李鵬飛　陳子豪　張敏娟　豆峻嶺　楊森　劉東明　牛歡歡　楊路明

摘 要：以8種基因型西瓜為試驗(yàn)材料，通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同基因型材料的發(fā)芽率、不定芽誘導(dǎo)率，篩選出再生能力較強(qiáng)的基因型，并以其為材料對(duì)種子播種后培養(yǎng)時(shí)間、外植體造傷方式、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間及侵染方式等進(jìn)行優(yōu)化篩選，旨在建立高效的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，在播種2 d時(shí)，YL、CYY298、CYY171及CYY137之間的種子發(fā)芽率差異不顯著且均顯著高于其他材料，但在不同濃度GA3誘導(dǎo)下，YL外植體的不定芽誘導(dǎo)率均最高；以YL材料為基礎(chǔ)進(jìn)行體系優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)播種2 d后的種子狀態(tài)最適于侵染；刀片劃傷后的外植體熒光亮度最強(qiáng)，熒光率最高達(dá)74.9%；菌液濃度OD600=0.8，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，外植體分化狀態(tài)最佳且熒光率最高為70.3%；真空負(fù)壓方式可以顯著提高侵染效率，外植體熒光率可達(dá)71.8%，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)60.2%；分化培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1的GA3后不定芽的誘導(dǎo)率最高為74%；生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1的IBA時(shí)生根率最高，平均生根數(shù)最多。

關(guān)鍵詞：西瓜；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率；體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）03-09-11

Optimization of the genetic transformation system in watermelon

LI Pengfei，CHEN Zihao，ZHANG Minjuan，DOU Junling， YANG Sen， LIU Dongming， NIU Huanhuan，YANG Luming

（Horticulture College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract： In this study， eight watermelon genotypes were used as experimental materials， the germination rates and adventitious buds induction rates of different genotypes were counted and analyzed to screen out the optimal genotype with strong regeneration ability. The efficient watermelon genetic transformation system was optimized and screened through different sowing times， explant injury methods， bacterial liquid concentration， co-culture time， infection methods and other factors. The results showed that the seed germination rates of YL， CYY298， CYY171 and CYY137 had no difference and were significantly higher than that of other materials at 2 days of seeding， but the germination induction rate of YL was the highest at different concentrations of GA3. The system was optimized based on YL material， and it was found that the seed germination state was the best and most suitable for infection after 2 days of sowing. The fluorescence brightness of the explants after scratching the blade was the strongest， and the fluorescence rate was up to 74.9%. When the concentration of bacterial solution was OD600=0.8 and the co-culture time was 3 days， the explants were in the best differentiation state and the fluorescence rate was the highest at 70.3%. The infection efficiency can be significantly improved by negative pressure infection， and the fluorescence rate of explants can reach 71.8%， and the callus induction rate can reach 60.2%. The induction of adventitious shoots was up to 74% after the addition of 0.5 mg·L-1 GA3 to the differentiation medium.The highest rooting rate and the highest average number of roots were observed when 0.5 mg·L-1 of IBA was added to the rooting medium.

Key words： Watermelon; Genetic transformation; Transformation efficiency; System optimization

西瓜（Citrullus lanatus）是最受歡迎的園藝作物之一，因果肉多汁和口感甜美而備受消費(fèi)者青睞。西瓜栽培歷史悠久，地域廣泛，近年來(lái)隨著種植面積和產(chǎn)量的增加，個(gè)性化育種需求也在不斷增加。高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)于改良西瓜品種具有巨大潛力[1]。大量研究表明，西瓜是一種較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的作物，轉(zhuǎn)化效率低仍是目前阻礙西瓜轉(zhuǎn)基因的主要難題[2]。傳統(tǒng)育種方法在西瓜優(yōu)良性狀改良中存在育種周期長(zhǎng)、難度大和遺傳性狀不穩(wěn)定等問(wèn)題，因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良西瓜性狀尤為重要。盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)在許多作物上已取得突破，但在西瓜中的應(yīng)用進(jìn)展緩慢且大部分研究仍集中在如何提高轉(zhuǎn)化效率方面。因此，通過(guò)優(yōu)化影響西瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素，建立高效穩(wěn)定的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)創(chuàng)制優(yōu)良西瓜種質(zhì)具有重要意義[3]。

植物遺傳轉(zhuǎn)化是一種通過(guò)將外源基因或DNA片段有目的地插入到受體植物基因組中，通過(guò)再生體系誘導(dǎo)獲得新植株的技術(shù)[4-5]。目前，遺傳轉(zhuǎn)化主要使用基因槍法[6-7]、花粉管通道法[8]、DNA浸胚法[9-10]和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[11-15]等技術(shù)手段將外源基因?qū)胫参锘蚪M，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最為常用，具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高和遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)[16]。農(nóng)桿菌能夠?qū)y帶外源基因的Ti質(zhì)粒上的一段DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，并整合到植物基因組中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)[17-18]。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染，實(shí)現(xiàn)了外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，進(jìn)一步利用植物細(xì)胞的全能性，通過(guò)細(xì)胞或組織培養(yǎng)，最終由一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成完整的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，可以向西瓜中導(dǎo)入具有抗病性[19]、耐逆性[20]、提高產(chǎn)量和品質(zhì)[21]等優(yōu)良性狀的外源基因，從而改良或增加西瓜的優(yōu)異性狀。然而，目前西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化研究仍處于起步階段，急需進(jìn)一步優(yōu)化。

西瓜離體再生能力和轉(zhuǎn)化效率受多種因素的影響，包括種子貯存時(shí)間[22]、基因型[23]、苗齡[24]、外植體類(lèi)型[25-26]和子葉部位[27]等內(nèi)部因素，以及培養(yǎng)基中激素種類(lèi)如6-卞基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和濃度[24，28]、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[28]、共培養(yǎng)條件[29-30]等外部因素。筆者以8個(gè)基因型西瓜為試驗(yàn)材料，通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同基因型種子的發(fā)芽率、不定芽誘導(dǎo)率，最終篩選出YL為最優(yōu)受體材料。以YL材料為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中激素濃度、侵染方式、外植體造傷方式、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出高效且穩(wěn)定的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為西瓜基因功能研究及優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料及地點(diǎn)

供試西瓜材料共8種，分別為YL、M08、CYY171、CYY298、CYY137、WT2、WT4和WT8。其中YL、M08由西北農(nóng)林科技大學(xué)李征教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；WT2、WT4、WT8是由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類(lèi)作物基因組與分子育種實(shí)驗(yàn)室從商品種中經(jīng)多代自交分離純化的自交系，CYY171、CYY298、CYY137是由河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司譚慧明老師提供的育種材料。

試驗(yàn)于2021年9月至2022年4月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類(lèi)作物基因組與分子育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 培養(yǎng)基配方及方法

1.2.1? ? 培養(yǎng)基配方? ? 播種培養(yǎng)基：6.7 g 瓊脂粉溶解于1 L超純水。侵染液：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質(zhì)量濃度1.5 mg·L-1），調(diào)pH至5.8～6.0。共培養(yǎng)培養(yǎng)基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質(zhì)量濃度1.5 mg·L-1），調(diào)pH至5.8～6.0。分化培養(yǎng)基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質(zhì)量濃度1.5 mg·L-1），調(diào)pH至5.8～6.0，加入特美?。ńK質(zhì)量濃度200 mg·L-1）。芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基：4.43 g MS 524，30 g蔗糖，1 g肌醇，500 μL SH有機(jī)溶劑（0.5 g煙酸、0.5 g維生素B1、0.05 g維生素B6溶解于500 mL無(wú)菌水），溶解于1 L超純水，分別加入6-BA（終質(zhì)量濃度0.1 mg·L-1）、NAA（終質(zhì)量濃度0.1 mg·L-1），調(diào)pH至5.8～6.0，加入特美?。ńK質(zhì)量濃度200 mg·L-1）。生根培養(yǎng)基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，調(diào)pH至5.8～6.0，加入特美汀（終質(zhì)量濃度200 mg·L-1）。除播種培養(yǎng)基及侵染液外，其余培養(yǎng)基均需調(diào)pH后加入7 g·L-1的瓊脂粉以使培養(yǎng)基凝固；所有培養(yǎng)基均須在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.2? ? 種子處理及發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)? ? 挑選飽滿(mǎn)健康的西瓜種子，用適量55 ℃的無(wú)菌水浸種30 min后剝?nèi)ネ夥N皮，置于無(wú)菌三角瓶后移至超凈工作臺(tái)，先用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次；再用5%次氯酸鈉浸泡10 min（期間不斷搖晃），無(wú)菌水清洗4～5次，置于播種培養(yǎng)基上，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)。每個(gè)西瓜材料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40粒種子，播種2 d后觀察每個(gè)基因型材料的發(fā)芽狀態(tài)，并分別統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，待種子下胚軸伸長(zhǎng)至1～2 cm并有根毛長(zhǎng)出時(shí)，獲得外植體并進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

發(fā)芽率/%=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100。 （1）

1.2.3? ? 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)? ? 將上述8種適于不定芽誘導(dǎo)的西瓜種子，用無(wú)菌刀片于超凈工作臺(tái)上將子葉遠(yuǎn)胚軸端，胚軸及子葉近胚軸端的部分組織切去（圖1-Ⅰ），將剩余部位的上下兩片子葉均勻切成12個(gè)外植體（圖1-Ⅱ），將外植體接種至含有不同赤霉素（GA3）質(zhì)量濃度梯度（0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg·L-1）的分化培養(yǎng)基上，在正常光周期（28 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）條件下進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種100個(gè)外植體，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)外植體。14 d后繼代一次，28 d后觀察出芽情況并統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率，根據(jù)結(jié)果篩選出再生能力最佳的基因型和不定芽誘導(dǎo)率最高時(shí)的GA3濃度。

不定芽誘導(dǎo)率/%=產(chǎn)生不定芽的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（2）

1.2.4? ? 種子播種后培養(yǎng)時(shí)間的篩選? ? 以篩選出的最佳基因型材料為基礎(chǔ)，比較種子在不同播種時(shí)間后（第1、2 、3 、4天）的發(fā)芽狀態(tài)及外植體的不定芽誘導(dǎo)率。每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種100個(gè)外植體，外植體放置在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，14 d后繼代一次，28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，根據(jù)結(jié)果篩選出最適宜的種子培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.5? ? 不定根的誘導(dǎo)及生根率的統(tǒng)計(jì)? ? 不定芽誘導(dǎo)28 d后，在超凈工作臺(tái)上將生長(zhǎng)狀態(tài)較好的不定芽轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，待不定芽伸長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。設(shè)置添加IBA質(zhì)量濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1的處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)不定芽，培養(yǎng)20 d后觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率/%=生根的不定芽數(shù)/總不定芽數(shù)×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（3）

1.2.6? ? 菌液濃度及共培養(yǎng)時(shí)間篩選? ? 將用于侵染的菌株接種至含有相應(yīng)抗性的YEB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、230 r·min-1的搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液濃度。設(shè)置菌液濃度OD600為0.5、0.8、1.0共3個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)置共培養(yǎng)2、3、4 d，3個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間，將以上3個(gè)濃度梯度與3個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間相互組合成9組處理（A-I），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)120個(gè)外植體，置于分化培養(yǎng)基5 d后統(tǒng)計(jì)外植體熒光率，采用購(gòu)自上海路陽(yáng)儀器有限公司（型號(hào)：LUYOR-3415RG）的手持熒光儀進(jìn)行外植體熒光的篩選，外植體有熒光的計(jì)入統(tǒng)計(jì)，通體無(wú)熒光的不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。根據(jù)熒光率篩選最適的菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間。

外植體熒光率/%=熒光外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（4）

1.2.7? ? 外植體造傷方式篩選? ? 以篩選出的最佳基因型材料、種子培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間為基礎(chǔ)，對(duì)獲得的外植體進(jìn)行不同造傷處理，分別采用CK處理（不進(jìn)行造傷）、刀片劃傷（用無(wú)菌刀片在外植體表面輕劃3刀）以及納米刷造傷（用納米刷在外植體表面刷3次）3種處理方式。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)120個(gè)外植體，并在侵染后觀測(cè)外植體熒光率和分化狀態(tài)。熒光強(qiáng)度以“+”表示，“+”越多表示熒光越強(qiáng)。

1.2.8? ? 侵染方式的篩選? ? 進(jìn)一步以篩選出的最佳基因型材料、種子培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間、外植體造傷方式為基礎(chǔ)，分別選擇浸泡侵染、真空負(fù)壓侵染和超聲波輔助侵染3種方式，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)120個(gè)外植體，共培養(yǎng)后置于分化培養(yǎng)基5 d后統(tǒng)計(jì)外植體的熒光率及愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （5）

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖，采用SPSS 26.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型西瓜材料發(fā)芽率及發(fā)芽狀態(tài)對(duì)比

以8個(gè)基因型西瓜為研究對(duì)象，每個(gè)基因型3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40粒西瓜種子，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率（圖2），并觀察播種培養(yǎng)2 d后的發(fā)芽狀態(tài)（表1）。結(jié)果表明，YL、CYY298、CYY171及CYY137基因型之間的發(fā)芽率差異不顯著，分別為90.1%、85.3%、79.7%和82.3%，但均顯著高于其他材料；WT8和M08的種子發(fā)芽率最低，僅為18.7%和24.7%，顯著低于其他材料；WT2和WT4居中，分別為39.0%和43.6%。發(fā)芽狀態(tài)的觀察結(jié)果表明，CYY298和YL均可發(fā)芽且均有根毛出現(xiàn)以及胚根的伸長(zhǎng)；CYY171和CYY137的萌發(fā)狀態(tài)無(wú)差異，基本均可發(fā)芽且根毛出現(xiàn)并有部分胚根伸長(zhǎng)；WT8、M08、WT2和WT4在第2天時(shí)的狀態(tài)整體較差，除M08有少部分根毛出現(xiàn)外，其余3種基因型均無(wú)根毛的出現(xiàn)以及胚根的伸長(zhǎng)。由以上結(jié)果可知，YL和CYY298整體的發(fā)芽率及發(fā)芽狀態(tài)較好，適合選為再生材料。

2.2 不同GA3濃度對(duì)不同基因型西瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

不同GA3濃度對(duì)8個(gè)不同基因型西瓜不定芽誘導(dǎo)的影響如圖3所示，在不同GA3濃度下YL的不定芽誘導(dǎo)率均遠(yuǎn)高于其他基因型，CYY298次之；8個(gè)基因型西瓜在0.5 mg·L-1 的GA3濃度下不定芽誘導(dǎo)效果均最佳，YL的誘導(dǎo)率最高為74%，CYY298次之，但僅為45%。隨著GA3濃度的升高，8個(gè)基因型西瓜的不定芽誘導(dǎo)率均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。由此可知，添加一定濃度的GA3可以促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)，而YL的不定芽誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于其他基因型材料，因此更適合作為再生材料。

2.3 不同基因型對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

筆者進(jìn)一步通過(guò)在分化培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1的GA3，觀察外植體在分化培養(yǎng)1周后的狀態(tài)（圖4-Ⅰ），并統(tǒng)計(jì)外植體誘導(dǎo)28 d后的不定芽誘導(dǎo)率（圖4-Ⅱ），探究相同GA3濃度下不同基因型的不定芽誘導(dǎo)能力。結(jié)果表明，在分化培養(yǎng)1周后，不同基因型外植體的分化狀態(tài)不同，YL在分化1周后誘導(dǎo)出淺綠色愈傷組織，且形態(tài)致密緊湊，分化狀態(tài)最佳；CYY298、CYY171及CYY137次之，WT8、WT2及WT4的外植體雖然有膨大但效果不及CYY298、CYY171和CYY137；M08的外植體分化效果最差，整體呈現(xiàn)淡黃色，邊緣愈傷組織分化也不明顯。不定芽誘導(dǎo)率的結(jié)果表明，YL早期的外植體分化狀態(tài)最佳，后續(xù)的不定芽誘導(dǎo)率也最高，達(dá)75.0%，顯著高于其他基因型材料；CYY298和CYY171的誘導(dǎo)率次之，分別為41.7%和43.0%，兩者的差異不顯著；M08早期外植體的分化效果雖然最差，但后續(xù)的不定芽誘導(dǎo)率與CYY137之間無(wú)差異，且均顯著高于WT8、WT2；8種基因型中WT8和WT2的不定芽誘導(dǎo)率最低，僅為17.0%和21.0%。

由以上結(jié)果可知，不同基因型材料的再生能力存在差異，播種2 d后種子的發(fā)芽率、不同GA3濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)率，以及不同基因型之間不定芽誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果綜合分析，發(fā)現(xiàn)8種基因型材料中YL是最適合的再生材料，可作為遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的受體材料。

2.4 種子播種后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

以YL為研究對(duì)象，設(shè)置4個(gè)種子播種后培養(yǎng)時(shí)間（第1、2、3、4天），觀察種子萌發(fā)狀態(tài)（圖5-Ⅰ）并獲取外植體后，分別接種至分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率（圖5-Ⅱ）。結(jié)果表明，播種培養(yǎng)1 d后，僅有少數(shù)種子的下胚軸開(kāi)始伸長(zhǎng)，并且不定芽誘導(dǎo)率也較低，為36.7%；播種培養(yǎng)2 d后，除極個(gè)別種子外，下胚軸均伸長(zhǎng)至1～2 cm，此狀態(tài)下的外植體不定芽誘導(dǎo)率最高，可達(dá)74.6%；播種3 d后，少數(shù)種子的兩片子葉展開(kāi)，下胚軸已伸長(zhǎng)至3 cm左右，不定芽的誘導(dǎo)率下降至46.9%；播種4 d后，種子的胚根已伸長(zhǎng)超過(guò)6 cm，根毛大量分化，2片子葉呈現(xiàn)嫩黃、展開(kāi)的狀態(tài)，不定芽的誘導(dǎo)率最低，僅為27.5%。由此可知，播種2 d后的種子最適宜于后續(xù)不定芽的誘導(dǎo)。

2.5 不同IBA濃度對(duì)生根效果的影響

以播種2 d后的YL為研究對(duì)象，通過(guò)觀察生根狀態(tài)（圖6-I）、統(tǒng)計(jì)每個(gè)不定芽的平均生根數(shù)量（表2）以及統(tǒng)計(jì)生根率（圖6-II），探究不同IBA濃度對(duì)生根效果的影響。結(jié)果表明，IBA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生根率最高為72.4%，平均生根數(shù)量最多，為6.3個(gè)，且根系健壯并有須根產(chǎn)生；隨著IBA質(zhì)量濃度增加，不定芽生根率降低，平均生根數(shù)量減少，IBA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，生根率為59.6%，平均生根數(shù)量4.3個(gè)；IBA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，其生根率僅為14.4%，平均生根數(shù)量為1.8個(gè)。綜上，較高質(zhì)量濃度的IBA處理會(huì)抑制不定芽生根，IBA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)生根效果最佳。

2.6 不同菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

以YL為研究對(duì)象，將3個(gè)菌液濃度梯度（OD600為0.5、0.8、1.0）與3個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間（2、3、4 d）共設(shè)置成9組處理（A～I(xiàn)），觀察5 d后外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)（表3）并統(tǒng)計(jì)熒光率（圖7），探究菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響并對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。

結(jié)果表明，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，OD600=0.8和1.0時(shí)的外植體生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且熒光率之間無(wú)顯著差異，分別為46.1%和44.6%，均顯著高于OD600=0.5的熒光率；共培養(yǎng)3 d，OD600=0.8時(shí)的外植體生長(zhǎng)狀態(tài)及熒光率均最高，熒光率達(dá)70.3%，顯著高于OD600=0.5和1.0時(shí)的熒光率；共培養(yǎng)4 d時(shí)，OD600=0.5，0.8和1.0時(shí)的熒光率分別為47.4%，60.2%和21.4%，雖然OD600=0.8時(shí)的熒光率最高，但部分外植體邊緣已有菌液溢出；在9組處理中，共培養(yǎng)4 d，OD600=1.0時(shí)的熒光率最低，外植體分化狀態(tài)也最差。因此，最適合的菌液侵染濃度為OD600=0.8，最適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為3 d，此時(shí)的外植體分化狀態(tài)較好且熒光率也最高。

2.7 不同造傷方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

以YL為研究對(duì)象，在播種后培養(yǎng)2 d，菌液濃度OD600為0.8、共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，設(shè)置3種外植體造傷方式，通過(guò)觀察外植體分化狀態(tài)（表4）并統(tǒng)計(jì)熒光率（圖8），探究不同造傷方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。

結(jié)果表明，在CK處理下，外植體正常膨大，但后續(xù)邊緣僅有部分區(qū)域誘導(dǎo)出芽，外植體熒光率為59.7%；納米刷造傷處理后，雖然造傷處的熒光信號(hào)加強(qiáng)，但外植體表面分化白色愈傷，后期不定芽分化緩慢，但熒光率達(dá)到65.2%，高于CK；刀片劃傷處理后，外植體在共培養(yǎng)階段膨大較好且邊緣呈現(xiàn)綠色的愈傷組織，外植體熒光率也最高，可達(dá)74.9%。綜上可知，采用刀片劃傷外植體的方式可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，且不會(huì)影響外植體再生狀態(tài)。

2.8 不同侵染方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

以播種培養(yǎng)2 d后的YL為研究材料，在菌液濃度OD600=0.8、共培養(yǎng)時(shí)間為3 d的優(yōu)化體系下，設(shè)置3種侵染方式，分別觀察外植體的分化狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)熒光率和愈傷組織誘導(dǎo)率（表5），探究不同侵染方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，在浸泡侵染下，外植體在共培養(yǎng)后的熒光率最低，僅為30.6%；在負(fù)壓侵染處理下，外植體的熒光率和愈傷組織誘導(dǎo)率均最高，分別為71.8%和60.2%；超聲輔助侵染后外植體熒光率顯著高于浸泡侵染處理，但顯著低于負(fù)壓侵染，而愈傷誘導(dǎo)率最低，僅為33.6%。此外，在植物活體成像儀觀察下發(fā)現(xiàn)，負(fù)壓侵染處理后外植體膨大狀態(tài)及分化狀態(tài)均較好且熒光更亮（圖9）。綜上可知，負(fù)壓侵染為最佳侵染方式，可以有效提高轉(zhuǎn)化效率。

3 討論與結(jié)論

植物遺傳轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因及以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基礎(chǔ)的基因組編輯、功能基因組研究以及分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵。相對(duì)于基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)中再生體系的優(yōu)化和建立成為目前限制功能基因組學(xué)快速發(fā)展的瓶頸。影響植物離體器官再生的主要因素有基因型、外植體部位和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等[31]。目前對(duì)西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究雖然已有報(bào)道，但外植體再生效率低，以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的不穩(wěn)定仍是制約其在西瓜中高效利用的主要因素[32]。

基因型是目前制約西瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一，極大地影響著外植體的再生能力。筆者以8種不同西瓜基因型材料為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)比8種材料在相同時(shí)間內(nèi)種子的萌發(fā)速率，外植體產(chǎn)生不定芽的速率，發(fā)現(xiàn)不同基因型之間存在較大差異，但綜合對(duì)比發(fā)現(xiàn)，YL的表現(xiàn)最佳，最適宜于作為西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。試驗(yàn)結(jié)果表明，YL種子在播種培養(yǎng)后的第2天即可達(dá)到適于后續(xù)不定芽再生的最佳狀態(tài)；在分化早期階段，外植體邊緣可形成淺綠色愈傷組織，并且該狀態(tài)的愈傷組織在后期也表現(xiàn)出最好的再生能力，而其余基因型材料在分化早期，邊緣形成愈傷組織的能力均弱于YL，這也可能是其后期不定芽誘導(dǎo)率顯著低于YL的原因。除了基因型的差異影響不定芽再生之外，目前也有研究表明，通過(guò)在轉(zhuǎn)化載體中添加不定芽再生促進(jìn)基因，可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率。Debernardi等[33]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)小麥生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子GRF4和GIF1組成的嵌合蛋白提高了小麥再生效率和再生速度，同時(shí)增加了可轉(zhuǎn)化小麥基因型的數(shù)量；潘文波等[34]發(fā)現(xiàn)在西瓜中共表達(dá)AtGRF5和AtGIF1可以顯著提高西瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率；馮琴等[35]通過(guò)在轉(zhuǎn)化載體中過(guò)表達(dá)內(nèi)源嵌合基因ClGRF4和ClGIF1，在西瓜中實(shí)現(xiàn)了高效的、不依賴(lài)基因型的遺傳轉(zhuǎn)化。因此，筆者所優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可在后續(xù)的試驗(yàn)中同時(shí)融合不定芽再生促進(jìn)基因，以獲得更高的遺傳轉(zhuǎn)化效率。此外，在后續(xù)研究中還可以通過(guò)繼續(xù)探究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，以期獲得完全不依賴(lài)基因型的高效西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。

除基因型的影響因素外，適宜的激素濃度也是提高不定芽誘導(dǎo)率的關(guān)鍵，與宋道軍等[36]在誘導(dǎo)不定芽階段使用的激素不同，筆者通過(guò)在分化培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的GA3，有效提高了外植體分化效率，并且還發(fā)現(xiàn)GA3誘導(dǎo)不定芽的再生存在劑量效應(yīng)，0.5 mg·L-1時(shí)的誘導(dǎo)效果最佳，結(jié)果可為探究GA3對(duì)其他作物外植體不定芽誘導(dǎo)的影響提供參考。此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同播種天數(shù)的西瓜種子，外植體不定芽誘導(dǎo)率之間差異顯著。筆者采用播種后2 d的西瓜YL材料，獲得了較高的不定芽誘導(dǎo)率，相較于趙彩萍等[37]認(rèn)為苗齡4～5 d時(shí)子葉誘導(dǎo)率最高的結(jié)果縮短了1～2 d的播種時(shí)間。在誘導(dǎo)生根階段，筆者通過(guò)在生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1的IBA有效提高了不定芽生根速率及生根數(shù)目，研究結(jié)果與劉靜等[38]使用0.4 mg·L-1的IBA誘導(dǎo)不定芽生根的結(jié)果略有差異，可能是由于所用西瓜基因型不同，但也由此表明適宜濃度的IBA才可更好地誘導(dǎo)西瓜不定芽生根。

農(nóng)桿菌菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間也是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化中重點(diǎn)關(guān)注的因素，菌液濃度過(guò)低則影響外植體的侵染效率，而菌液濃度過(guò)高時(shí)外植體周?chē)鷺O易出現(xiàn)溢菌現(xiàn)象。筆者研究認(rèn)為，農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.8且共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，熒光效率較高，與張志忠等[39]的研究結(jié)果一致。造傷處理外植體可以通過(guò)增加菌液附著在外植體上的概率，進(jìn)而影響侵染效率。筆者在本研究中共采用了3種造傷方式處理外植體，發(fā)現(xiàn)刀劃造傷處理下的侵染效率最高。雖然已有研究表明，納米刷造傷處理外植體可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)納米刷處理后的外植體雖然在短時(shí)間內(nèi)具有較高的熒光率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)熒光亮度逐漸減弱，并且在分化后期邊緣易產(chǎn)生白色愈傷組織，極大地影響了后期不定芽的再生能力。不同侵染方式對(duì)西瓜轉(zhuǎn)化效率也有影響，相較于直接浸泡侵染和超聲輔助侵染，通過(guò)負(fù)壓侵染處理外植體，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，可能是由于真空負(fù)壓狀態(tài)下，外植體細(xì)胞壁更加松弛，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)化效率。超聲輔助侵染后，外植體雖然有較高的熒光率，但愈傷組織誘導(dǎo)率下降，這可能與超聲處理后外植體在一定程度上受損有關(guān)，后續(xù)可進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化超聲波的強(qiáng)度和時(shí)間繼續(xù)探索其對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)選用YL作為受體材料，種子播種2 d后，外植體在添加0.5 mg·L-1GA3的培養(yǎng)基中不定芽的誘導(dǎo)率最高；YL誘導(dǎo)出的不定芽在IBA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)生根效果最佳；采用負(fù)壓侵染與刀劃造傷外植體相結(jié)合的方式，菌液濃度OD600=0.8且共培養(yǎng)3 d時(shí)的外植體熒光率最高。

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收稿日期：2023-10-10；修回日期：2024-01-04

基金項(xiàng)目：河南省科技研發(fā)計(jì)劃聯(lián)合基金（222103810009）；河南省重大科技專(zhuān)項(xiàng)（221100110400）；河南省農(nóng)業(yè)良種聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（2022010503）

作者簡(jiǎn)介：李鵬飛，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種。E-mail：2275147174@qq.com

通信作者：牛歡歡，女，講師，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種。E-mail：niuhh@henau.edu.cn

楊路明，男，教授，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種。E-mail：lumingyang@henau.edu.cn