李晗　張鑫　鮑樹森　郝強

【摘 要】 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，通過其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA（CRISPR RNA）及CRISPR相關(guān)蛋（CRISPR-associated，Cas），尤其是Cas9蛋白特異性抑制入侵的DNA。該系統(tǒng)由于其快捷靶向以及其作為一種特定位點核酸酶的高效性和多重修飾的可能性，被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。本文主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的相關(guān)概念及原理、技術(shù)研究進(jìn)展、應(yīng)用研究進(jìn)以及CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的未來發(fā)展進(jìn)行闡述。

【關(guān)鍵詞】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因編輯

基因編輯是指對基因組或表達(dá)產(chǎn)物（RNA）進(jìn)行針對性修飾的過程。真核生物基因組包含上億萬個堿基，很難對其進(jìn)行精確的修飾。但如果能夠簡單有效地做到，將會極大地推動生物學(xué)基礎(chǔ)理論、醫(yī)藥及生物技術(shù)等方面的研究的進(jìn)展。CRISPR/Cas9作為新一代的基因編輯技術(shù)，有著其它技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢。理論上，在基因組中每8bp就有一個適合 CRISPR/Cas9編輯的位點?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理，研究人員通過體外人工合成sgRNA（small-guide RNA）與Cas9蛋白的復(fù)合物，成功實現(xiàn)對特定基因片段的精確剪切，由此開創(chuàng)了一種通過構(gòu)建RNA序列介導(dǎo)Cas蛋白識別并剪輯靶基因的新型基因編輯技術(shù)。由于該技術(shù)的高效性、低成本性和簡易性，對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究受到各界密切關(guān)注，而且在越來越多的研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)的基本原理

CRISPR/Cas9的基本結(jié)構(gòu)包括tracrRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）序列區(qū)、cas（CRISPR associated system，cas）基因序列區(qū)、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列區(qū)，3個功能區(qū)在

DNA鏈上呈線性排列。CRISPR序列區(qū)含多個重復(fù)序列（R區(qū)）和間隔序列（S區(qū)），間隔序列被呈半回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列隔開。CRISPR序列區(qū)可編碼crRNA（CRISPR RNA），故又被稱為crRNA序列區(qū)。Cas基因區(qū)臨近CRISPR序列區(qū)，cas基因種類有很多，其中cas9 基因編碼Cas9核酸酶，該酶受crRNA引導(dǎo)，對DNA靶序列進(jìn)行切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種類型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，而在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPE/Cas9系統(tǒng)屬于TypeⅡ型。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在噬菌體中起到免疫作用，當(dāng)噬菌體首次入侵宿主時，cas基因編碼的蛋白復(fù)合物會裂解噬菌體DNA上短間隔序列，并將裂解片段整合入自身DNA的CRISPR序列5端。當(dāng)同種噬菌體再次侵入時，整合了噬菌體DNA片段的CRISPR位點會轉(zhuǎn)錄出crRNA，在crRNA與一段tracrRNA結(jié)合成為二元復(fù)合體后，與噬菌體DNA 20nt 的長度互補配對，繼而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割結(jié)合位點[1]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)的新發(fā)展

Samuel等[2]建立了一個模塊化的存儲單元，利用自我靶向RNA（stgRNA）記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件，從而使它能被反復(fù)的改寫來生成新的序列。他們設(shè)計了一個自我靶向向?qū)NA（stgRNA），它可以不斷地靶向、誘變編碼它的DNA。在巨細(xì)胞病毒啟動子和規(guī)范ATG起始密碼子的下游，他們嵌入了一個突變檢測區(qū)（MDR）。這個可變區(qū)是由stgRNA位點和緊隨它的改良后的u6啟動子組成。MDR直接在不同閱讀框的綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）基因后面，GFP和RFP被相應(yīng)的不同閱讀框的“2A自我分裂（切割）多肽”分開。不同的閱讀框架是否與起始密碼子同框，這取決于MDR中插入缺失的大小。不同數(shù)量的堿基刪除會產(chǎn)生不同的移碼突變，從而表達(dá)不同的熒光蛋白。進(jìn)而記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件。

在基因編輯技術(shù)方面，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其簡潔性、高效性已被廣泛用于基因編輯，但同時也存在著脫靶的現(xiàn)象。Feng Zhang等[3]在構(gòu)成化膿性鏈球菌 Cas9酶的約 1400個氨基酸中，通過改變 3個氨基酸將“脫靶編輯”顯著減少至無法檢測到的水平。該研究小組將這種新設(shè)計的酶命名為 “增 強 型 ”化 膿 性 鏈 球 菌 Cas9 （SpCas9），可用于需要高水平特異性的基因組編輯應(yīng)用。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病研究中的應(yīng)用

3.1 疾病模型的構(gòu)建

目前，許多遺傳病的研究是通過對來自患者的iPS細(xì)胞的研究來實現(xiàn)的，但是這要花費幾個月的時間，同時也受到細(xì)胞是否可以得到和遺傳背景多樣性的限制。這一問題可以通過野生型細(xì)胞系的基因編輯來避免。Dominik[4]等利用CRISPR/Cas9引入阿爾茲海默氏癥的任意一種遺傳突變后，發(fā)現(xiàn)在CRISPR/Cas9切割位點和研究者引入受體細(xì)胞的突變之間存在一段序列上的距離。研究者發(fā)現(xiàn)了特殊的距離關(guān)系，就可以對干細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯使細(xì)胞包含兩種阿爾茲海默氏癥基因中的任意一種，隨后誘導(dǎo)這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)元細(xì)胞并且產(chǎn)生大量β淀粉樣蛋白，從而模擬阿爾茲海默氏癥的疾病表現(xiàn)。

3.2 疾病的治療

目前，病毒治療的策略相對有限，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對病毒DNA的清除為病毒的治療提供了新的思路。Kaminski R等[5]證實利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)能夠有效地和安全地將HIV病毒從在體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞的DNA中清理掉。我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中和活的小鼠體內(nèi)的效果[6]。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，可能是治療HBV感染的一種新策略。

在遺傳病防治方面，血友病B，是非常適合用于基因治療與基因編輯技術(shù)的疾病。Guan Y等人[7]發(fā)現(xiàn)位于人類F9基因上的突變Y371D能夠引起比Y371S更為嚴(yán)重的血友病。他們用靶向這一基因位點的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果表明，用腺病毒為載體的基因編輯系統(tǒng)對小鼠基因糾正率較高，但有較重的肝毒性，需進(jìn)一步改善。Elizabeth等[8]進(jìn)行了人血液紅系祖細(xì)胞的由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，使得在HBG1和HBG2基因的啟動子中的一段13nt的序列發(fā)生了突變，進(jìn)而改變了天然存在的胎兒血紅蛋白（HPFH）相關(guān)突變。而經(jīng)過基因編輯的紅系祖細(xì)胞與胎兒血紅蛋白（HbF）水平的增加也足以抑制鐮狀紅細(xì)胞貧血由于缺氧導(dǎo)致的紅細(xì)胞形態(tài)的改變。這有可能是未來β-地中海貧血基因治療的一項策略。

CRISPR/Cas9在腫瘤治療方面的研究的主要策略是相關(guān)基因的敲除。2015年，Brandon等[9]首次將CRISPR技術(shù)應(yīng)用到了癌癥相關(guān)的基因治療研究，他們設(shè)計了一種慢病毒載體使 CRISPR 系統(tǒng)可以被 doxycycline 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并高效地對細(xì)胞進(jìn)行編輯。應(yīng)用這個系統(tǒng)，他們實現(xiàn)了對 癌基因MCL-1在體內(nèi)和體外的敲除。實驗結(jié)果表明，慢病毒 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)高效地實現(xiàn)了體內(nèi) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯，通過癌基因的敲除，可以作為一種潛在的新型的癌癥治療方案。CRISPR/Cas9技術(shù)在體外敲除EGFR/EGFRvIII，增加了 UBXN1的表達(dá)同時減少了NF-κB的表達(dá)，最后抑制了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）的生長。

4 發(fā)展前景展望

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日益發(fā)展與完善，它在科研的基因編輯領(lǐng)域發(fā)揮重要作用的同時，也將會給臨床治療提供一個嶄新的思路，尤其是在抗DNA病毒感染和腫瘤治療方面。隨著靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，也為抗RNA病毒感染提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

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[3].Slaymaker， I.M.， et al. Science， 2016. 351（6268）： p. 84-8.

[4].Paquet， D.， et al. Nature， 2016. 533（7601）： p. 125-9.

[5].Kaminski， R.， et al. Sci Rep， 2016. 6： p. 22555.

[6].Zhen， S.， et al. Gene Ther， 2015. 22（5）： p. 404-12.

[7].Guan， Y.， et al. EMBO Mol Med， 2016. 8（5）： p. 477-88.

[8].Traxler， E.A.， et al. Nat Med， 2016. 22（9）： p. 987-90.

[9].Aubrey， B.J.， et al. Cell Rep， 2015. 10（8）： p. 1422-32.