蔡建平　侯和勝

摘 要： 利用RT-PCR 技術從葡萄中克隆到兩個查耳酮合酶（CHS）的cDNA 開放閱讀框（ORF）序列，分別命名為VvCHS1 和VvCHS3。其中，VvCHS1 序列長1 182 bp，編碼393個氨基酸；VvCHS3 序列長1 170 bp，編碼389個氨基酸。對兩個CHS 基因編碼的氨基酸序列的分析表明，二者均具有CHS基因家族的保守結構域。多序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明，兩個CHS基因與其他高等植物CHS基因具有較高的相似性，然而VvCHS1和VvCHS3在結構和功能上出現(xiàn)歧化。

關鍵詞：葡萄遺傳；查耳酮合酶；基因克??；進化分析

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.002

查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）是將苯丙烷類代謝途徑引向類黃酮合成的第1個關鍵酶，它催化3分子的丙二酰輔酶A （Malonyl CoA） 與1分子的香豆酰CoA（Coumaryl CoA）生成4，5，7-三羥基黃烷酮（Narigenin chalcone）。類黃酮類物質是廣泛存在于高等植物中的次生代謝物，包括黃酮、異黃酮、黃烷酮、查耳酮、花色素苷、原花色素[1-4]。研究表明，類黃酮作為植物體內(nèi)一種重要的保護性物質，在植物中具有重要的生理功能，包括抵御病原菌侵害、參與豆科植物根瘤菌形成、吸引昆蟲和動物、促進花粉管生長、防止紫外線傷害、促進色素形成，等等。在應用方面，類黃酮類物質具有軟化血管、抗癌、清除體內(nèi)自由基等生理功能，已經(jīng)成為植物次生代謝物應用研究的熱點[5-10]。CHS基因是一個較大的基因家族，屬于聚酮化合物合酶（PKS）超家族的一個分支。為探討CHS在葡萄次生代謝中的調節(jié)和代謝途徑轉換作用，本研究采用RT-PCR 的方法，克隆得到葡萄CHS基因開放閱讀框，并對其系統(tǒng)發(fā)生進行分析，為加深理解葡萄CHS基因功能奠定基礎并提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

葡萄材料為本實驗室種植的栽培種葡萄（Vitis vinifera）；E.coli DH5α為本實驗室保存原菌；克隆載體為pMD19-T simple vector、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒均購自上海Invitrogen公司； 試驗中所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)其他物種中已報道的查耳酮合酶基因序列及葡萄基因組數(shù)據(jù)庫信息，進行BLAST比較，獲得2個VvCHS基因完整開放閱讀框序列，分別命名為VvCHS1和VvCHS3。利用Primer Premier5.0軟件設計引物，引物序列為：VvCHS1-F 5' TAGAAGCCAGTAAAGCAGG3'；VvCHS1-R5' TCACCCAAGAATGACTACG3'；VvCHS3-F 5' TACCACAAGCCTCATCCC 3'；VvCHS3-R 5' GCAATCTATTACACCATACCCT 3' ，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 葡萄CHS基因cDNA全長的獲得

葡萄葉片總RNA的提取采用改良的SDS方法進行操作，獲得的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后用反轉錄酶合成cDNA，以反轉錄的cDNA為模板，用引物對VvCHS1、VvCHS3進行擴增。VvCHS1擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。VvCHS3擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。按試劑盒上的操作指導回收凝膠電泳后與預期目的片段大小一致的泳帶，經(jīng)電泳檢測后連接克隆載體（pMD19-T simple vector）并轉化感受態(tài)細胞（E.coli DH5α），通過藍白斑篩選及菌液PCR鑒定陽性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

使用ClustalX進行同源序列比對，輸出結果使用Mega4.0 軟件進行Neighbor-joining法Bootstrap進化樹校驗。

2 結果與分析

2.1 葡萄RNA的提取及CHS基因全長cDNA的獲得

提取到的葡萄總RNA凝膠電泳結果見圖1。從圖1可以看出，提取的總RNA完整無降解，質量較高，可以滿足后續(xù)試驗的要求。

以葡萄葉片cDNA為模板，用設計的葡萄CHS特異性引物進行PCR擴增（圖2），得到單一條帶，且大小與預測的相符。將擴增得到的條帶切膠回收后與pMD-19T連接，轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，分別進行菌液PCR檢測和測序檢測，檢測結果證實克隆得到VvCHS1和VvCHS3的完整ORF序列，ORF序列大小分別為1 182 bp和1 170 bp。

2.2 植物CHS基因的系統(tǒng)發(fā)生及其進化分析

在NCBI database數(shù)據(jù)庫中搜索得到CHS 家族中目前已報道的cDNA 全長核苷酸序列，推導出其編碼的氨基酸序列共20 條。并整合為Fasta 格式。根據(jù)氨基酸序列做進化樹分析（圖3）。結果表明，20 個來源于不同植物的CHS聚類到3個大組中，第1組最大，包括14 個蛋白；第2組次之，包括4 個蛋白；第3組只有兩個蛋白。其中，第1組的14 個蛋白又分為至少3個亞組：5 個葡萄VvCHS，除VvCHS3 外，其余4 個形成第1亞組；豇豆和豌豆形成第2亞組；番茄、矮牽牛、藍莓和葡萄VvCHS3 形成第3亞組。本文報道的VvCHS1 和VvCHS3 分屬不同的兩個亞組，表明植物CHS 基因在植物的進化過程中發(fā)生了歧化，形成了該基因在構成和功能上的多樣性。與VvCHS3 同組的番茄、藍莓和矮牽牛都是富含花青素的植物，說明VvCHS3 與花青素合成密切相關。而VvCHS1 及其與其聚類在同一亞組的其他3個VvCHS與相思樹和非洲菊親緣關系更近，至于其催化形成的查爾酮主要轉化形成哪種次生代謝物，這還需要進一步研究。

3 結 論

采用RT-PCR技術從葡萄中克隆得到兩個查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長1 182 bp，編碼393個氨基酸；VvCHS3序列長1 170 bp，編碼389個氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明，兩個CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進一步研究該基因的功能及其在葡萄適應性機制中的作用奠定了基礎。

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3 結 論

采用RT-PCR技術從葡萄中克隆得到兩個查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長1 182 bp，編碼393個氨基酸；VvCHS3序列長1 170 bp，編碼389個氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明，兩個CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進一步研究該基因的功能及其在葡萄適應性機制中的作用奠定了基礎。

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3 結 論

采用RT-PCR技術從葡萄中克隆得到兩個查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長1 182 bp，編碼393個氨基酸；VvCHS3序列長1 170 bp，編碼389個氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明，兩個CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進一步研究該基因的功能及其在葡萄適應性機制中的作用奠定了基礎。

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