?？傊?，離子液體改性后蛋白起泡性較空白組降低而泡沫穩(wěn)定性顯著升高（p<0.05），離子液體中蛋白形成的泡沫更不易因為空氣膨脹而發(fā)生泡沫崩潰，界面間蛋白膜的穩(wěn)定性提高。

2.4 不同膽堿類離子液體對豌豆蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的影響

不同離子液體中豌豆蛋白的紫外-可見光光譜見圖7。

圖7 膽堿類離子液體中豌豆蛋白的紫外-可見光光譜Fig.7 Ultraviolet-visible spectrum of pea protein dissolved in choline ionic liquids

蛋白質(zhì)因其具有芳香族氨基酸（苯丙胺酸、酪氨酸、色氨酸）因而在近紫外區(qū)（200～400 nm）存在特征吸收峰，可通過判斷其吸收峰的位置和強(qiáng)度變化來分析離子液體對豌豆蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的影響。由圖7 可知，豌豆蛋白在200～220 nm 和260～280 nm 有兩個明顯的紫外吸收峰，分別由肽鍵C O 基團(tuán)的n-π 躍遷和色氨酸及酪氨酸殘基躍遷引起。與水溶液中豌豆蛋白相比，[Ch][Cl]、[Ch][Ac]、[Ch][La]、[Ch][Ph]中豌豆蛋白在200～280 nm 的紫外吸收峰相較于空白組顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，離子液體能使蛋白質(zhì)的C O 基團(tuán)和酪氨酸雜環(huán)殘基暴露，影響豌豆蛋白的側(cè)鏈環(huán)境。離子液體作為低溫熔融鹽，其導(dǎo)電能力和極性改變了氨基酸殘基的環(huán)境，促使蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化中色氨酸與酪氨酸殘基等極性基團(tuán)的暴露，從而提高其溶解性。

2.5 不同膽堿類離子液體對豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

不同離子液體中溶解的豌豆蛋白在400～4 000 cm-1波長范圍內(nèi)的紅外光譜見圖8。

圖8 溶解于不同離子液體中豌豆蛋白的FI-IR 圖譜Fig.8 FT-IR spectra analysis of pea protein dissolved in different ionic liquids

由圖8 可知，豌豆蛋白酰胺I 帶吸收峰（1 660 cm-1）、C—H 對稱伸縮峰（2 960 cm-1）、O—H 與N—H 伸縮峰（3 280 cm-1）峰形未發(fā)生明顯變化，但對應(yīng)波數(shù)與峰強(qiáng)度發(fā)生了改變，說明膽堿類離子液體中豌豆蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定改變。其中3 200～3 500 cm-1范圍內(nèi)[Ch][Cl]、[Ch][La]、[Ch][Ph]、[Ch][Ci]峰強(qiáng)度降低，說明此時豌豆蛋白發(fā)生氫鍵相互作用，O—H 伸縮振動減弱。

不同離子液體對豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響見表2。

表2 膽堿類離子液體中豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)百分比變化Table 2 Percentage of secondary structure of pea protein in choline ionic liquids %

蛋白質(zhì)酰胺I 帶對應(yīng)峰的譜帶面積表征蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化[28]。由表2 可以看出，溶解于膽堿類離子液體中的豌豆蛋白的α-螺旋減少，其中[Ch][Ph]中豌豆蛋白α-螺旋由20.01%降至17.46%。α-螺旋是蛋白質(zhì)中最緊密、最穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，其含量降低意味著豌豆蛋白的整體剛性降低，蛋白鏈的靈活性提升，從而導(dǎo)致豌豆蛋白的溶解性增加。[Ch][Cl]、[Ch][Ac]、[Ch][La]、[Ch][Ph]中豌豆蛋白β-折疊含量降低，其中[Ch][Ph]中豌豆蛋白β-折疊由25.15% 降至23.03%，說明這4 種離子液體會誘導(dǎo)豌豆蛋白去折疊。有研究表明，β-折疊含量或許與蛋白質(zhì)亞基的疏水相互作用有關(guān)，疏水相互作用的變化會導(dǎo)致β-折疊含量變化[29]。綜上所述，α-螺旋和β-折疊的減少均有利于蛋白質(zhì)疏水性降低，這與之前關(guān)于蛋白質(zhì)溶解度增加的結(jié)論一致。膽堿類離子液體中β-轉(zhuǎn)角含量的增多，[Ch][Ph]中豌豆蛋白β-轉(zhuǎn)角由35.67% 增至40.08%，說明豌豆蛋白形成了更多的無序結(jié)構(gòu)。

2.6 不同膽堿類離子液體對豌豆蛋白微觀形貌的影響

不同離子液體中豌豆蛋白的掃描電子顯微鏡圖（放大倍數(shù)5 000 倍）見圖9。

圖9 豌豆蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig.9 Scanning electron microscopy images of pea protein

由圖9 可知，天然豌豆蛋白為球狀聚集物，表面較為平整（圖9 a）。不同離子液體溶解的豌豆蛋白表面均呈現(xiàn)出不同程度的凹陷且平均粒徑均減小，其中[Ch][Cl]中的豌豆蛋白，表面出現(xiàn)向內(nèi)凹陷（圖9 b）。[Ch][Ac]與[Ch][La]中的豌豆蛋白表面坑洼程度進(jìn)一步加劇，[Ch][Ph]中的豌豆蛋白表面出現(xiàn)了大量細(xì)小孔洞，表面粗糙（圖9 e）更為雜亂，且為小顆粒聚集。[Ch][La]與[Ch][Ph]對豌豆蛋白的凝聚狀態(tài)影響最明顯，這一現(xiàn)象與紅外光譜、紫外光譜的結(jié)果一致，與離子液體促進(jìn)了豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)無序化和三級結(jié)構(gòu)的展開有正相關(guān)性。離子液體可顯著降低蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)，增大蛋白凝聚物的比表面積，該形貌有利于提高蛋白的溶解性。[Ch][Ci]中的豌豆蛋白（圖9 f）平均粒徑幾乎沒有改變，且表面光滑平整，有聚集現(xiàn)象，這也進(jìn)一步解釋了酸性的[Ch][Ci]離子液體會導(dǎo)致豌豆蛋白的聚集，溶解度反而下降的原因。

3 結(jié)論

[Ch][Cl]、[Ch][Ac]、[Ch][La]、[Ch][Ph]離子液體中豌豆蛋白溶解性、泡沫穩(wěn)定性和平均粒徑均有明顯改善，其中[Ch][Ph]對豌豆蛋白的功能性改善效果最佳，蛋白質(zhì)的溶解度增加至12.70%，泡沫穩(wěn)定性增加至600.00%。這與上述膽堿類離子液體呈堿性、溶液黏度大以及促使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。在離子液體中，豌豆蛋白凝聚狀態(tài)改變，發(fā)色基團(tuán)的暴露，蛋白結(jié)構(gòu)趨于無序，蛋白凝聚具有更小的平均粒徑和更大的比表面積。總之，膽堿類離子液體是一種提高豌豆蛋白溶解性和泡沫穩(wěn)定性的良好溶劑。本文制備的豌豆蛋白-離子液體具有較高的溶解性，對擴(kuò)大豌豆蛋白應(yīng)用性，進(jìn)一步開發(fā)食品可食包裝、組織材料等領(lǐng)域有一定的理論價值。