郭志海　王鵬凱　郄紅麗等

摘要：利用已報(bào)道的iPBS引物2249 和3個(gè)楊梅品種的DNA為模板進(jìn)行iPBS-PCR擴(kuò)增，采用單因素法對(duì)楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系的4個(gè)組分（dNTP、Mg2+、引物、模板）用量進(jìn)行優(yōu)化，確定了楊梅iPBS-PCR 20 μL反應(yīng)體系：2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA。梯度PCR試驗(yàn)表明可以參考iPBS引物Tm值確定退火溫度。利用上述體系對(duì)隨機(jī)取樣的10個(gè)品種用4條iPBS引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到了條帶清晰、多態(tài)性好的iPBS譜帶。

關(guān)鍵詞：楊梅；iPBS-PCR；體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)： S667.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0051-04

收稿日期：2015-05-13

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）2011]；江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2012361）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：20120389）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程[編號(hào)：SXGC（2014）076]。

作者簡(jiǎn)介：郭志海（1965—），男，江蘇江陰人，高級(jí)農(nóng)藝師、副教授，主要從事園藝種質(zhì)資源研究。E-mail：Gzh8115@163.com。

通信作者：王鵬凱，講師，主要從植物分子生物學(xué)研究。E-mail：mengxiao02181@hotmail.com。楊梅（Myrica rubra） 是楊梅科楊梅屬常綠小喬木，原產(chǎn)于我國(guó)，主要生長(zhǎng)在長(zhǎng)江流域以南的丘陵山地。楊梅果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較強(qiáng)的保健功能，是南方經(jīng)濟(jì)效益較高的水果之一[1]。我國(guó)楊梅栽培歷史悠久，生態(tài)環(huán)境的多樣性產(chǎn)生了性狀多樣的品種、品系和類(lèi)型，形成了豐富的種質(zhì)資源。利用形態(tài)學(xué)、同工酶等方法鑒定楊梅種質(zhì)資源局限性大、效率低。因此，常利用分子標(biāo)記對(duì)楊梅種質(zhì)資源進(jìn)行分析，包括遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、品（雜）種鑒別等方面。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR、iPBS、ScoT等技術(shù)[2-7]在楊梅中都已得到應(yīng)用[8]。

iPBS是以L(fǎng)TR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的一種分子標(biāo)記技術(shù)，針對(duì)LTR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中2個(gè)PBS（引物結(jié)合位點(diǎn)）區(qū)間進(jìn)行擴(kuò)增[9]。該方法簡(jiǎn)單、有效，可節(jié)約大量人力、物力，不用預(yù)先獲知LTR序列，直接進(jìn)行引物篩選。目前，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于亞麻[10]、大麥、小麥、蘋(píng)果、玉米[9]、葡萄[11]等的研究。當(dāng)材料、方法不同時(shí)，需對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化才能得出更科學(xué)的標(biāo)記譜帶。本研究利用單因素試驗(yàn)對(duì)楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)電泳結(jié)果的分析建立了楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系。同時(shí)利用該反應(yīng)體系對(duì)已有的iPBS引物進(jìn)行初步篩選，研究結(jié)果將為使用iPBS標(biāo)記評(píng)價(jià)、鑒定楊梅種質(zhì)資源提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的楊梅種質(zhì)資源材料均采自江蘇省太湖常綠果樹(shù)技術(shù)推廣中心國(guó)家楊梅種質(zhì)資源圃，楊梅品種為晚稻（浙江舟山）、狗色頭（江蘇常熟）、浪蕩子（江蘇蘇州東山）。PCR試劑購(gòu)于TaKaRa公司（10×rTaq buffer，2.5 μmol/L dNTP，25 μmol/L MgCl2，5 U/μL rTaq ），引物由上海生工合成（溶解至10 μmol/L）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1楊梅DNA提取與檢測(cè)楊梅基因組DNA提取采用改良CTAB快速提取法[12]。將楊梅嫩葉直接在CTAB提取液中勻漿，經(jīng)過(guò)抽提、沉淀、溶解等步驟得到基因組DNA溶液。獲得的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm 處的吸光度，用于測(cè)算DNA純度（D260 nm/D280 nm）、濃度（D260 nm）。完成濃度測(cè)定的DNA溶液進(jìn)一步稀釋成10 ng/μL的工作液，用于后續(xù)PCR反應(yīng)。

1.2.2楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化楊梅iPBS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，選擇在葡萄iPBS-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中使用的2249引物（5′-AACCGACCTCTGATACCA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示該引物在楊梅中擴(kuò)增效果較好）[11]。采用單因素法對(duì)2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、模板用量進(jìn)行試驗(yàn)，其中包括：（1）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，0.2 μL Taq酶，1.6 μL dNTP，Mg2+用量設(shè)為1.2、1.4、1.6、1.8 μL，DNA模板用量設(shè)為5、10、15、20、25、30、50 ng，用以確定最佳Mg2+和模板DNA用量。（2）2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL dNTP，1.6 μL Mg2+，0.2 μL Taq酶，2 249引物用量設(shè)為1、2 μL，DNA模板用量設(shè)為10、20、30、40 ng，用以確定引物與模板的最佳比例和用量；（3）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，30 ng DNA模板，0.2 μL Taq酶，1.6 μL Mg2+，dNTP用量設(shè)為1.2、1.6、2.0 μL，用以確定dNTP的最佳用量。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)對(duì)不同反應(yīng)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出適合楊梅iPBS-PCR最佳反應(yīng)體系。

1.2.3楊梅iPBS-PCR反應(yīng)程序本試驗(yàn)中楊梅iPBS-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，49～59 ℃（2 ℃/梯度，共6個(gè)梯度）退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物評(píng)價(jià)方法與“1.2.2”節(jié)相同，顯示出退火溫度對(duì)楊梅iPBS-PCR反應(yīng)的影響，用以確定最佳退火溫度。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取與質(zhì)量控制

電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明得到的楊梅基因組DNA主帶明亮，無(wú)明顯拖尾，經(jīng)RNA酶處理后RNA降解較好。分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明70 mg新鮮葉片可以得到2～3 μg基因組DNA，經(jīng)RNA酶處理后D260 nm/D280 nm在1.65～1.90之間，純度較好。

2.2PCR反應(yīng)各因素對(duì)iPBS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

選用3個(gè)品種的楊梅基因DNA進(jìn)行iPBS-PCR反應(yīng)，測(cè)試不同反應(yīng)體系下的擴(kuò)增效果，篩選PCR反應(yīng)各因素的優(yōu)化組合。

2.2.1Mg2+濃度對(duì)iPBS-PCR的影響PCR反應(yīng)中的Mg2+對(duì)擴(kuò)增的特異性和Taq酶活性有明顯的影響。隨著Mg2+用量的增加，擴(kuò)增出的譜帶逐漸增多且亮度也逐步增加，彌散情況基本良好，有利于譜帶的判讀；但Mg2+用量增至1.8 μL時(shí)，部分譜帶的彌散程度有所增加，可能增加差異較小的譜帶判讀難度，進(jìn)而影響后續(xù)的結(jié)果分析。為了結(jié)果的一致性，在測(cè)試時(shí)設(shè)置了7個(gè)模板用量（5、10、15、20、25、30、50 ng），發(fā)現(xiàn)Mg2+用量對(duì)iPBS-PCR的影響在不同模板量的情況下是一致的（圖2）。因此，在本研究中1.2～1.8 μL Mg2+用量均適宜楊梅的iPBS-PCR反應(yīng)，但是為了平衡譜帶數(shù)量和判讀質(zhì)量，在后續(xù)試驗(yàn)中Mg2+用量固定為1.6 μL。

2.2.2模板DNA用量對(duì)iPBS-PCR的影響模板用量是PCR體系的重要影響因素，楊梅iPBS-PCR的預(yù)試驗(yàn)中就發(fā)現(xiàn)100 ng以上的模板用量會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。當(dāng)Mg2+用量固定為1.6 μL時(shí)在5～50 ng模板量范圍內(nèi)，模板量的改變對(duì)iPBS-PCR影響較大（圖3）。當(dāng)模板量增加時(shí)，擴(kuò)增出的譜帶逐漸增多、亮度也有所增加，并且這種影響在3個(gè)楊梅品種中具有一致性；對(duì)于得到譜帶較多的品種，當(dāng)模板量增至50 ng時(shí)彌散程度增加，影響了結(jié)果分析。因此 綜合考慮以上結(jié)果，確定后續(xù)試驗(yàn)中模板DNA用量為30 ng。

2.2.3引物用量對(duì)iPBS-PCR的影響引物用量對(duì)擴(kuò)增的特異性和譜帶的清晰度有明顯影響。當(dāng)引物用量由1 μL增加至2 μL后，譜帶數(shù)量減少且彌散情況比較嚴(yán)重， 譜帶的特

征性也發(fā)生變化；本試驗(yàn)中同時(shí)使用3個(gè)品種、4個(gè)模板梯度，電泳結(jié)果顯示引物用量增加對(duì)楊梅iPBS-PCR的影響是一致的（圖4）。因此，綜合分析電泳結(jié)果，確定后續(xù)試驗(yàn)中引物用量為1 μL。

2.2.4dNTP用量對(duì)iPBS-PCR的影響dNTP用量與PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率關(guān)系密切。當(dāng)dNTP用量為1.2 μL時(shí)，擴(kuò)增效率低、譜帶亮度不足；隨著dNTP用量增加，條帶逐漸變亮，但是過(guò)多的dNTP（2.0 μL）會(huì)使譜帶中的主帶亮度大大增加，從而影響其它條帶的判讀（圖5）。因此，后續(xù)試驗(yàn)中dNTP用量確定為1.6 μL。

2.2.5楊梅iPBS-PCR最優(yōu)化體系通過(guò)一系列的單因素測(cè)試，綜合分析電泳結(jié)果，建立20 μL楊梅iPBS-PCR擴(kuò)增體系（表1）。

表1楊梅iPBS-PCR優(yōu)化體系

成分加入量（μL）10×Taq buffer2.025 mmol/L Mg2+1.62.5 mmol/L dNTP1.610 μmol/L 引物1.05 U/μL Taq酶0.210 ng/μL 模板DNA1.0滅菌ddH2O12.6

2.3退火溫度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響及楊梅iPBS-PCR優(yōu)化體系驗(yàn)證

2.3.1退火溫度對(duì)iPBS擴(kuò)增反應(yīng)的影響PCR程序中的退火溫度直接決定了引物擴(kuò)增的效果，對(duì)產(chǎn)物的特異性有重要的影響。在分子標(biāo)記中，退火溫度可以直接影響譜帶特征。報(bào)道的引物2249理論退火溫度為51 ℃，合成報(bào)告Tm值為53 ℃，為檢測(cè)不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響，以浪蕩子為材料，在“2.2.5”節(jié)優(yōu)化體系的基礎(chǔ)上設(shè)置49～59 ℃（2 ℃/梯度）共6個(gè)退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；電泳結(jié)果顯示隨著退火溫度的升高，得到的譜帶逐漸減少，譜帶特征發(fā)生很大變化（圖6）；比較發(fā)現(xiàn)以Tm值（53 ℃）為退火溫度得到的譜帶數(shù)目較多且比較清晰， 因此在選擇不同引物退火溫度時(shí)推薦使用Tm值作為參考進(jìn)行上下調(diào)節(jié)。

2.3.2優(yōu)化體系下的擴(kuò)增效果從楊梅資源圃中隨機(jī)挑選10個(gè)品種提取DNA，并在已報(bào)道的iPBS引物中隨機(jī)選擇4條引物，以?xún)?yōu)化后的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)、引物Tm值作為退火溫度，進(jìn)行iPBS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證優(yōu)化體系和退火溫度設(shè)置的有效性。結(jié)果（圖7）顯示，4條引物均擴(kuò)增出清晰的譜帶且多態(tài)性明顯，說(shuō)明上述優(yōu)化體系的確適用于楊梅iPBS分子標(biāo)記。

3結(jié)論與討論

高等植物中過(guò)半的重復(fù)DNA由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子組成，它們散布于各染色體上，是動(dòng)態(tài)的基因組組件，有能力整合新的拷貝，促進(jìn)內(nèi)部染色體重組[13]。用其開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，信息量高，多態(tài)性好，但是iPBS分子標(biāo)記也是基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記，雖然多態(tài)性非常豐富，但是與其他分子標(biāo)記一樣受到多種因素的影響。試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性與PCR反應(yīng)體系和條件關(guān)系很大，因此在使用前需要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。PCR體系中的各個(gè)組分不僅在絕對(duì)用量方面決定反應(yīng)的擴(kuò)增效果，各個(gè)組分之間的比例也會(huì)對(duì)反應(yīng)造成影響。除此以外，擴(kuò)增程序尤其是退火溫度對(duì)iPBS分子標(biāo)記的譜帶特征影響非常大，本試驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果同樣支持此觀點(diǎn)。綜合本試驗(yàn)的擴(kuò)增結(jié)果，可以看出楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系中的各個(gè)組分在一定的用量范圍內(nèi)均可以得到較好的擴(kuò)增效果， 因此在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該根據(jù)引物和模板的實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，最終得到最佳效果的分子標(biāo)記譜帶信息。本研究利用單因素法獲得了適用于楊梅iPBS標(biāo)記檢測(cè)的PCR體系，即在20 μL反應(yīng)體系中：2 μL 10 × Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA，滅菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。該反應(yīng)體系重復(fù)性好，多態(tài)性高，有利于譜帶的判讀。本試驗(yàn)結(jié)果將為利用iPBS-PCR技術(shù)進(jìn)行楊梅種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)及鑒定提供技術(shù)支持，也將為應(yīng)用于其他植物的研究提供借鑒。

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