沈建,張昕,焦陽,宿永康,李影,周伯寧,沈明志,付振虹*

(1解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853; 2通州離職干部休養(yǎng)所門診部,北京 101149;3中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院心血管內(nèi)科,海南 三亞 572013)

《中國心血管疾病與健康報告2022》顯示我國冠心病患者1139萬[1]。急性心肌梗死預(yù)后不佳,早期介入及溶栓等再灌注治療可明顯提升生存率,但心肌梗死后遠期心血管事件高發(fā)[2]。急性心肌梗死后心肌細胞嚴(yán)重缺血、缺氧,能量代謝障礙,線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)破壞,加重心肌損傷[3,4]。沙庫巴曲纈沙坦(sacubitril/valsartan,S/V)是首個血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑,研究顯示其在細胞及動物水平可能通過抑制炎癥反應(yīng),減輕線粒體損傷,抑制纖維化等途徑發(fā)揮心臟保護作用[5,6],但其對心肌細胞直接保護作用和早期應(yīng)用后對線粒體動力學(xué)系統(tǒng)調(diào)控作用未有報道。本研究通過構(gòu)建H9c2心肌細胞糖氧剝奪模型,探究S/V調(diào)節(jié)線粒體動力系統(tǒng)減少心肌細胞損傷的潛在機制,旨在為急性心肌梗死早期藥物保護策略提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S/V購自MCE公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天公司;Annexin V/PI雙染細胞凋亡試劑盒,線粒體膜電位檢測試劑盒購自貝博公司;B細胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)抗體、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl2-associated X,Bax)抗體、線粒體融合蛋白1(mitofusin 1,Mfn1)抗體、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)抗體、動力相關(guān)蛋白 1(dynamin-related protein 1,Drp1)抗體、線粒體分裂蛋白1(fission 1,Fis1)抗體、細胞色素C(cytochrome C,CytC)抗體和二抗購自武漢三鷹技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細胞培養(yǎng)、糖氧剝奪模型建立及實驗分組 完全培養(yǎng)基由杜爾貝科改良培養(yǎng)基加入10%胎牛血清、100U/ml鏈霉素和青霉素配制。H9c2心肌細胞在恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。糖氧剝奪模型由H9c2心肌細胞培養(yǎng)至細胞融合度達到80%～90%,將完全培養(yǎng)基替換為等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),缺氧孵箱(94%N2,5%CO2,1%O2)孵育4h。根據(jù)實驗?zāi)康姆謱φ战M、造模組、藥物組。對照組正常培養(yǎng)心肌細胞,造模組采用糖氧剝奪模型(glucose oxygen deprivation,OGD)建模,藥物組采用OGD建模后加用S/V20mol/L干預(yù)處理,每組重復(fù)5遍。

1.2.2 細胞凋亡檢測 采用AnnexinV/PI雙染法通過流式細胞技術(shù)進行心肌細胞凋亡檢測。心肌細胞培養(yǎng)后建模。胰酶消化后離心,棄上清,預(yù)冷PBS洗滌2次,加入400μl Annexin V-FITC染色液避光孵育15min,加入5μl PI染色液避光孵育5min,流式細胞儀檢測。

1.2.3 ROS檢測 通過流式細胞技術(shù)進行ROS檢測,平均熒光強度反應(yīng)心肌細胞ROS水平。采用ROS檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS含量。心肌細胞培養(yǎng)后建模。去除培養(yǎng)液,加入1ml 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)稀釋液孵育20min。洗滌細胞3次,去除未進入細胞內(nèi)DCFH-DA。使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 線粒體膜電位檢測 通過熒光顯微鏡檢測各組紅色熒光強度與綠色熒光強度比值反應(yīng)心肌細胞線粒體膜電位水平。心肌細胞培養(yǎng)后建模。PBS洗滌1次,每孔加入400μl JC-1檢測工作液孵育20min。PBS洗滌3次進行熒光檢測。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡 通過蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)測定心肌細胞線粒體相關(guān)蛋白表達水平。提取細胞蛋白,采用BCA法測量蛋白濃度,凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉2h,4℃孵育一抗過夜,室溫與抗兔二抗孵育2h。采用超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光分析。采用Image J軟件分析蛋白相對表達量。一抗稀釋比分別為Mfn2(1∶1000)、Mfn1(1∶1000)、Drp1(1∶1000)、Fis1(1∶1000)、CytC(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Caspase3(1∶1000)、β-actin(1∶1000)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 糖氧剝奪模型建立及細胞形態(tài)學(xué)影響

缺氧孵箱孵育4h建模。光鏡下觀察對照組心肌細胞形態(tài)良好,細胞質(zhì)飽滿,細胞膜無皺縮,無凋亡小體形成;造模組心肌細胞形狀不規(guī)則,細胞核皺縮明顯,可見大量壞死及凋亡小體;藥物組心肌細胞形態(tài)及活細胞數(shù)量較造模組有所增加,凋亡小體較造模組明顯減少(圖1A)。

圖1 心肌細胞形態(tài)學(xué),活性氧及細胞凋亡變化Figure 1 Changes of cardiomyocytes morphology,ROS and apoptosis

2.2 S/V處理對心肌細胞線粒體影響

與對照組(12.37±0.14)相比,造模組紅色熒光強度/綠色熒光強度比值(0.89±0.01)明顯降低,提示膜電位明顯降低(P<0.05);與造模組相比,藥物組紅色熒光強度/綠色熒光強度比值(3.43±0.01)明顯升高,提示膜電位較造模組顯著升高(P<0.05;圖2,圖3A)。與對照組相比,造模組線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn2、Mfn1表達明顯降低,線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1表達明顯升高,細胞質(zhì)CytC表達明顯升高(P<0.05);與造模組相比,藥物組線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn2、Mfn1表達明顯升高,線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1表達明顯下降,細胞質(zhì)CytC表達明顯下降(P<0.05;圖4)。

圖2 心肌細胞線粒體膜電位變化Figure 2 Changes of mitochondrial membrane potential in cardiomyocytes

圖3 心肌細胞線粒體膜電位、ROS、細胞凋亡及凋亡蛋白表達量變化Figure 3 Changes of mitochondrial membrane potential, ROS, apoptosis protein expression in cardiomyocytes

圖4 心肌細胞線粒體相關(guān)蛋白表達量變化Figure 4 Relative expression of mitochondrial related proteins in cardiomyocytes

2.3 S/V處理對心肌細胞ROS影響

與對照組(5506.0±128.1)相比,造模組平均熒光強度(12659.0±144.6)提示細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05);與造模組相比,藥物組平均熒光強度(6400.0±284.0)提示細胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05;圖1B,圖3B)。

2.4 S/V處理對心肌細胞凋亡影響

與對照組[(5.79±0.20)%]相比,造模組心肌細胞凋亡率[(44.80±0.80)%]顯著增加(P<0.05);與造模組相比,藥物組心肌細胞凋亡率[(24.53±0.49)%]明顯降低(P<0.05;圖1C,圖3C)。與對照組相比,造模組凋亡藥物相關(guān)蛋白Bcl2表達明顯降低,Bax及Caspase3表達明顯升高(P<0.05);與造模組相比,藥物組處理組后,Bcl2表達明顯升高,Bax及Caspase3表達明顯下降(P<0.05;圖3D～G)。

3 討 論

急性心肌梗死是冠心病中致殘和致死率最高的疾病,盡管急診開通梗死相關(guān)血管可極大提高患者存活率,但資料顯示2002-2020年AMI死亡率總體仍呈上升態(tài)勢。AMI后壞死心肌無法再生,主要不良心血管事件發(fā)生率高[1,7]。本研究以大鼠H9c2心肌細胞為研究對象,首次證實S/V可以通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)系統(tǒng),維持線粒體穩(wěn)態(tài)及能量代謝,降低ROS,抑制心肌細胞凋亡,發(fā)揮直接的缺氧心肌細胞保護作用。

S/V是首個臨床應(yīng)用的血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑類藥物。臨床研究顯示,在射血分?jǐn)?shù)減少慢性心力衰竭患者中,S/V較依那普利顯著降低心血管死亡和心力衰竭住院風(fēng)險[8,9];在射血分?jǐn)?shù)保留慢性心力衰竭患者中,與纈沙坦相比,S/V可進一步降低主要復(fù)合終點事件風(fēng)險,降低氨基末端腦利鈉肽前體水平,減小左心房容積,改善紐約心功能分級,存在臨床獲益[10];在急性心力衰竭患者中,S/V相比依那普利,嚴(yán)重復(fù)合終點事件發(fā)生風(fēng)險降低46%,早期服用沙庫巴曲纈沙坦治療較血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類制劑可能受益更大[11];在急性心肌梗死患者中,與雷米普利相比,S/V治療組的主要終點事件發(fā)生率降低10%,總體事件發(fā)生率減低,具有良好的安全性和耐受性[12]。

在基礎(chǔ)研究中,細胞和動物水平提示,S/V可以通過抑制炎癥反應(yīng)、減少膠原纖維沉積進而改善心肌纖維化,減少心肌梗死或缺血再灌注損傷對心臟損害[13,14],提示S/V對急性心肌梗死微環(huán)境具有潛在保護作用。線粒體在提供能量代謝、減少氧化應(yīng)激、改善凋亡等方面發(fā)揮重要作用,心肌梗死狀態(tài)下預(yù)防線粒體功能障礙是心臟保護的重要治療策略[3,4]。Yeh等[14]提示S/V可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體功能完整性保護大鼠心肌細胞和心功能狀態(tài),Xia等[15]提示S/V通過減輕Drp1介導(dǎo)線粒體功能障礙改善擴張型心肌病小鼠心功能。然而,S/V對心肌梗死后心肌細胞的直接作用研究未見報道。本研究聚焦于S/V對心肌細胞線粒體動力系統(tǒng)調(diào)節(jié),探討其對心肌細胞凋亡影響。通過構(gòu)建糖氧剝奪心肌細胞模型模擬心肌梗死微環(huán)境狀態(tài),探究S/V對心肌細胞線粒體動力學(xué)的影響及可能機制,結(jié)果提示S/V可能通過抑制線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1表達提升線粒體融合Mfn1、Mfn2表達水平,改善線粒體動力學(xué)平衡,提升線粒體膜電位水平,抑制ROS產(chǎn)生,進而減少線粒體內(nèi)CytC釋放,抑制心肌細胞凋亡通路激活。這一研究結(jié)果提示維持線粒體動力系統(tǒng)穩(wěn)定,抑制線粒體過度分裂,促進線粒體融合可能抑制缺血缺氧環(huán)境下心肌細胞凋亡。

綜上,本研究結(jié)果顯示,S/V可在細胞水平通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)狀態(tài),達到改善心肌凋亡的作用,但對其具體分子機制缺乏深入研究,且未進行動物水平的實驗驗證,后續(xù)我們將對其進行進一步實驗研究和補充。