徐燕燕,朱樂(lè)樂(lè),李苗苗,楊 雁

肝癌(hepatocellular carcinoma , HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有高發(fā)病率且難以治療的特點(diǎn),是世界上第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。近年來(lái),肝癌患者大多采用腫瘤切除、射頻消融術(shù)等外科手術(shù)治療,但由于這些治療手段費(fèi)用昂貴,風(fēng)險(xiǎn)高,化療毒性大,肝癌患者的預(yù)期壽命顯著縮短[2]。因此,迫切需要針對(duì)肝癌采取更多預(yù)防性、低費(fèi)用的治療策略。

秋水仙堿(Colchicine)是被稱為“草地藏紅花”植物中提取的有機(jī)生物堿[3]?，F(xiàn)有研究[4]表明,秋水仙堿對(duì)原發(fā)性肝癌有一定的抑制作用,但秋水仙堿對(duì)肝癌治療的作用機(jī)制尚不明確。據(jù)報(bào)道[5],Hippo信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子YAP和TAZ不僅與肝臟炎癥和肝纖維化有關(guān),而且還是肝癌腫瘤微環(huán)境中不可或缺的信號(hào)樞紐。然而秋水仙堿能否通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路影響肝癌的發(fā)生發(fā)展目前未見(jiàn)報(bào)道。因此,該實(shí)驗(yàn)旨在探討秋水仙堿對(duì)小鼠肝癌的治療作用,并進(jìn)一步研究其介導(dǎo)Hippo信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只6周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量20～22 g,購(gòu)自河南思科巴斯生物科技有限公司[證書(shū)編號(hào)：SYXK(安徽)2020-001]。小鼠飼養(yǎng)在具有獨(dú)立通風(fēng)的IVC籠盒中(SPF屏障系統(tǒng)),并喂以高壓消毒飼料和水。環(huán)境恒定溫度24 ℃,相對(duì)濕度50%,噪聲小于60分貝,12 h交替光/暗循環(huán)。小鼠在上述條件下飼養(yǎng)1周,以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)前的實(shí)驗(yàn)室條件。本課題中所涉及的實(shí)驗(yàn)小鼠的日常飼養(yǎng)及各類實(shí)驗(yàn)皆嚴(yán)格遵守國(guó)家和機(jī)構(gòu)關(guān)于在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中人道利用動(dòng)物的公約和指南(倫理批準(zhǔn)代碼：LLSC,20180015)。

1.1.2主要藥品與試劑 秋水仙堿 (純度≥98.0%,編號(hào)：PS0197-0025) 購(gòu)自成都Push生物技術(shù)公司;兔抗MST1 (#3682)、pYAP (Ser127) (#13008S)、YAP(#14074)、pTAZ(#59971)、TAZ(#72804) 抗體購(gòu)自美國(guó) Affinity Biosciences公司;四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)(編號(hào)：C805332;純度≥98.0%,相對(duì)分子質(zhì)量：153.82) 購(gòu)自江蘇欣諾科催化劑股份有限公司;二乙基亞硝胺 (diethylnitrosamine, DEN)(編號(hào)：73861;純度≥99.0%,分子量：102.14) 購(gòu)自焦作沃恩生物科技有限公司。乙醇(ethanol,C2H5OH)(編號(hào)：100092008;純度≥99.7%,相對(duì)分子質(zhì)量：46.07)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.3主要儀器 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自張家港市騰鷹機(jī)械制造有限公司;病理組織包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó) Leica 公司;冷凍研磨儀購(gòu)自上海凈信公司;PCR儀購(gòu)自廣州市華粵行儀器有限公司;YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州菲泰克環(huán)境技術(shù)有限公司;水平電泳儀購(gòu)自德諾杰億生物科技有限公司(北京);熒光顯微鏡購(gòu)自基恩士有限公司(上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 選30只體重相近的健康雄性小鼠,隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組,建立DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)小鼠肝癌模型及秋水仙堿干預(yù)。模型組和秋水仙堿組按照以下方式進(jìn)行造模：① 1 ～2周,腹腔注射1.0% DEN,每周1次;② 3～7周,灌胃20 % 溶于橄欖油的CCl4溶液(5 ml/kg),每周2次;③ 8～18周,灌胃20 % 溶于橄欖油的CCl4溶液(6 ml/kg),每周2次; ④ 第3周開(kāi)始,將含有10%的乙醇溶液作為飲用水,置于鼠籠,任小鼠自行飲用;⑤ 第19周開(kāi)始,停止所有化學(xué)試劑,常規(guī)飲食飲水至第20周末。同時(shí),秋水仙堿組按體重0.1 mg/kg每天給小鼠灌胃秋水仙堿。對(duì)照組給予相應(yīng)的溶媒,常規(guī)飲食飲水。20周末,用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后,摘除眼球取得血清,置于沾有1%肝素鈉溶液EP管中,用試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶水平。頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠肝臟,注意其完整性,用PBS溶液清洗黏附的血液,在明亮的環(huán)境下觀察小鼠肝臟的大體形態(tài)并拍攝照片。用濾紙擦干肝臟表面,取部分小鼠肝小葉在4%多聚甲醛中固定,進(jìn)行石蠟切片。其余部分凍存于-80 ℃,用于后期肝組織指標(biāo)測(cè)定、免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠肝臟指數(shù)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄,解剖取出小鼠肝臟稱重并記錄,根據(jù)公式計(jì)算,肝指數(shù)=肝重/體質(zhì)量×100%。

1.2.3小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)

1.2.3.1血清的分離處理 將采集的小鼠血液于冰上靜置2 h,提前將高速冷凍離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃,將裝有小鼠血液的EP管對(duì)齊放置于4 ℃冷凍離心機(jī)中3 500 r/min離心15 min,吸取上清液于新的EP管內(nèi),4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2血清生物標(biāo)志物測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)指示,檢測(cè)小鼠血清中AST和ALT水平,并通過(guò)酶標(biāo)儀獲得血清中各指標(biāo)的吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算各樣本中AST和ALT的具體值。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色法 取出多聚甲醛中固定的肝組織,進(jìn)行組織標(biāo)本固定并包埋在石蠟中,用切片機(jī)切成3～5 μm的切片。組織切片依次在不同濃度的二甲苯和無(wú)水乙醇中浸泡相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行脫蠟和水化,蘇木精中染色,流水中洗滌以顯出藍(lán)色,然后伊紅染色后置于蓋玻片下封片。光學(xué)顯微鏡下對(duì)腫瘤和肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.5免疫熒光 在封閉前用檸檬酸鹽修復(fù)液對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)。切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,然后與羅丹明綴合的山羊抗兔IgG在37 ℃下孵育50 min。用 PBS 洗滌后,滴加適量DAPI溶液于室溫孵育10 min。切片用PBS沖洗并用抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察和拍照,通過(guò)ImageJ軟件對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行量化。

1.2.6Western blot 從肝組織中提取總蛋白,用BCA試劑盒定量樣品中的蛋白濃度,將樣品變性并通過(guò)10%或15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后,一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,用 Tris-HCl 緩沖鹽溶液(TBST)洗脫 3 次,然后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。用TBST洗脫后,用增加型化學(xué)發(fā)光試劑覆蓋PVDF膜,并使用Gel Pro分析軟件檢測(cè)不同的目標(biāo)蛋白,對(duì)蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響肝活檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝臟邊緣清晰,顏色紅潤(rùn),有光澤,表面無(wú)斑點(diǎn)、結(jié)節(jié),而模型組小鼠肝臟表面粗糙,無(wú)光澤,邊緣有皺紋,切面有明顯的米黃色顆粒狀增生結(jié)節(jié),質(zhì)地較硬,相比于模型組,秋水仙堿組小鼠肝臟表面略為光滑且邊緣無(wú)褶皺,顆粒狀結(jié)節(jié)斑塊數(shù)量也減少,見(jiàn)圖1 A。HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,大小均勻,無(wú)明顯壞死或核碎裂區(qū),模型組肝臟損害,有可見(jiàn)斑點(diǎn)、碎片壞死,肝小葉廣泛堆積,可見(jiàn)明顯的膠原纖維,肝細(xì)胞排列紊亂,肝竇體積變大,肝細(xì)胞大小也發(fā)生改變。與模型組比較,秋水仙堿組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,膠原束數(shù)量明顯減少,肝細(xì)胞排列趨于規(guī)則,見(jiàn)圖1 B。如表1所示,模型組小鼠腫瘤發(fā)生率為100%,腫瘤結(jié)節(jié)直徑均大于1 mm,但秋水仙堿處理后小鼠腫瘤發(fā)生率降低(P<0.01),說(shuō)明秋水仙堿降低肝癌結(jié)節(jié)的發(fā)生率和多樣性。上述結(jié)果提示,秋水仙堿組小鼠肝組織病變程度減輕,表明秋水仙堿具有一定抗肝癌作用。

表1 秋水仙堿對(duì)誘導(dǎo)的小鼠肝組織腫瘤的影響(n=8)

圖1 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝組織病理學(xué)的影響

2.2 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠體質(zhì)量與肝臟指數(shù)的影響與對(duì)照組相比,模型組小鼠的肝重、體質(zhì)量都有所減少(P<0.05,P<0.01),體質(zhì)量尤甚;與模型組相比,秋水仙堿組小鼠的肝重、體質(zhì)量均增加 (F=7.637,P<0.05;F=190.3,P<0.01),見(jiàn)圖2 A、B。小鼠肝臟指數(shù)結(jié)果顯示,模型組的肝臟指數(shù)高于對(duì)照組(F=105,P<0.01),秋水仙堿組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2、圖2 C。提示DEN/CCl4/C2H5OH 造模對(duì)小鼠的肝臟造成一定的損傷,秋水仙堿對(duì)小鼠肝臟有保護(hù)作用。

表2 秋水仙堿對(duì)小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT和AST的影響

圖2 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝指數(shù)的影響

2.3 秋水仙堿改善DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝功能在肝功能檢查中,ALT和AST是反映肝細(xì)胞受損的指標(biāo)。與對(duì)照組相比,模型組小鼠的ALT和AST水平顯著升高(均P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿組小鼠給藥后ALT和AST水平有所降低(FALT=136.1,FAST=143.7,均P<0.01),見(jiàn)表2、圖3 。提示DEN/CCl4/C2H5OH導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生病變,肝功能受損,秋水仙堿能夠降低小鼠肝臟的病變程度,改善小鼠肝功能。

圖3 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠ALT(A)與AST(B)的影響

2.4 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝組織中Hippo通路相關(guān)蛋白MST1表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果分析顯示,對(duì)照組小鼠肝組織中MST1蛋白表達(dá)較少,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中MST1蛋白表達(dá)增多(P<0.01),與模型組相比,秋水仙堿治療組小鼠肝組織中MST1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(F=140.7,P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進(jìn)小鼠肝組織中MST1蛋白的表達(dá),見(jiàn)圖4。

圖4 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝組織中MST1蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光染色 ×40

2.5 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝組織中YAP、pYAP蛋白表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果分析顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中YAP蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),pYAP蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿組小鼠肝組織中YAP蛋白表達(dá)減少,pYAP蛋白表達(dá)增加(FYAP=81.44,FpYAP=85.34,均P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進(jìn)小鼠肝組織中pYAP蛋白的表達(dá),降低小鼠肝組織中YAP蛋白的表達(dá),見(jiàn)圖5。

圖5 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝組織中YAP(A)、pYAP(B)蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光染色 ×40

2.6 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝組織中TAZ、pTAZ蛋白表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果分析顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中TAZ蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),pTAZ蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿治療組小鼠肝組織中TAZ蛋白表達(dá)減少,pTAZ蛋白表達(dá)增加(FTAZ=99.10,FpTAZ=68.14,均P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進(jìn)小鼠肝組織中pTAZ蛋白的表達(dá),降低小鼠肝組織中TAZ蛋白的表達(dá),見(jiàn)圖6。

圖6 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝組織中TAZ(A)、pTAZ(B)蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光染色 ×40

2.7 秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的肝癌期小鼠肝組織中Hippo通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,模型組肝組織中MST1、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01),pYAP、pTAZ蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.01);與模型組比較,秋水仙堿組肝組織中MST1、pYAP、pTAZ蛋白表達(dá)水平升高(FMST1=93.44,P<0.01;FpYAP=35.83,P<0.05;FpTAZ=41.03,P<0.05),YAP、TAZ的蛋白表達(dá)水平降低(FYAP=21.30,P<0.01;FTAZ=14.15,P<0.05)。提示秋水仙堿在治療肝癌的過(guò)程中,升高M(jìn)ST1、pYAP、pTAZ蛋白表達(dá)水平,降低YAP、TAZ的蛋白表達(dá),見(jiàn)圖7。

圖7 秋水仙堿對(duì)肝癌小鼠肝組織中Hippo通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

在肝癌的實(shí)驗(yàn)研究中,化學(xué)藥物誘發(fā)肝癌動(dòng)物模型較常用,多以DEN化學(xué)藥物作為誘導(dǎo)劑,DEN對(duì)肝臟有特定毒性,使肝細(xì)胞大面積壞死,最終誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[6]。除了DEN外,CCl4也常作為肝癌誘導(dǎo)劑,CCl4是一種眾所周知的肝毒素,會(huì)導(dǎo)致化學(xué)性肝損傷,包括炎癥和纖維化。它在活性化合物或其代謝物的毒性中起著特殊的作用,一旦被激活,CCl4就會(huì)影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和后續(xù)類型的毒性。這種毒性通過(guò)改變血漿、線粒體和溶酶體膜的通透性直接損害肝細(xì)胞[7]。乙醇可以促進(jìn)CCl4的吸收,加劇中毒癥狀。本實(shí)驗(yàn)采用的是DEN/CCl4/C2H5OH聯(lián)合誘導(dǎo)法建立穩(wěn)定的小鼠肝癌模型,該法建立的小鼠肝癌模型具有癌變率高、與人類肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程類似、無(wú)肝轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)[8]。隨著造模的進(jìn)行,小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、食欲不振、萎靡的表現(xiàn),20周末,小鼠肝臟重量和體質(zhì)量均降低,肝臟大體可見(jiàn)顏色明顯暗淡且表面粗糙,出現(xiàn)米白色腫瘤病灶,HE可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以及大小不一的異型細(xì)胞核,病理上已具備肝癌的基本特征。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DEN/CCl4/C2H5OH 能夠成功誘導(dǎo)小鼠肝癌模型。

其他生物堿,如紫杉醇和長(zhǎng)春新堿,它們的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成難度大、生物利用度差且有毒副作用,尤其在臨床上存在多重耐藥性問(wèn)題,相比之下,秋水仙堿是一種中性親脂性生物堿,且結(jié)合位點(diǎn)空腔體積較小,其相應(yīng)抑制劑的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單[9],它通過(guò)阻斷微管蛋白的聚合,從而影響微管的功能,集中在白細(xì)胞,尤其是粒細(xì)胞中并干擾其功能,減輕炎性反應(yīng),被用于治療和預(yù)防自身炎癥性疾病的發(fā)作[10]。同時(shí),它也具有抗腫瘤作用,對(duì)乳腺癌療效顯著,對(duì)肺癌、胃癌、宮頸癌可能也有一定療效,它的抗癌作用的主要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用,而不是通過(guò)抑制血管生成。研究[4]報(bào)道,秋水仙堿濃度為0.01 mg/ml時(shí)對(duì)肝癌有抑制作用。因此,本次實(shí)驗(yàn)使用0.01 mg/ml 的秋水仙堿來(lái)治療DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)的小鼠肝癌期,與模型組相比,秋水仙堿治療后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到明顯改善,小鼠腫瘤的發(fā)生率和多樣性降低,小鼠的體質(zhì)量、肝臟重量有所增加,肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞異型性均輕于模型組。表明秋水仙堿對(duì)DEN/CCl4/C2H5OH誘導(dǎo)小鼠肝癌有治療作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明,秋水仙堿發(fā)揮抗肝癌作用可能與Hippo 信號(hào)通路有關(guān)。Hippo 信號(hào)通路啟動(dòng)后,MST1被磷酸化作用而激活LATS1/2,LATS1/2激活后可磷酸化并抑制YAP/TAZ的活性[11]。其過(guò)程是磷酸化的YAP/TAZ與支架蛋白14-3-3結(jié)合,在細(xì)胞質(zhì)積聚,隨后被β-TrCP E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體降解,最終導(dǎo)致YAP 和TAZ促生長(zhǎng)和抗凋亡的功能喪失[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照組小鼠MST1、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)均較少,pYAP和pTAZ 的蛋白表達(dá)較多。相比于對(duì)照組,模型組小鼠 MST1、YAP、TAZ的蛋白表達(dá)明顯增多,pYAP和pTAZ 的蛋白表達(dá)明顯減少;秋水仙堿干預(yù)后,MST1、pYAP和pTAZ 的蛋白表達(dá)顯著增加,YAP、TAZ的蛋白表達(dá)明顯抑制。因此,秋水仙堿可能上調(diào)MST1激酶活性,增強(qiáng)YAP和TAZ磷酸化的分子機(jī)制,減少YAP和TAZ進(jìn)入核轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述,DEN/CCl4/C2H5OH 誘導(dǎo)的小鼠肝癌中,秋水仙堿可能通過(guò)增強(qiáng)Hippo信號(hào)通路的上游抑癌因子MST1的表達(dá)而抑制下游基因YAP/TAZ的表達(dá),從而發(fā)揮其抗肝癌的治療作用。