韓鑫　郭金菊　張惠堯　吳廷全　張長(zhǎng)遠(yuǎn)

摘? ? 要：以苦瓜八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene dehydrogenase，PDS）基因?yàn)榘袠?biāo)，構(gòu)建其特異gRNA的CRISPR/Cas9基因編輯載體，以期為建立苦瓜CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。以苦瓜自交系B07葉片cDNA為模板，同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。結(jié)果表明，McPDS基因CDS序列全長(zhǎng)1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為64.44 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為7.09?？缒そY(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白為親水性非跨膜蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，McPDS與黃瓜、甜瓜等葫蘆科植物中的PDS蛋白同源性較高。此外，以McPDS為靶標(biāo)基因，在5端篩選2個(gè)高特異性靶點(diǎn)，經(jīng)設(shè)計(jì)引物，成功構(gòu)建1個(gè)雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯載體，為苦瓜基因編輯體系的建立奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦瓜；McPDS；基因克隆；載體構(gòu)建；基因編輯

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）03-020-08

Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS in bitter gourd（Momordica charantia L.）

HAN Xin1， 2， GUO Jinju1， ZHANG Huiyao1， WU Tingquan1， ZHANG Changyuan1

（1. Institute of Facility Agriculture， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， Guangdong， China; 2. College of Horticulture & Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase （PDS） gene of bitter gourd was constructed， hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing technology system of bitter gourd. In this study， the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred line B07. The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp， encoded 576 amino acids，the theoretical relative molecular weight was 64.44 kD， and the theoretical isoelectric point（PI） was 7.09. The transmembrane structure analysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein. Phylogenetic analysis showed that McPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon. In addition， using McPDS as the target gene， two highly specific targets were screened at the 5' end， primers were designed， and a double-target CRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed， which laid a technical foundation for the establishment of bitter gourd gene editing system.

Key words： Bitter gourd；McPDS；Gene cloning；Vector construction；Gene editing

苦瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica charantia L.）一年生攀緣草本植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1-3]。苦瓜藥膳兼用，富含維生素、膳食纖維、粗蛋白、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和皂苷、酚類(lèi)、類(lèi)黃酮、多糖等化合物[4]，具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多種藥理作用[5-6]，深受廣大消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)前景廣闊。

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene dehydrogenase，PDS）是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，與ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和類(lèi)胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）共同催化八氫番茄紅素合成番茄紅素，影響番茄紅素及下游類(lèi)胡蘿卜素的生成[7-8]。PDS基因編碼的蛋白主要位于葉綠體的類(lèi)囊體膜上，對(duì)葉綠體具有光保護(hù)作用，其功能的缺失會(huì)導(dǎo)致葉綠素降解，造成光漂白現(xiàn)象[9]。由于該表型明顯，易于觀察，PDS基因常被用作報(bào)告基因，建立病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）體系和基因編輯技術(shù)體系等，對(duì)基因功能研究和作物遺傳改良具有重要意義[10]。

CRIPSR/Cas9系統(tǒng)是新近發(fā)展起來(lái)的一種高效、精準(zhǔn)的基因組編輯技術(shù)，已成功應(yīng)用于擬南芥、煙草和水稻等多個(gè)物種中，實(shí)現(xiàn)了基因定向編輯[11]。目前該技術(shù)正在被廣泛應(yīng)用于植物基因功能鑒定和品種改良等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。Zeng等[12]利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻的PIN5b、GS3和MYB30基因同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得的突變體分別表現(xiàn)出穗長(zhǎng)增加、粒徑增大和耐寒性增強(qiáng)等特點(diǎn)。Santosh等[13]利用CRISPR/Cas9方法在秈稻CV.MTU1010基因組中創(chuàng)建了突變等位基因DST?184-305，該基因有助于提高秈稻品種的耐旱耐鹽性和產(chǎn)量。在番茄中，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SP5G、SlMYB12、AGL6等基因，可使果實(shí)產(chǎn)量快速提升[14]、高效獲得粉紅果色番茄[15]和無(wú)籽果實(shí)[16]。馬存發(fā)等[17]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除青花菜的BoSP11基因，創(chuàng)制了花期自交親和材料。

目前，利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)對(duì)苦瓜基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯的研究還未見(jiàn)報(bào)道。筆者以苦瓜自交系B07葉片為試材，采用RT-PCR技術(shù)同源克隆苦瓜McPDS基因，對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析，并以該基因?yàn)榘袠?biāo)，利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建雙靶點(diǎn)基因編輯載體，以期為苦瓜基因編輯體系的建立及農(nóng)藝性狀的定向改良奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用植物材料B07是由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所選育的高世代、大頂類(lèi)型苦瓜自交系，于2023年3月下旬種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地，常規(guī)管理。于幼苗四葉一心時(shí)，取其嫩葉立即放入液氮速凍，并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation System Kit（Promega，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Kit（TaKaRa，日本），DNA凝膠回收試劑盒（TIANGEN，德國(guó)），pMD-19T Vector、T4 DNA連接酶（TaKaRa，日本），限制性?xún)?nèi)切酶BsaI（NEB，美國(guó)），質(zhì)粒小提中量試劑盒（TIANGEN，德國(guó)），大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 McPDS基因克隆

提取苦瓜葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)McPDS基因序列特異性引物，引物序列如下：McPDS-F：ATGTCACTATGTGGATCTGTCTCTG；McPDS-R：TCACCGAACGCCCGCCTCAGC。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：PrimeSTAR Max Premix （2X） 10 μL，引物McPDS-F/R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板（cDNA）1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠、純化回收目的片段。

目的片段加A尾后連接至克隆載體pMD19-T。連接反應(yīng)體系及條件：pMD19-T Vector 1 μL，目的片段4 μL，SolutionⅠ 5 μL，16 ℃連接30 min。采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 mg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，篩選到的陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 McPDS蛋白生物信息學(xué)分析

利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)分析McPDS蛋白的理化性質(zhì)；利用ProtScale（http：//web.expasy.or g/protscale/）對(duì)McPDS蛋白進(jìn)行親水性分析；通過(guò)在線(xiàn)軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析McPDS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用TMHMM 2.0 Server （TMHMM 2.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）分析McPDS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；通過(guò)Signal P 4.1 Server （SignalP 4.1 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）預(yù)測(cè)McPDS蛋白信號(hào)肽；分別利用PRABI（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Swiss-Model（Swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)McPDS蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；采用ClustalW和MEGA-X軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

1.4.1 gRNA靶點(diǎn)選擇和靶標(biāo)引物設(shè)計(jì) 利用在線(xiàn)網(wǎng)站CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）進(jìn)行靶位點(diǎn)選擇，最終篩選出2個(gè)靶位點(diǎn)，序列分別為：靶標(biāo)1：GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG；靶標(biāo)2：AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根據(jù)靶點(diǎn)序列合成相應(yīng)的靶點(diǎn)引物，序列如下：CrMcPDS-F：CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAGCATCTCGAGGT；CrMcPDS-R：CAGTGGTCTCAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。

1.4.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建 利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R擴(kuò)增“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Biorun Pfu PCR Mix 25 μL，CrMcPDS-F 1 μL，CrMcPDS-R 1 μL，模板（SEQ1）1 μL，Nuclease-free Water 補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的片段經(jīng)切膠、回收后，酶切連接至載體PHsbdcas9i，獲得pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表達(dá)載體。酶切連接體系：10×Buffer 2 μL，BsaⅠ 1 μL，T4_ligase 1 μL，PHsbdcas9i 4 μL，膠回收產(chǎn)物 4 μL，Nuclease-free Water 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 20 min；37 ℃ 10 min，20 ℃ 10 min，循環(huán)5次；37 ℃ 20 min，80 ℃ 5 min。上述使用的模板SEQ1序列為：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。

取5～10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于卡那霉素抗性平皿中，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑斑，利用引物zmpl-chen-F/zmpl-chen-R進(jìn)行菌斑PCR，目的片段長(zhǎng)度約800 bp。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Biorun Magic PCR Mix 12.5 μL，M13F（100 μmol·L-1）1 μL，zmpl（100 μmol·L-1）1 μL，模板1 μL， Nuclease-free Water 補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。篩選到陽(yáng)性克隆后，利用引物zmpl-chen-F進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒。引物序列為：zmpl-chen-F：gtaaaacgacggccagt；zmpl-chen-R：ccagaaattgaacgccgaag。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜葉片總RNA提取

利用植物總RNA提取試劑盒提取苦瓜葉片總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳獲得2條清晰條帶（圖1），RNA質(zhì)量濃度為366.534 ng·μL-1，A260/A280和A260/A230比值分別為2.18和2.27。結(jié)果表明，RNA純度較高，完整性好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 苦瓜McPDS基因克隆

將上述提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，利用引物McPDS-F/McPDS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶約1700 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，凝膠電泳結(jié)果如圖2-A所示。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，加A尾，連接至克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h。挑取單菌落，37 ℃、200 r·min-1搖菌，PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性單克?。▓D2-B），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)度1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸與甜瓜PDS基因編碼的氨基酸（NP_001284459.1）同源性高達(dá)93.58%，將該基因命名為McPDS。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 苦瓜McPDS蛋白理化性質(zhì)分析 利用Protparam在線(xiàn)軟件分析苦瓜McPDS蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果表明，苦瓜McPDS蛋白分子式為C2908H4568N772O829S26，相對(duì)分子質(zhì)量為64.44 kDa，其帶正、負(fù)電荷殘基數(shù)均為69，理論等電點(diǎn)（PI）為7.09，表明苦瓜McPDS為中性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)為44.05（>40），屬不穩(wěn)定蛋白。McPDS脂溶指數(shù)為92.08。

利用ProtScale對(duì)苦瓜McPDS進(jìn)行蛋白親/疏水性分析，總平均親水性值為-0.154。一般而言，蛋白中氨基酸分值與其親水性呈負(fù)相關(guān)?？喙螹cPDS蛋白氨基酸序列中第151位的分值最低（-2.667），親水性值最強(qiáng)，而第111位因具最高分值（2.367），相應(yīng)具最強(qiáng)的疏水性?？喙螹cPDS蛋白整個(gè)多肽鏈中親水性氨基酸呈均勻分布，疏水性區(qū)域不明顯，推測(cè)McPDS為親水性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，McPDS蛋白具有1個(gè)保守的PDS結(jié)構(gòu)域（PLN02612）（圖3）。

2.3.2 苦瓜McPDS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 采用TMHMM 2.0 Server在線(xiàn)軟件對(duì)苦瓜McPDS蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，McPDS蛋白無(wú)跨膜區(qū)，屬非跨膜蛋白。SignalP-4.1預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，苦瓜McPDS蛋白存在信號(hào)肽的概率僅為0.45%，說(shuō)明苦瓜McPDS為非分泌蛋白。

2.3.3 苦瓜McPDS蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，苦瓜McPDS蛋白由41.32%的α-螺旋、38.89%的無(wú)規(guī)則卷曲、15.28%的延伸主鏈和4.51%的β-折疊組成（圖4）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和同源建模分析表明，苦瓜McPDS基因編碼的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與番木瓜八氫番茄紅素脫氫酶PDB ID：Q0PQZ4.1.A蛋白序列一致性高達(dá)83.33%，覆蓋度為100%（圖5）。

2.3.4 PDS蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將McPDS基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，其與黃瓜、南瓜、甜瓜、冬瓜的同源性分別為95.1%、94.3%、94.1%、93.8%，同源性較高。利用ClustalX和MEGA-X軟件，將McPDS基因編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的15種植物中的PDS序列構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，苦瓜McPDS與甜瓜、黃瓜、冬瓜和南瓜等其他葫蘆科作物的PDS蛋白聚為同一支，親緣關(guān)系較近（圖6）。

2.4 苦瓜McPDS基因編輯載體構(gòu)建

利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R擴(kuò)增gRNA表達(dá)盒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖7-A），目的片段純化回收后，采用Golden Gate克隆法構(gòu)建pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表達(dá)載體，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板，利用引物zmpl-chen-F/R檢測(cè)陽(yáng)性單克隆，目的片段大小約800 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖7-B）。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果表明，“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列成功連接至植物表達(dá)載體pHSbdcas9i（圖7-C）。以上結(jié)果表明基因編輯載體pHSbdcas9i-Cr-PDS構(gòu)建成功（圖7-D）。

將pHSbdcas9i-Cr-PDS提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，涂布于卡那霉素+利福平抗性的固體LB培養(yǎng)基中，菌落生長(zhǎng)狀態(tài)如圖8-A所示。挑選出3個(gè)單克隆利用引物zmpl-chen-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小約800 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖8-B）。挑取陽(yáng)性單克隆于卡那霉素+利福平抗性的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，按體積比1∶1加入60%甘油，于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化。

3 討論與結(jié)論

基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)育種的主流方式，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、編輯效率高，以及成本低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于作物育種研究中，在品質(zhì)改良，提高產(chǎn)量，增強(qiáng)抗病、抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用[18]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于水稻[12]、大豆[19]、番茄[20]、西瓜[21]、香蕉[22]、柑橘[23]等作物的遺傳改良。

八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）是植物類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，通過(guò)在植物體內(nèi)積累八氫番茄紅素來(lái)影響花、葉、果實(shí)中的類(lèi)胡蘿卜素含量[24-25]。PDS基因敲除或者功能喪失能夠影響類(lèi)胡蘿卜素合成代謝，導(dǎo)致植株白化[9]，可以用來(lái)作為判定植物基因編輯技術(shù)體系是否成功建立的標(biāo)記。舒海燕等[26]對(duì)菠蘿八氫番茄紅素脫氫酶基因Aco-PDS1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，突變株系的白化表型表明了Aco-PDS1基因成功進(jìn)行了編輯突變，以此來(lái)判定菠蘿CRISPR-Cas9系統(tǒng)的成功建立。胡春華等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除香蕉內(nèi)源性八氫番茄紅素脫氫酶基因，成功獲得了香蕉白化突變株系。這些研究均表明了PDS基因在VIGS和CRISPR/Cas9等研究中的重要作用。

苦瓜作為重要的嶺南特色瓜類(lèi)蔬菜，分子生物學(xué)研究起步較晚，相比黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物，分子研究基礎(chǔ)薄弱。截止到目前，尚未建立完善的苦瓜基因編輯體系。筆者以苦瓜自交系B07為材料，首次克隆出苦瓜McPDS基因，該基因cDNA序列全長(zhǎng)為1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸?？喙螹cPDS基因編碼的氨基酸序列與甜瓜、黃瓜、冬瓜和南瓜等其他葫蘆科作物PDS蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性，均在80%以上，說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。

筆者以McPDS為靶標(biāo)基因，在5端編碼區(qū)位置設(shè)計(jì)2個(gè)靶位點(diǎn)，通過(guò)Golden Gate方法構(gòu)建了1個(gè)雙靶點(diǎn)基因編輯載體。目前，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯載體已在很多作物中成功構(gòu)建。陳博雯等[27]構(gòu)建了尾葉桉EuCAD基因的雙靶點(diǎn)基因編輯載體，并利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系對(duì)基因編輯效果進(jìn)行驗(yàn)證。由于苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，筆者構(gòu)建的基因編輯載體pHSbdcas9i-Cr-PDS尚未進(jìn)行基因編輯效率的驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前植物中應(yīng)用最為廣泛的基因轉(zhuǎn)化方法，具有操作簡(jiǎn)單、能穩(wěn)定復(fù)制及表達(dá)等優(yōu)勢(shì)[28]。因此，利用本研究中構(gòu)建的pHSbdcas9i-Cr-PDS編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立苦瓜基因編輯體系，是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，筆者克隆了苦瓜McPDS基因，并成功構(gòu)建了1個(gè)雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯載體，填補(bǔ)了苦瓜在基因編輯研究方面的空白，為后續(xù)建立苦瓜基因編輯體系，并利用該體系研究苦瓜基因功能及定向改良苦瓜重要農(nóng)藝性狀奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-11-27；修回日期：2024-01-12

基金項(xiàng)目：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XTXM202203）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202206010170，202201010493）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022A1515010343）；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳種業(yè)振興行動(dòng)專(zhuān)項(xiàng)（2022-NPY-00-027）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金項(xiàng)目（202301）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（202130TD）

作者簡(jiǎn)介：韓? ? 鑫，女，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：hanxin7026@163.com

通信作者：張長(zhǎng)遠(yuǎn)，男，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：zcy79130@163.com