束傳林,施曉蕊,朱如夢,周 青,汪 淵,王 怡,朱華慶

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁外壁的組成成分,是膿毒血癥的主要誘因。在臨床上膿毒血癥合并肝損傷是較常見的急危重癥之一,是膿毒血癥導(dǎo)致多器官功能障礙的一種表現(xiàn)形式[1]。自噬普遍發(fā)生于真核生物體內(nèi),是細胞通過溶酶體降解自身組分,以達到維持細胞內(nèi)正常生理活動及穩(wěn)態(tài)的一種細胞代謝過程。自噬小體是自噬形成的標(biāo)志性物質(zhì),內(nèi)容物為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原或其他細胞器及細胞質(zhì)成分。細胞通過自噬將胞內(nèi)的受損細胞器及異常大分子物質(zhì)包裹并運輸至溶酶體進行降解,保護肝臟細胞免受損害,維持細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝平衡及能量供應(yīng)[2]。此外,最近的研究[3]表明,自噬的變化是各種肝臟疾病的基礎(chǔ),包括脂肪肝、脂肪變性、病毒性肝炎、藥物或缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷等。

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是維生素A的天然代謝產(chǎn)物,作為一種新型抗炎藥物,在膿毒血癥治療中可以減少促炎細胞因子的產(chǎn)生[4]。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)是以ATRA為基礎(chǔ)設(shè)計合成的新型維甲酸衍生物,表現(xiàn)出比ATRA更好的溶解性[5]。該實驗以C57BL/6小鼠為研究對象,腹腔注射LPS造急性肝損傷模型,探究ATPR緩解小鼠急性肝損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 15只6周齡的C57BL/6雄性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),環(huán)境溫度(20±2) ℃,濕度40%～70%,12 h光照12 h黑暗交替。所有實驗動物的飼養(yǎng)與操作均符合安徽省實驗動物中心管理飼養(yǎng)條例[實驗動物使用許可證編號：SYXK(皖)2020-001,生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蘇)2018-0008,倫理批號：LLSC20210825]。

1.1.2實驗試劑 4%的戊巴比妥鈉由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;LPS購自美國Sigma公司;ATPR由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成;聚氧乙烯蓖麻油、2.5%戊二醛固定液(電鏡專用)購自上海源葉生物科技有限公司;多聚甲醛溶液、蛋白上樣緩沖液購自北京蘭杰柯科技有限公司;轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TRNzol Universal總RNA提取試劑購自北京天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自上海新貝生物科技有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;anti-LC3B、anti-P62、anti-Beclin1抗體、anti-FUNDC1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;anti-ATG5抗體、anti-OPA1抗體購自上海Abmart公司;anti-GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3實驗儀器 酶標(biāo)儀、高速低溫離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司;正置生物顯微鏡購自德國Leica公司;透射電子顯微鏡Talos L120C G2、化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDocTMTouch Imaging System購自美國Bio-Rad公司;-80 ℃超低溫冰箱購自日本SANYO電器股份有限公司; pH儀購自上海雷磁儀器廠;磁力攪拌器購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司;電泳儀、電泳槽購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立 15只C57BL/6雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,體質(zhì)量(22±2)g,隨機分成3組：正常組、模型組、ATPR組,每組5只。ATPR組腹腔注射ATPR 15 mg/(kg·d),正常組、模型組腹腔注射等體積的0.9% NaCl溶液(含25%聚氧乙烯蓖麻油),連續(xù)7 d進行以上操作,第8天模型組、ATPR組腹腔注射LPS 6 mg/kg,6 h后處死所有小鼠。

1.2.2動物樣本獲取及處理 使用4%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,眼球取血后處死小鼠,迅速取出肝臟組織,使用鋒利刀片切取長條狀,在2.5%戊二醛固定液里切成1 mm3以內(nèi)小塊,與2.5%戊二醛固定液一起置于4 ℃冰箱中固定;余下組織用預(yù)冷PBS溶液漂洗干凈后分成兩部分,一部分液氮急速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存待用,另一部分置于多聚甲醛中固定后進行石蠟包埋。取出的血液4 ℃靜置2 h后3 000 r/min離心10 min,收取血清置于-20 ℃冰箱待用。

1.2.3谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)檢測 收取的血清嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作,酶標(biāo)儀讀取吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算轉(zhuǎn)氨酶含量。

1.2.4qPCR 稱取肝臟組織加入TRNzol進行研磨,參考RNA提取試劑說明書得到總RNA,使用分光光度計測量純度和含量。按照逆轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒的說明書分別進行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR,計算小鼠肝臟組織炎癥因子白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的相對表達水平。引物序列如下：IL-6(F： 5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3′,R： 5′-AGTGGTA-TAGACAGGTCTGTTGG-3′);TNF-α(F： 5′-CCTGTA-GCCCACGTCGTAG-3′,R： 5′-GGGAGTAGACAAGG-TACAACCC-3′);GAPDH(F：5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′,R：5′- GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′)。

1.2.5蘇木精-伊紅(HE)染色 組織蠟塊切片脫蠟后,按常規(guī)方法進行HE染色,使用正置顯微鏡拍照并保存。

1.2.6透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察小鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu) 已固定的肝臟組織送往安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心,按照TEM生物樣品制備的基本步驟制樣,TEM下觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu),選取合適視野拍照并保存。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 取出-80 ℃冰箱保存的肝臟組織,剪取一部分稱重后轉(zhuǎn)入研磨器中,每0.1 g 組織加入1 ml RIPA裂解液(含1 mmol/L蛋白酶抑制劑),置于冰上研磨并使之充分裂解后,14 000 r/min離心30 min取上清液,采用BCA法測定蛋白濃度,樣本加入蛋白上樣緩沖液后沸水中煮10 min使蛋白變性,冰上降溫后分裝并置于-80 ℃冰箱待用。配制12% SDS-PAGE膠,按照每個泳道蛋白總量為10 μg上樣,電泳完成后在轉(zhuǎn)移液中將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜2 h。使用TBST洗滌條帶3次,再使用TBS洗滌條帶1次后切膜,按照條帶位置置于Anti-LC3B(1 ∶1 000)、Anti-P62(1 ∶1 000)、Anti-Beclin1(1 ∶1 000)、Anti-ATG5(1 ∶1 000)、Anti-FUNDC1(1 ∶1 000)、Anti-OPA1(1 ∶1 000)、Anti-GAPDH(1 ∶2 000)抗體中,4 ℃冰箱孵育12～18 h。使用TBST洗滌條帶3次,再使用TBS洗滌條帶1次,室溫孵育二抗羊抗兔(1 ∶5 000)或羊抗鼠(1 ∶3 000)2 h。使用TBST洗滌條帶3次,再使用TBS洗滌條帶1次,使用ECL發(fā)光試劑顯影。使用ImageJ軟件計算各條帶灰度值,GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ATPR對LPS損傷的小鼠血清ALT和AST的影響與正常組比較,模型組ALT和AST水平上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,ATPR組ALT和AST水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 ATPR對LPS損傷的小鼠血清ALT和AST的影響

2.2 ATPR對LPS損傷的小鼠肝臟組織炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA相對表達水平的影響與正常組比較,模型組炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA相對表達水平明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,ATPR組IL-6、TNF-α mRNA相對表達水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 ATPR對LPS損傷小鼠肝臟組織炎癥因子IL-6(A)、TNF-α(B) mRNA相對水平的影響

2.3 HE染色結(jié)果正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝索呈放射狀排列,無充血和炎性細胞浸潤,肝細胞邊界清晰;模型組小鼠肝臟細胞間隙增大,肝索排列發(fā)生紊亂,出現(xiàn)炎性細胞浸潤;ATPR組肝臟細胞間隙、肝索結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),炎性細胞浸潤較少。見圖2。

圖2 光學(xué)顯微鏡下小鼠肝臟HE染色結(jié)果

2.4 TEM觀察小鼠肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)與正常組比較,模型組小鼠肝細胞中線粒體出現(xiàn)嵴減少或消失和膜不完整的現(xiàn)象,受損線粒體數(shù)量明顯增多,脂滴數(shù)量增多;ATPR組小鼠肝細胞中線粒體形態(tài)和數(shù)量、脂滴數(shù)量趨于正常。見圖3。

圖3 TEM下小鼠肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)(圖中箭頭示自噬小體)

2.5 ATPR對LPS損傷小鼠肝臟線粒體損傷相關(guān)蛋白表達水平的影響Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織FUNDC1蛋白表達增多(P<0.01),OPA1蛋白表達減少(P<0.01);與模型組比較,ATPR組小鼠肝臟組織FUNDC1蛋白表達減少(P<0.01),OPA1蛋白表達增多(P<0.01)。見圖4。

圖4 ATPR對LPS損傷小鼠肝臟線粒體損傷相關(guān)蛋白FUNDC1(A)、OPA1(B)表達水平的影響

2.6 ATPR對LPS損傷小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織LC3BⅡ和LC3BⅠ的比值(LC3BⅡ/LC3BⅠ)減小(P<0.01),P62蛋白表達增多(P<0.01),Beclin1和ATG5蛋白表達減少(P<0.01);與模型組比較,ATPR組小鼠肝臟組織LC3BⅡ/LC3BⅠ增大(P<0.01),P62蛋白表達減少(P<0.01),Beclin1和ATG5蛋白表達增多(P<0.01)。見圖5。

圖5 ATPR對LPS損傷小鼠肝臟組織自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響

3 討論

ATRA是維生素A在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物,具有多種生物學(xué)功能,如降低關(guān)鍵炎癥信號蛋白磷酸化水平[4],轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)一些參與介導(dǎo)人體典型抗氧化反應(yīng)基因的表達水平[6]。ATRA在臨床上主要用于治療急性早幼粒細胞白血病,ATPR是以ATRA為基礎(chǔ)設(shè)計合成的衍生物,在多種腫瘤細胞中被證明具有優(yōu)于ATRA的高效抗腫瘤活性[7]。本研究中,LPS刺激后,小鼠血清中ALT和AST水平上升,肝臟組織炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA相對表達水平上升,肝臟細胞間隙增大,肝索排列發(fā)生紊亂,出現(xiàn)炎性細胞浸潤,ATPR可以緩解以上LPS造成的小鼠肝臟損傷。肝臟具有強大的代謝和解毒等功能,線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變將導(dǎo)致肝臟損傷。FUNDC1是一種位于線粒體外膜的線粒體自噬受體,通過LIR基因序列招募LC3B,在哺乳動物細胞中啟動線粒體自噬。OPA1是一種定位于線粒體內(nèi)膜和膜間隙的GTP酶,在線粒體內(nèi)膜的融合和分裂中發(fā)揮重要作用,維持線粒體嵴結(jié)構(gòu)[8]。本研究中,LPS刺激后,小鼠肝臟組織FUNDC1蛋白表達增多,OPA1蛋白表達減少,肝細胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)嵴減少或消失和膜不完整的現(xiàn)象,ATPR預(yù)處理后小鼠肝細胞中線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)趨于正常。有研究[9]顯示泛素特異性蛋白水解酶19通過自噬調(diào)控NLRP3功能抑制炎癥和促進M2樣巨噬細胞極化,本實驗以C57BL/6小鼠為實驗對象,ATPR預(yù)處理后腹腔注射LPS,探究ATPR是否通過影響自噬水平發(fā)揮治療作用。

自噬對細胞生長、存活和穩(wěn)態(tài)是必不可少的,包括自噬的起始、隔離膜和自噬小體的形成、自噬溶酶體的形成、溶酶體降解內(nèi)容物4個階段。自噬可分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬,一般所說的自噬是指巨自噬,通過形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體包裹胞內(nèi)物質(zhì),包括線粒體自噬、脂自噬、過氧化物酶體自噬及核糖體自噬等[10]。自噬發(fā)生過程中可以檢測3個關(guān)鍵蛋白,分別是LC3B、P62和Beclin1。LC3B蛋白合成后,C末端水解掉一段多肽,產(chǎn)生胞質(zhì)分布的LC3BI;自噬過程中,LC3BI在一系列酶促作用下向LC3BII轉(zhuǎn)變,并結(jié)合在自噬小體膜上,LC3BII與LC3BI的比值大小可用來評估自噬水平的高低[11]。P62與泛素化蛋白結(jié)合,再與LC3BⅡ蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,并最終在溶酶體內(nèi)降解,在自噬過程中P62會不斷被消耗[12]。Beclin1與Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶結(jié)合后作為自噬的正向調(diào)節(jié)因子,在自噬的啟動階段發(fā)揮重要作用[13]。自噬的整個過程受到不同的自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,ATG)的調(diào)控, ATG5參與了自噬小體的擴張過程[14]。

有研究[15]發(fā)現(xiàn),LPS降低AMPK的磷酸化,增加mTOR的磷酸化,導(dǎo)致自噬被抑制,同時自噬抑制會導(dǎo)致去極化線粒體的積聚。本研究中,LPS組小鼠肝細胞中脂滴數(shù)量增多,受損線粒體堆積,肝組織LC3BⅡ和LC3BⅠ的比值減小,P62蛋白表達增多,Beclin1和ATG5蛋白表達減少,這表明LPS所致小鼠肝損傷與肝組織自噬水平密切相關(guān)。ATPR預(yù)處理后小鼠肝組織FUNDC1蛋白表達減少,OPA1蛋白表達增多,肝細胞內(nèi)線粒體形態(tài)和數(shù)量趨于正常,脂滴數(shù)量減少,且自噬小體數(shù)量增多,肝組織LC3BⅡ和LC3BⅠ的比值增大,P62蛋白表達減少,Beclin1和ATG5蛋白表達增多。以上結(jié)果表明ATPR可能是通過改善肝損傷小鼠的肝臟自噬水平起到保護肝臟的作用,但ATPR如何影響自噬水平的分子機制尚不清楚,還有待今后進一步研究。

綜上所述,ATPR對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護作用,其機制可能與促進細胞自噬有關(guān),這些結(jié)果表明ATPR作為藥物對治療LPS造成的肝臟損傷有一定的潛力。