馬珊珊,吳 月,朱 莉,陸晨陽(yáng),左春林

橋本甲狀腺炎(hashimoto thyroiditis, HT)為自身免疫性甲狀腺炎的一種亞型,主要臨床表現(xiàn)為甲狀腺功能減退。Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為HT患者甲狀腺功能減退的原因之一[1]。子宮球蛋白相關(guān)蛋白1 (uteroglobin-related protein 1, UGRP1)是一種分泌性蛋白,由SCGB3A2基因編碼,在氣管、支氣管和肺泡上皮細(xì)胞中高表達(dá),在甲狀腺中表達(dá)較少。UGRP1是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1 (thyroid transcription factor-1, TTF-1)的下游靶點(diǎn),TTF-1基因在AITD患者的甲狀腺中表達(dá)升高[2],表明UGRP1可能與AITD疾病相關(guān)。既往研究[1]表明HT患者的甲狀腺組織中Fas、UGRP1表達(dá)呈陽(yáng)性,UGRP1表達(dá)陽(yáng)性的甲狀腺細(xì)胞較UGRP1表達(dá)陰性的甲狀腺細(xì)胞IL-1β強(qiáng)表達(dá),并在人原代甲狀腺細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了IL-1β可時(shí)間、劑量依賴性上調(diào)甲狀腺細(xì)胞Fas、UGRP1表達(dá)。在HT疾病發(fā)展中IL-1β可促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞Fas表達(dá)上調(diào),Fas為凋亡因子,能夠與FasL結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而目前UGRP1的功能以及其與Fas介導(dǎo)的凋亡通路是否相關(guān)尚不明確。該研究檢測(cè)了橋本甲狀腺炎患者UGRP1表達(dá)水平并驗(yàn)證了UGRP1與Fas介導(dǎo)的凋亡通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 正常人甲狀腺細(xì)胞、HT患者甲狀腺細(xì)胞取自醫(yī)院腫瘤學(xué)細(xì)胞室的甲狀腺穿刺細(xì)胞學(xué)的甲狀腺細(xì)胞。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PJ 2012-02-08),受試者均簽署了知情同意書(shū)。

1.1.2細(xì)胞系及主要試劑 大鼠甲狀腺細(xì)胞FRTL-5(美國(guó)ATCC公司);UGRP1質(zhì)粒、Fas質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒(漢尹生物科技上海有限公司);胎牛血清(維森特生物技術(shù)南京有限公司);高糖DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物技術(shù)股份有限公司);0.25%胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);HiFectPlus轉(zhuǎn)染試劑(南京艾科軼生物科技有限公司); SYBR qPCR Master MIX(上海吐露港生物科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翌圣生物科技上海有限公司);引物由上海生工生物工程有限公司合成;甲狀腺應(yīng)用VividE95彩色多普勒超聲診斷儀器、探頭頻率7.0 ～ 12.0 MHz進(jìn)行檢查;免疫組化一抗：兔抗人ugrp1多克隆抗體購(gòu)自北京博森生物技術(shù)有限公司;二抗：PV6000山羊抗兔IgG/HRP聚合物、DAB試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)方法 選取正常人、HT患者各5人,每人的穿刺細(xì)胞學(xué)甲狀腺細(xì)胞取2張樣本玻片,分別進(jìn)行HE染色和UGRP1免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)步驟：37℃溫箱條件下石蠟切片予內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育30 min,0.3% TRIton-X100溶液30 min;加入一抗(1 ∶500),4 ℃冰箱過(guò)夜;滴加即用型二抗孵育30 min,DAB顯色液2 min,純水沖洗,蘇木精復(fù)染30 s,純水沖洗,自然風(fēng)干后中性樹(shù)脂封片。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將FRTL-5細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,在 37 ℃、5% CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí),用胰酶細(xì)胞消化液消化,按1/2或1/3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FRTL-5細(xì)胞, 用HiFectPlus分別轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒、UGRP1質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒、Fas質(zhì)粒,在37 ℃、5% CO2條件下轉(zhuǎn)染12 h,構(gòu)建空載體質(zhì)粒組、UGRP1質(zhì)粒組;空載體質(zhì)粒組、Fas質(zhì)粒組(n=6)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4RT-qPCR法檢測(cè)mRNA 采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,參考熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt法比較分析目的基因mRNA 表達(dá)水平。引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在光鏡下分析,排除非特異染色的前提下,甲狀腺細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為UGRP1陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 UGRP1在正常人與HT患者甲狀腺組織中的表達(dá)正常人甲狀腺組織UGRP1表達(dá)陰性,HT患者UGRP1呈陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 正常人與HT患者甲狀腺組織UGRP1的表達(dá) IHC ×200

2.2 FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGRP1質(zhì)粒后UGRP1 mRNA及fas mRNA表達(dá)的變化FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGRP1質(zhì)粒后,UGRP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組UGRP1 mRNA相對(duì)值較空載體轉(zhuǎn)染組升高(P<0.000 1,t=15.69),UGRP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Fas mRNA相對(duì)值較空載體轉(zhuǎn)染組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.732,t=0.354 6 )。見(jiàn)圖2。

圖2 FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGRP1質(zhì)粒后UGRP1 mRNA、Fas mRNA表達(dá)的變化

2.3 FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fas質(zhì)粒后Fas mRNA及UGRP1 mRNA表達(dá)的變化FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fas質(zhì)粒后,Fas質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Fas mRNA相對(duì)值較空載體轉(zhuǎn)染組升高(P<0.000 1,t=42.27),Fas質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組UGRP1 mRNA相對(duì)值較空載體轉(zhuǎn)染組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,t=15.22)。見(jiàn)圖3。

圖3 FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fas質(zhì)粒后Fas mRNA、UGRP1 mRNA表達(dá)的變化

3 討論

自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)是免疫系統(tǒng)異常激活并允許自身反應(yīng)性B細(xì)胞和T細(xì)胞靶向甲狀腺所導(dǎo)致的自身免疫性疾病。AITD主要包括格雷夫斯病(Graves′disease,GD)和HT,其中GD以甲狀腺毒癥為主要表現(xiàn),但部分GD患者在自然病程中可表現(xiàn)為甲狀腺功能減退[3],這一甲狀腺功能表現(xiàn)多為HT患者的臨床表現(xiàn)。之前的研究[4]顯示甲狀腺組織UGRP1陽(yáng)性表達(dá)的GD患者經(jīng)過(guò)碘131治療后更容易發(fā)生甲狀腺功能減退,且UGRP1陽(yáng)性的GD患者的甲狀腺組織中體積較大、胞質(zhì)呈深嗜酸性和細(xì)顆粒狀、核仁明顯的細(xì)胞增多,這一特征與HT患者增多的Hürthle細(xì)胞相似[1],表明UGRP1可能為AITD轉(zhuǎn)化為HT的潛在預(yù)測(cè)因子。HT的發(fā)生發(fā)展與遺傳易感性、環(huán)境、免疫等因素相關(guān),體液免疫及細(xì)胞免疫共同參與導(dǎo)致甲狀腺組織淋巴漿細(xì)胞浸潤(rùn)、甲狀腺細(xì)胞損傷及萎縮、纖維化組織產(chǎn)生,最終臨床表現(xiàn)為甲狀腺功能減退[5]。HT患者甲狀腺組織中僅少數(shù)(2% ～ 3%)CD8+細(xì)胞對(duì)TG/TPO具有特異性[5],且其FasL表達(dá)較弱[6],因此淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)所產(chǎn)生的直接細(xì)胞毒性并非HT患者甲狀腺功能減退的主要原因。浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞所釋放的各種細(xì)胞因子、趨化因子可改變甲狀腺細(xì)胞膜蛋白完整性[7]及免疫[8],甲狀腺激素異位合成、甲狀腺細(xì)胞分泌CXCL10等可導(dǎo)致局部氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性因子級(jí)聯(lián)放大等,持續(xù)的免疫反應(yīng)介導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞Fas表達(dá)及FasL的表達(dá)上調(diào),最終促使了甲狀腺細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究[1]表明IL-1β可時(shí)間、劑量依賴性上調(diào)甲狀腺細(xì)胞Fas和UGRP1的表達(dá),并采用免疫組化雙染技術(shù)驗(yàn)證了HT患者的甲狀腺組織中Fas與UGRP1在同一區(qū)域共表達(dá)。綜合以上,考慮UGRP1可能參與了HT疾病的發(fā)展,但其具體功能及其與Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的相關(guān)性仍未明確。

既往研究表明HT患者甲狀腺組織中Fas表達(dá)呈陽(yáng)性,本研究表明HT患者組織中UGRP1表達(dá)亦呈陽(yáng)性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,UGRP1與Fas介導(dǎo)的凋亡通路具有相關(guān)性。FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGRP1后Fas基因的表達(dá)無(wú)明顯變化,表明UGRP1可能未直接參與Fas基因表達(dá)的調(diào)控;FRTL-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fas后UGRP1基因的表達(dá)上調(diào),表明UGRP1可能為Fas下游的表達(dá)基因。

HT患者外周血UGRP1水平較正常人、GD患者顯著增高,AITD患者外周血UGRP1水平與TSH、T3、T4、ATG、甲狀腺體積無(wú)關(guān),與TPOAb正相關(guān)[9]。在AITD患者的外周血[9]及甲狀腺組織[10]中,UGRP1陽(yáng)性患者的甲狀腺激素、促甲狀腺激素水平與UGRP1陰性患者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,本研究中甲狀腺細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGRP1質(zhì)粒后Fas基因未見(jiàn)明顯變化,與之符合。甲狀腺過(guò)氧化物酶TPO為位于甲狀腺濾泡上皮頂端細(xì)胞膜上的膜結(jié)合糖蛋白,TPOAb可通過(guò)抗體和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和致敏T細(xì)胞損傷甲狀腺濾泡,其水平升高表明了甲狀腺局部炎性反應(yīng)的增強(qiáng)[11],其高水平可見(jiàn)于GD和HT患者,但有研究[12]表明TPOAb水平明顯升高的患者易發(fā)展為甲狀腺功能減退。AITD患者外周血[9]及甲狀腺組織[10]UGRP1水平與TPOAb水平正相關(guān),提示UGRP1可能參與了AITD發(fā)展為甲狀腺功能減退的過(guò)程。本研究表明甲狀腺細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fas質(zhì)粒后UGRP1基因表達(dá)上調(diào),表明橋本甲狀腺炎UGRP1高表達(dá)可能與Fas介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)。Fas是介導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡并致使HT患者甲狀腺功能減退的重要分子標(biāo)志物,但只能在甲狀腺組織中被檢測(cè)出來(lái),而UGRP1是Fas介導(dǎo)凋亡通路的下游分子標(biāo)志物,在HT患者甲狀腺組織及外周血中均可檢測(cè),推測(cè)UGRP1可能作為HT患者易于檢測(cè)的分子標(biāo)志物。

UGRP1為SCGB3A2編碼的分泌性蛋白,相關(guān)研究表明其有改善肺部炎癥、抗肺部纖維化、促胎肺成熟、抑制Lewis肺癌生長(zhǎng)[13]、抑制香煙煙霧中的丙烯醛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]等作用,提示UGRP1可能為一種作用廣泛的保護(hù)性蛋白。本研究驗(yàn)證了UGRP1為Fas介導(dǎo)的凋亡通路的下游分子標(biāo)志物,在Fas基因表達(dá)后,UGRP1可能因其具有抗凋亡作用而保護(hù)性上調(diào),或者UGRP1上調(diào)后發(fā)揮了促凋亡作用,又或者其僅作為一種伴隨蛋白,這些機(jī)制目前仍不清楚,需進(jìn)一步研究以明確UGRP1在AITD疾病發(fā)展中的作用。