唐晨晨　張文霞　陳芳珍　武志健　黃科　王軍偉

摘? ? 要：為探究植物激素脫落酸對(duì)青花菜芽苗黃酮類物質(zhì)合成的作用機(jī)制，以青花菜品種耐寒優(yōu)秀為試材，以清水為對(duì)照，外源噴施50 μmol·L-1的ABA，對(duì)處理后的青花菜芽苗進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析。結(jié)果表明，代謝組共檢測(cè)出14類物質(zhì)，包含黃酮共212種，具有明顯差異的黃酮共30種。其中，兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量明顯上升，柚皮苷、銀鍛苷和枸橘苷含量明顯下降。通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，黃酮合成途徑、苯丙烷合成途徑以及ABA信號(hào)通路共篩選出13個(gè)相關(guān)調(diào)控基因，其中LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133對(duì)兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量呈明顯正相關(guān)，推測(cè)上述基因可響應(yīng)ABA信號(hào)參與調(diào)控黃酮類化合物的生物合成。綜上所述，研究結(jié)果表征了青花菜芽苗響應(yīng)外源ABA并調(diào)控黃酮類化合物合成的關(guān)鍵基因，為后續(xù)黃酮類化合物的生物合成調(diào)控奠定了科學(xué)理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜；黃酮；轉(zhuǎn)錄組；代謝組；外源ABA

中圖分類號(hào)：S635.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）03-035-10

The metabolome and transcriptome jointly resolve the response mechanism of flavonoids in broccoli sprouts to exogenous ABA

TANG Chenchen， ZHANG Wenxia， CHEN Fangzhen， WU Zhijian， HUANG Ke， WANG Junwei

（Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Genetic Resources of Horticultural Crops （Vegetables， tea， etc.）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Whampoa Innovation Research Institute， Hunan Agricultural University/Engineering Research Center of Horticultural Crop Germplasm Innovation and New Variety Breeding， Ministry of Education/Hunan Provincial Key Laboratory of Vegetable Biology/College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： In order to investigate the mechanism of action of the phytohormone abscisic acid on the synthesis of flavonoids in broccoli sprouts， the cauliflower Naihan Youxiu was used as the test material. The metabolome and transcriptome were jointly analyzed in treated broccoli sprouts with exogenous spraying of 50 μmol·L-1 ABA while using water as control. The results showed that a total of 14 categories of substances were detected in the metabolome， including 212 flavonoids. Among them， there were 30 kinds of flavonoids with significant differences. The content of catechin gallate， epicatechin gallate and morin hydrate increased significantly， while those of naringin， argyragin and lycioside decreased significantly. A total of 13 regulatory genes related to flavonoid synthesis pathway， phenylpropane synthesis pathway and ABA signaling pathway were screened by combining metabolome and transcriptome analysis. Among them， LOC106337270， LOC106329559 and LOC106326133 showed significant positive correlation with the content of catechin gallate， epicatechin gallate and morin hydrate. Therefore， we speculated that these genes could be involved in regulating the biosynthesis of flavonoids in response to ABA signals. In summary， this study characterized the key genes of broccoli sprouts in response to exogenous ABA and regulation of flavonoid synthesis， which lay a scientific theoretical foundation for the subsequent regulation of flavonoid biosynthesis.

Key words： Broccoli; Flavonoids; Transcriptome; Metabolome; Exogenous ABA

青花菜（Brassica oleracea L. var. italica）是十字花科蕓薹屬一二年生蔬菜作物，起源于歐洲，又名意大利芥藍(lán)、西藍(lán)花等，因其營(yíng)養(yǎng)豐富且富含多種生物活性物質(zhì)，被稱為“蔬菜皇冠”[1-2]。青花菜可食用部位以花球?yàn)橹?，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)青花菜芽苗內(nèi)的生物活性物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于成熟植株，且青花菜芽苗具有生長(zhǎng)周期短、病蟲害少等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)。植物生物活性物質(zhì)多為次生代謝產(chǎn)物，具有抵御生物或非生物逆境以及作為信號(hào)分子等作用。植物的次生代謝響應(yīng)環(huán)境變化，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。研究顯示，青花菜的次生代謝物質(zhì)主要包括硫代葡萄糖苷、多酚、黃酮等[5-6]。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的多酚次級(jí)代謝產(chǎn)物，可分為二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮醇、黃烷酮等，在植物抵御逆境脅迫中起重要作用，對(duì)人體具有抗氧化活性、抗炎癥等作用[7]。黃酮類化合物的合成會(huì)受多種因素影響，包括生物和非生物因素，如激素等[8]。有研究表明，脫落酸（ABA）會(huì)促進(jìn)擬南芥中查爾酮合成酶（CHS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）的表達(dá)，從而誘導(dǎo)黃酮醇的積累[9]。相似的研究結(jié)果在番茄中也有報(bào)道，通過對(duì)番茄進(jìn)行外源ABA處理后，番茄果實(shí)內(nèi)總黃酮含量逐漸升高[10]。類黃酮類化合物以苯丙烷為合成前體，其合成過程受一系列酶基因和調(diào)控基因的影響，其中調(diào)控基因可以直接或間接調(diào)控類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響黃酮類化合物的生物合成[11]。目前已報(bào)道的黃酮類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶主要有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）、查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃酮合酶（FNS）、黃酮醇合成酶（FLS）、無(wú)色花色素還原酶（LAR）等[12]。有研究顯示，外源ABA會(huì)影響PAL、C4H、FLS、CHS等基因表達(dá)進(jìn)而影響黃酮類化合物的生物合成[13]，但是目前關(guān)于ABA調(diào)控黃酮合成的具體機(jī)制尚未明確。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，組學(xué)技術(shù)作為一種檢測(cè)方式日趨成熟。其中，代謝組學(xué)是最接近植物表型的組學(xué)，可直接用于對(duì)植物產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行定性定量分析。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是基因表達(dá)和調(diào)控檢測(cè)的有力手段，可對(duì)機(jī)體生理變化過程進(jìn)行轉(zhuǎn)錄層面的剖析[14-16]。轉(zhuǎn)錄組和代謝組的關(guān)聯(lián)分析可將基因和表型建立聯(lián)系，通過差異基因和差異代謝物的分析，從“因”和“果”兩方面明確植物的代謝途徑，進(jìn)一步揭示植物的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[17]。有研究報(bào)道，通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，外源亞精胺[18]、茉莉酸甲酯[19]、藍(lán)光[20]等均可調(diào)控黃酮類化合物的合成。筆者的研究通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，建立植物表型和基因型之間的聯(lián)系，明確外源ABA處理后青花菜芽苗中黃酮類物質(zhì)的代謝差異和基因表達(dá)差異，并進(jìn)一步挖掘青花菜芽苗響應(yīng)外源ABA并調(diào)控黃酮類化合物合成的關(guān)鍵基因，為后續(xù)黃酮類化合物生物合成調(diào)控提供基因資源和技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為青花菜品種耐寒優(yōu)秀，具有耐寒、長(zhǎng)勢(shì)旺等優(yōu)良特性，種子購(gòu)于廣東金作農(nóng)業(yè)科技有限公司。脫落酸（ABA）購(gòu)買于索萊寶公司，型號(hào)為A8060。

1.2 方法

試驗(yàn)于2022年11月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。將珍珠巖裝于育苗托盤內(nèi)（長(zhǎng)、寬、高分別為32.5、24.5、4.5 cm），深度約為2.5 cm。選取顆粒飽滿的耐寒優(yōu)秀種子，室溫浸種6 h后置于紗布上并放入25 ℃的人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行黑暗催芽處理，待其露白后均勻點(diǎn)播于珍珠巖上，每盤300粒，并覆蓋一層珍珠巖，隨后置于人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。人工氣候室環(huán)境條件設(shè)置為溫度22 ℃、相對(duì)濕度70%～80%。待種子發(fā)芽露根在85%以上，隨即置于光照下進(jìn)行培養(yǎng)，光照條件為光強(qiáng)20 000 lx，光周期12 h/12 h（晝/夜）。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)（共3個(gè)托盤）。外源ABA處理濃度選擇以前期的試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用50 μmol·L-1 ABA處理青花菜芽苗。光照下緩苗1 d后進(jìn)行處理，每次09：00進(jìn)行外源ABA噴施（50 μmol·L-1），以清水為對(duì)照，每盤噴施20 mL，連續(xù)噴施7 d，并于第7天15：00進(jìn)行隨機(jī)取樣，分別用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組和代謝組，取樣后立即放于液氮中速凍，存貯于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 廣泛靶向代謝組測(cè)定 樣品提取：將樣品置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥后使用研磨儀研磨（30 Hz，15 min）至粉末狀，稱取50 mg樣品粉末置于2 mL離心管中，并加入1200 μL內(nèi)標(biāo)提取液后立即渦旋，每30 min渦旋1次，每次30 s，共渦旋6次。隨后1200 r·min-1離心3 min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）過濾后保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS檢測(cè)。液相色譜條件主要包括，色譜柱：AgilentSB-C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0 min B相比例為5%，9 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10～11.1 min B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體Ⅰ（GSⅠ），氣體Ⅱ（GSⅡ）和氣簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60和25 psi，碰撞誘導(dǎo)參數(shù)設(shè)置為高。通過去簇電壓（Declustering potential，DP）和碰撞能（Collision energy，CE）的優(yōu)化，對(duì)每個(gè)時(shí)期的洗脫代謝物進(jìn)行檢測(cè)。代謝物定性定量分析：通過數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（Metware database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性分析。通過3重4級(jí)桿對(duì)碎片離子進(jìn)行過濾和篩選，排除干擾離子后進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)所有物質(zhì)色譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 mRNA提?。好總€(gè)處理隨機(jī)取20根芽苗為1組，共設(shè)置3次重復(fù)，使用瓊脂糖凝膠電泳、Qubit 2.0熒光劑、Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA的完整性和污染程度。文庫(kù)構(gòu)建：利用大部分真核生物mRNA都帶有polyA尾的結(jié)構(gòu)特征，通過Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后加入fragmentation buffer將RNA打斷成短片段，以短片段RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（Random hexamers）合成第一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs（dTTP、dATP、dGTP和dCTP）和DNApolymerase I以合成第二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段選擇，最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢：文庫(kù)構(gòu)建后，使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，最后使用qPCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2 nmol·L-1）。上機(jī)測(cè)序：庫(kù)檢合格后，不同文庫(kù)按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行pooling，用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將轉(zhuǎn)錄組和代謝組的測(cè)量數(shù)據(jù)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)og2值，使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）和對(duì)應(yīng)的P值篩選出差異代謝產(chǎn)物和相關(guān)調(diào)控基因，篩選條件為|PCC| ≥ 0.80且p-value ≤ 0.05。PCA用R軟件（www.r-project.org/）的內(nèi)置統(tǒng)計(jì)prcomp函數(shù)，設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行UV（Unit variance scaling）處理。為了更好地在代謝物和基因之間建立聯(lián)系，通過轉(zhuǎn)錄-代謝聯(lián)合分析得到coefficient值及p-value值，使用Cytoscape 3.10繪制PPI（Protein?Protein Interaction）互作網(wǎng)絡(luò)圖。所有涉及圖表均使用GraphPad Prism 8.0和IBM Spss Statistics 21繪制，數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel2021篩選。通過Fisher LSD檢驗(yàn)的雙向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組主成分分析

通過對(duì)樣品之間的相關(guān)性分析，將皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearsons Correlation Coefficient）作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)。如圖1-A所示，CK的3個(gè)樣本之間的PCC值均大于0.99，表明CK的3個(gè)樣本之間的重復(fù)性較好。ABA的3個(gè)樣本之間，ABA2和ABA3之間重復(fù)性較好，但與ABA1重復(fù)性較差。進(jìn)一步通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）發(fā)現(xiàn)，ABA處理與CK之間發(fā)生了明顯的分離（圖1-B）。上述結(jié)果表明，代謝組測(cè)試結(jié)果可用于進(jìn)一步差異代謝物篩選分析。

2.2 代謝組代謝物類別分析

為明確ABA處理后青花菜芽苗代謝物的變化趨勢(shì)，通過UPLC-MS平臺(tái)廣泛靶向代謝組技術(shù)對(duì)樣品中的代謝物進(jìn)行鑒定?；谧越〝?shù)據(jù)庫(kù)對(duì)處理組和對(duì)照組樣本的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性定量分析，通過3重4級(jí)桿篩選共檢測(cè)出14類共1875種代謝物，其中苯及其衍生物（Benzene and substituted derivatives）446種、酚酸類（Phenolic acids）174種、核苷酸及其衍生物（Nucleotides and derivatives）80種、黃酮（Flavonoids）212種、醌類（Quinones）24種、木脂素和香豆素（Lignans and Coumarins）73種、脂質(zhì)（Lipids）200種、有機(jī)酸類（Organic acids）102種、生物堿（Alkaloids）197種、鞣類（Tannins）5種、萜類（Terpenoids）78種、其他（Others）284種（圖2-A～B）?；贔old change > 2或< 0.5且p-value< 0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出79種差異代謝物，包括4種生物堿（Alkaloids）、8種氨基酸及其衍生物（Amino acids and derivatives）、1種苯及其取代衍生物（Benzene and substituted derivatives）、30種黃酮（Flavonoids）、6種木脂素和香豆素（Lignans and Coumarins）、5種脂質(zhì)（Lipids）、3種核苷酸及其衍生物（Nucleotides and derivatives）、3種有機(jī)酸類（Organic acids）、其他（Others）11種、1種酚酸類（Phenolic acids）、1種醌類（Quinones）、6種萜類（Terpenoids）（圖2-C）。上述結(jié)果顯示，黃酮類化合物是外源ABA處理后青花菜芽苗中差異最大的次生代謝物質(zhì)。

鑒于ABA處理后青花菜芽苗中黃酮類化合物的變化種類最為明顯，進(jìn)一步對(duì)30種明顯變化的黃酮類化合物進(jìn)行分析。如圖2-D所示，外源ABA處理后，青花菜芽苗中有3種黃酮類化合物含量明顯升高，分別為兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate）（1.80倍）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）（1.39倍）和桑色素（Morin）（2.06倍）；27種黃酮類化合物含量明顯降低，其中柚皮苷（Naringin）（13.4%）、銀鍛苷（Tiliroside）（14.3%）和枸橘苷（Poncirin）（15.2%）降低幅度最大。對(duì)30種明顯變化的黃酮類化合物進(jìn)行分類，結(jié)果顯示，二氫黃酮醇有5種，包括枸橘苷（Poncirin）、蕓香柚皮苷（Narirutin）、甲基條葉薊素（Cirsilineol）、柚皮素（Naringenin）、柚皮苷（Naringin）；二氫黃酮醇有2種，包括黃柏苷（Phellamurin）、黃柏環(huán)合苷（Phellodendroside）；黃酮有15種，包括川陳皮素（Nobiletin）、3，5，6，7，8，4'-六甲氧基黃酮（3，5，6，7，8，4'-Hexamethoxyflavone）、甜橙素（Sinensetin）、橘皮素（Tangeretin）、5，7，8，3'，4'-五甲氧基黃烷酮（5，7，8，3'，4'-Pentamethoxyflavanone）、3，5，7，3'，4'-五甲氧基黃酮（3，5，7，3'，4'-Pentamethoxyflavone）、3'，4'，5'，5，7-五甲氧基黃酮（3'，4'，5'，5，7-Pentamethoxyflavone）、5，4'-二羥基-3，6，7，3'-四甲氧基黃酮-4'-O-葡萄糖苷（5，4'-Dihydroxy-3，6，7，3'-tetramethoxyflavone-4'-O-glucoside）、5，7，8，4'-四甲氧基黃酮（5，7，8，4'-Tetramethoxyflavone）、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮（5，6，7，3'，4'，5'-hexamethoxyflavone）、5-羥基-3，7，3'，4'-四甲氧基黃酮（5-Hydroxy-3，7，3'，4'-tetramethoxyflavone）、去甲基川陳皮素（5-Demethylnobiletin）、5，6，7，8-四甲氧基黃酮（5，6，7，8-Tetramethoxyflavone）、5，6，7，4'-四甲氧基黃酮（5，6，7，4'-Tetramethoxyflavone）和蒙花苷（Linarin）；黃酮醇有5種，包括3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮（3，5，6，7，8，3'，4'-Heptamethoxyflavone）、銀鍛苷（Tiliroside）、3-羥基-3-甲基戊二酸（3-hydroxy-3-methylglutarate）、山柰酚-3-O-槐糖苷-7-O-（2''-阿魏酰）葡萄糖苷[Kaempferol-3-O-sophoroside-7-O-（2''-Feruloyl）glucoside]和桑色素（Morin）；黃烷醇有3種，包括沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯（Gallocatechin 3-O-gallate）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)量數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估

試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共構(gòu)建了6個(gè)cDNA文庫(kù)。如表1所示，6個(gè)青花菜芽苗樣本經(jīng)過高通量測(cè)序共得到371 968 086個(gè)Clean reads，占Raw reads的97.31%。Q20堿基百分比在97.66%以上，Q30堿基百分比在93.27%以上，堿基GC含量在47.74%～48.12%之間，平均為47.92%。如圖3所示，處理組和對(duì)照組之間PCC值均大于0.99，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別貢獻(xiàn)44.79%和14.48%，且對(duì)照組和處理組在第1主成分上發(fā)生明顯區(qū)分。此外，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中挑選10個(gè)基因進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與熒光定量結(jié)果的相關(guān)性大于90%。上述結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量、組內(nèi)重復(fù)性和組間特異性均較好，可用于下一步數(shù)據(jù)分析。

2.4 轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析及富集分析

為探究外源ABA處理對(duì)青花菜芽苗轉(zhuǎn)錄水平的影響，筆者進(jìn)行了差異表達(dá)基因（DEGs）的篩選。以|Log2Fold Change| > 1且padj< 0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出799個(gè)差異表達(dá)基因（546個(gè)下調(diào)，253個(gè)上調(diào)）（圖4-A）。DEGs的GO富集結(jié)果顯示，細(xì)胞組成（Cellular component，CC）主要富集在含蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex）、細(xì)胞解剖學(xué)實(shí)體（Cellular anatomical entity），生物過程（Biological process，BP）主要富集在細(xì)胞過程（Cellular process）、應(yīng)激反應(yīng)（Response to stimulus）、代謝過程（Metabolic process），分子功能（Molecular Function，MF）主要富集在結(jié)合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（Transcription regulator activity）（圖4-B）。DEGs的KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集于次生代謝的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、植物-病原體相互作用（Plant?pathogen interaction）、MAPK信號(hào)（MAPK signaling pathway?plant）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）等通路（圖4-C）。

為篩選直接或間接調(diào)控黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵基因，對(duì)黃酮合成通路，前體物質(zhì)苯丙烷合成通路以及ABA合成通路進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。結(jié)果顯示，黃酮合成通路共篩選到1個(gè)下調(diào)表達(dá)的DEG；前體物質(zhì)苯丙烷合成通路篩選到5個(gè)DEGs，其中3個(gè)上調(diào)表達(dá)，2個(gè)下調(diào)表達(dá)，植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中篩選到32個(gè)DEGs，其中ABA合成相關(guān)DEGs共7個(gè)，1個(gè)上調(diào)表達(dá)，6個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖4-D）。

2.5 轉(zhuǎn)錄組和代謝組的聯(lián)合分析

代謝組分析數(shù)據(jù)顯示，外源ABA處理后青花菜芽苗中兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量明顯升高。同時(shí)，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從黃酮合成通路、前體物質(zhì)苯丙烷合成通路以及ABA合成通路中共篩選出13個(gè)DEGs。將上述13個(gè)DEGs和明顯升高的3種黃酮類化合物進(jìn)行皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果顯示上述13個(gè)基因與3種黃酮類化合物均滿足|PCC| ≥ 0.80且p-value ≤ 0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，將上述基因作為直接或間接調(diào)控黃酮類化合物生物合成的候選基因，其中黃酮合成通路中有1個(gè)基因，苯丙烷合成途徑中有5個(gè)基因，ABA合成通路中有7個(gè)基因，如表2所示。

基于轉(zhuǎn)錄-代謝聯(lián)合分析得到coefficient值及p-value值，結(jié)果顯示LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133的表達(dá)特征與兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素的含量變化呈正相關(guān)。使用Cytoscape 3.10繪制PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5所示，結(jié)果顯示，LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133均發(fā)生了上調(diào)，推測(cè)兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素的生物合成可能受LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133基因的正向調(diào)控，基因注釋結(jié)果顯示，上述3個(gè)基因分別注釋到野生甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的PYL4-like、CAD8和Peroxidase 58-like。與此同時(shí)，LOC106292610、LOC106299030、LOC106295669、LOC106308242、LOC106317377、LOC106313324、LOC106301902、LOC106322834、Novel.3636、Novel.2982的表達(dá)特征與兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)上述基因可能對(duì)該3種黃酮類物質(zhì)的生物合成具有負(fù)向調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物是植物界中廣泛存在的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，幾乎存在于所有植物的根、莖、葉、花和種子中[21]，在許多生理過程和環(huán)境響應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用[22]，且其合成積累易受到多種環(huán)境因素影響[8-23]。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的黃酮、黃酮醇、黃烷醇和花青素會(huì)被誘導(dǎo)合成，以增強(qiáng)植物的抗氧化能力[24]。此外，不同的黃酮類化合物可以預(yù)防腫瘤和炎癥反應(yīng)起到抗癌作用[25]。植物激素脫落酸在非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，因此也被稱為“應(yīng)激激素”[26]，其會(huì)誘導(dǎo)氣孔的閉合以及作為一種化學(xué)信號(hào)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[27]。有研究報(bào)道，外源ABA可通過影響植物內(nèi)源ABA的合成，通過促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成以提高植物對(duì)逆境的抗性，減緩脅迫傷害[24]。為探究外源ABA促進(jìn)青花菜芽苗黃酮類化合物生物合成的作用機(jī)制，筆者的試驗(yàn)借助廣泛靶向代謝組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了外源ABA處理后青花菜芽苗中黃酮類化合物差異代謝物及差異基因。經(jīng)外源ABA處理后，青花菜芽苗代謝物中差異數(shù)量最多的為黃酮類化合物。有研究報(bào)道，植物經(jīng)非生物脅迫會(huì)激活苯丙烷生物合成途徑，進(jìn)而作為黃酮類化合物的前體物質(zhì)影響其生物合成。通過對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，干旱脅迫會(huì)調(diào)節(jié)苯丙烷途徑主要酶的關(guān)鍵基因，從而誘導(dǎo)類黃酮的積累[28]。因此，當(dāng)對(duì)青花菜芽苗噴施外源ABA后，黃酮類化合物合成的變化可能是由苯丙烷合成途徑引起的。

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)多樣，其基本結(jié)構(gòu)是糖苷元，可通過酶促修飾產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異進(jìn)而造成功能的多樣性，不同的黃酮具有多種生物學(xué)功能[29-30]。經(jīng)外源ABA處理后，青花菜芽苗中含量明顯變化的黃酮類物質(zhì)主要是二氫黃酮、黃酮醇和黃烷醇，如含量明顯升高的兒茶素沒食子酸酯（1.80倍）和表兒茶素沒食子酸酯（1.39倍）均為黃烷醇類化合物。有研究報(bào)道，黃烷醇由于具有抗氧化特性，是天然存在的植物性營(yíng)養(yǎng)素，也是因其具有強(qiáng)大的抗氧化和自由基清除活性的特征，在植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)中起重要作用[24]。眾所周知，脫落酸是一種重要的植物激素，與干旱密切相關(guān)。當(dāng)植物遭受干旱脅迫時(shí)，黃酮類化合物中兒茶素的合成會(huì)被明顯誘導(dǎo)，從而增強(qiáng)抗逆能力，這在茶樹中已被證實(shí)[30]。因此，用外源ABA噴施青花菜芽苗時(shí)，植物受到刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，可能通過增加兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯含量來(lái)增強(qiáng)芽苗的抗氧化性，這與前人的研究結(jié)果一致。

黃酮類化合物是由苯丙氨酸通過苯丙烷途徑合成的，莽草酸途徑合成苯丙氨酸，苯丙氨酸通過苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）、4-香豆素CoA連接酶（4CL）等作用合成黃酮類化合物[31]。筆者從苯丙烷合成通路中共篩選到5個(gè)差異表達(dá)基因，經(jīng)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)LOC106329559和LOC106326133的表達(dá)特征與兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量呈明顯正相關(guān)。同時(shí)在ABA合成通路上篩選到與兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素含量呈正相關(guān)的LOC106337270基因。LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133分別注釋到野生甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的PYL4-like、CAD8和Peroxidase 58-like。前人的研究結(jié)果顯示，干旱脅迫可誘導(dǎo)CAD轉(zhuǎn)錄水平升高，而誘導(dǎo)其表達(dá)途徑之一即為ABA信號(hào)通路[33]；PYL4-like基因是在干旱耐受性調(diào)節(jié)中起作用的脫落酸受體，在擬南芥中將其過表達(dá)會(huì)增強(qiáng)抗旱性[32]。因此，基于本研究的結(jié)果，筆者推測(cè)LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133可響應(yīng)ABA信號(hào)參與調(diào)控黃酮類化合物的生物合成，后續(xù)的研究將圍繞基因功能和調(diào)控機(jī)制開展相關(guān)研究。

綜上所述，通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組揭示對(duì)青花菜芽苗噴施外源50 μmol·L-1的ABA會(huì)影響黃酮類化合物的合成。代謝組結(jié)果顯示，共獲得79種差異代謝物，其中黃酮類化合物種類最多，共30種，其中桑色素、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯含量明顯增加，柚皮苷、銀鍛苷、枸橘苷含量明顯降低。轉(zhuǎn)錄組分析共得到799個(gè)差異基因，通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，由黃酮合成途徑、苯丙烷合成途徑以及ABA激素合成途徑共篩選出13個(gè)相關(guān)調(diào)控基因，其中LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133對(duì)兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和桑色素的生物合成具有正向調(diào)控的潛在作用，可作為ABA調(diào)控青花菜芽苗黃酮類化合物生物合成的候選基因開展后續(xù)的基因功能和調(diào)控機(jī)制研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 張德純．青花菜[J]．中國(guó)蔬菜，2016（2）：58．

[2] 李占省，劉玉梅，韓風(fēng)慶，等．“十三五”我國(guó)青花菜遺傳育種研究進(jìn)展[J]．中國(guó)蔬菜，2021（1）：33-40．

[3] 劉二艷．青花菜花球外觀品質(zhì)性狀的遺傳分析及分子標(biāo)記研? ? ? ? ? ? ?究[D]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009．

[4] 高詩(shī)薇．西藍(lán)花芽苗中生物活性物質(zhì)的富集工藝研究與應(yīng)用[D]．西安：西北大學(xué)，2022．

[5] 孫勃，許映君，徐鐵鋒，等．青花菜不同器官生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J]．園藝學(xué)報(bào)，2010，37（1）：59-64．

[6] ISAH T．Stress and defense responses in plant secondary metabolites production[J]．Biological Research，2019，52（1）：39

[7] KUMAR S，PANDEY A K．Chemistry and biological activities of flavonoids：An overview[J]．Scientific World Journal，2013：162750．

[8] SONG Q L，JI K，YU X P，et al．Dynamic metabolic and transcriptomic profiling reveal synthetic characters and regulators of flavonoid biosynthesis in Camellia oleifera seeds[J]．Industrial Crops and Products，2022，186：115295．

[9] NGUYEN H N，KIM J H，KWON J，et al．Characterization of Arabidopsis thaliana FLAVONOL SYNTHASE1（FLS1）-overexpression plants in response to abiotic stress[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2016，103：133-142．

[10] TAO X Y，WU Q，AALIM H，et al．Effects of exogenous abscisic acid on bioactive components and antioxidant capacity of postharvest tomato during ripening[J]．Molecules，2020，25（6）：1346．

[11] HAO J，LOU P P，HAN Y D，et al．Ultraviolet-B irradiation increases antioxidant capacity of pakchoi （Brassica rapa L.） by inducing flavonoid biosynthesis[J]．Plants，2022，11（6）：766．

[12] 林春草，陳大偉，戴均貴．黃酮類化合物合成生物學(xué)研究進(jìn)展[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2022，57（5）：1322-1335．

[13] 李婷婷，國(guó)靖，汪貴斌．外源ABA對(duì)銀杏葉黃酮類化合物體內(nèi)合成的影響[J]．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2023，47（4）：88-94．

[14] LIU R，BAO Z X，ZHAO P J，et al．Advances in the study of metabolomics and metabolites in some species interactions[J]．Molecules，2021，26（11）：3311．

[15] GUIJAS C，MONTENEGRO-BURKE J R，WARTH B，et al．Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype[J]．Nature Biotechnology，2018，36（4）：316-320．

[16] LAMAS A，REGAL P，V?ZQUEZ B，et al．Transcriptomics：A powerful tool to evaluate the behavior of foodborne pathogens in the food production chain[J]．Food Research International，2019，125：108543．

[17] 薛守宇，朱濤，李冰冰，等．轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析在植物中的應(yīng)用研究[J]．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，42（3）：1-13．

[18] SUN W J，HAO J H，F(xiàn)AN S X，et al．Transcriptome and metabolome analysis revealed that exogenous spermidine-modulated flavone enhances the heat tolerance of lettuce[J]．Antioxidants，2022，11（12）：2332．

[19] YAN H Q，ZHENG W，WANG Y，et al．Integrative metabolome and transcriptome analysis reveals the regulatory network of flavonoid biosynthesis in response to MeJA in Camellia vietnamensis huang[J]．International Journal of Molecular Sciences，2022，23（16）：9370．

[20] WU W X，LUO X M，WANG Y，et al．Combined metabolomics and transcriptomics analysis reveals the mechanism underlying blue light-mediated promotion of flavones and flavonols accumulation in ligusticum chuanxiong hort．microgreens[J]．Journal of Photochemistry and Photobiology Bbiology，2023，242：112692．

[21] SHEN N，WANG T F，GAN Q，et al．Plant flavonoids：Classification，distribution，biosynthesis，and antioxidant activity[J]．Food Chemistry，2022，383：132531．

[22] TAN Z Y，DENG J，YE Q X，et al．The antibacterial activity of natural-derived flavonoids[J]．Current Topics in Medicinal Chemistry，2022，22（12）：1009-1019．

[23] WANG Y Y，SHI Y F，LI K Y，et al．Roles of the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase superfamily in the flavonoid pathway：A review of the functional diversity of F3H，F(xiàn)NS I，F(xiàn)LS，and LDOX/ANS[J]．Molecules，2021，26（21）：6745．

[24] ZHUANG W B，LI Y H，SHU X C，et al．The classification molecular structure and biological biosynthesis of flavonoids and their roles in biotic and abiotic stresses[J]．Molecules，2023，28（8）：3599．

[25] LI G X，DING K Y，QIAO Y L，et al．Flavonoids regulate inflammation and oxidative stress in cancer[J]．Molecules，2020，25（23）：5628．

[26] EMENECKER R J，STARDER L C．Auxin-abscisic acid interactions in plant growth and development[J]．Biomolecules，2020，10（2）：281．

[27] LIM C W，BAEK W，JUNG J，et al．Function of ABA in stomatal defense against biotic and drought stresses[J]．International Journal of Molecular Sciences，2015，16（7）：15251-15270．

[28] SHARMA A，SHAHZAD B，REHMAN A，et al．Response of phenylpropanoid pathway and the role of polyphenols in plants under abiotic stress[J]．Molecules，2019，24（13）：2452．

[29] ANTONI R，GONZALEZ-GUZMAN M，RODRIGUEZ L，et al．PYRABACTIN RESISTANCE1-LIKE8 plays an important role for the regulation of abscisic acid signaling in root[J]．Plant Physiology，2013，161（2）：931-941．

[30] GAI Z S，WANG Y，DING Y Q，et al．Exogenous abscisic acid induces the lipid and flavonoid metabolism of tea plants under drought stress[J]．Scientific Reports，2020，10（1）：12275．

[31] LIU W X，F(xiàn)ENG Y，YU S H，et al．The flavonoid biosynthesis network in plants[J]．International Journal of Molecular Sciences，2021，22（23）：12824．

[32] TAHMASEBI A，NIAZI A，AKRAMI S．Integration of meta-analysis，machine learning and systems biology approach for investigating the transcriptomic response to drought stress in Populus species[J]．Scientific Reports，2023，13（1）：3111．

[33] PREISNER M，WOJTASIK W，KOSTYN K，et al．The cinnamyl alcohol dehydrogenase family in flax：Differentiation during plant growth and under stress conditions[J]．Journal of Plant Physiology，2018，221：132-143．

收稿日期：2023-09-08；修回日期：2023-12-13

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ30297，2023JJ20027）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃埔創(chuàng)新研究院項(xiàng)目（2022xczx085）

作者簡(jiǎn)介：唐晨晨，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟似焚|(zhì)調(diào)控。E-mail：1905556085@qq.com

通信作者：王軍偉，男，副教授，研究方向?yàn)槭卟似焚|(zhì)調(diào)控與設(shè)施蔬菜栽培生理。E-mail：JunweiWang87@126.com