陳露穎,蔣勵萍,王偉康,左書俊,蒯佳婕,馬 旸,韓陳陳,魏 偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis, RA)是一種慢性、侵蝕性疾病,具有高致殘致畸的特點(diǎn),病理特征為滑膜炎、關(guān)節(jié)破壞及血管翳的形成[1],其中成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocyte, FLS)的異?；罨赗A的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]?；罨腇LS過度增殖會產(chǎn)生多種炎癥因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶,如腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6等,造成關(guān)節(jié)的慢性炎癥和持續(xù)性破壞[3]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumour necrosis factor receptor-associated factor2, TRAF2)是TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要銜接蛋白,在TNF-α誘導(dǎo)的TNFR1和TNFR2信號活化中起著至關(guān)重要的作用,參與調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)蛋白,包括JNK、核因子(nuclear factor, NF)-κB和p38[4]。其中,NF-κB信號的異常激活可引起持續(xù)的炎癥,導(dǎo)致IL-6等多種炎性因子水平升高,誘發(fā)RA的發(fā)生,并在FLS的異常增殖中發(fā)揮了重要作用[5]。該實(shí)驗(yàn)研究TRAF2低表達(dá)后TNF-α誘導(dǎo)RA患者滑膜細(xì)胞株(MH7A)增殖功能及下游信號的改變,旨在進(jìn)一步研究TRAF2蛋白在TNF-α誘導(dǎo)的MH7A增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞、菌株、載體 RA患者滑膜細(xì)胞株MH7A購自北京金恒盛世科技有限公司;人胚腎HEK 293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;病毒質(zhì)粒、TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購自通用生物(滁州)公司。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM 培養(yǎng)基及 PBS 購自以色列 BI 公司;SolutionⅠ連接酶、dNTP、6×Loading Buffer、DNA Marker DL10000均購自日本TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;嘌呤霉素購自優(yōu)寧維生物科技有限公司;切膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提取試劑盒購自TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司;兔源TRAF2購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司; p-P65和P65購自美國Cell Signaling Technology; Jet PRIME transfection reagent 轉(zhuǎn)染試劑購自法國PolyPlus公司; PVDF膜購自美國Millipore公司;逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自莫納生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 T100 Thermal Cycler PCR 基因擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司); Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);Image Quant LAS 4000 熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國 GE 公司);Tanon EPS-300 瓊脂糖凝膠電泳儀(蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司);SIGMA1-16K小型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國西格瑪公司);ZWY-2102C智誠恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司);核酸電泳儀和 DYY-6C 型電泳系統(tǒng)(北京六一公司)。

1.2 PLKO.1-TRAF2-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1設(shè)計TRAF2-shRNA的PCR引物 通過https：//www.ncbi 查找人TRAF2的基因序列(NM_021138.4),設(shè)計特異性靶向TRAF2基因的3對shRNA序列,引物的合成由北京擎科生物有限公司完成。見表1。

表1 3對TRAF2-shRNA引物序列

1.2.2TRAF2-shRNA引物退火 將合成的TRAF2-shRNA引物稀釋成終濃度為10 mmol/l的儲藏液。將以上3對TRAF2-shRNA引物在PCR儀上進(jìn)行退火形成雙鏈DNA,TRAF2-shRNA的正向、反向引物各5 μl,梯度降溫,循環(huán)30次。4 ℃保存短暫保存退火產(chǎn)物。

1.2.3準(zhǔn)備線性化載體 使用限制性核酸內(nèi)切酶AgeI、EcoRI及其配套試劑配制 50.0 μl酶切反應(yīng)體系[ddH2O 31.0 μl,10 × Cut Smart Buffer 5.0 μl,純化的質(zhì)粒 DNA (PLKO.1-puro,劑量為0.5 μg/μl)10.0 μl,AgeⅠ和EcoRⅠ各2.0 μl],依序加入試劑后輕輕吹打混勻,室溫下以相對離心力280 r/min短暫離心15 s,37 ℃水浴2 h,對載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收酶切產(chǎn)物,回收線性載體并檢測濃度。

1.2.4退火產(chǎn)物與酶切載體連接 將以上得到的退火產(chǎn)物及雙酶切線性化的載體通過Solution Ⅰ 連接酶進(jìn)行連接,50 ℃下連接 15 min,得到連接產(chǎn)物。

1.2.5重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化擴(kuò)增及測序 將10.0 μl連接產(chǎn)物加入到 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中,輕彈管壁數(shù)下混勻,冰上放置30 min。42 ℃熱激 90 s,冰水浴孵育 2 min。加入無抗性的溶菌肉湯(Luria-Bertani, LB)培養(yǎng)基 500.0 μl,置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布在含有氨芐抗性的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12～16 h, 挑取平板上的單個菌落于3 ml的含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中,搖菌12～16 h,利用質(zhì)粒小抽提取試劑盒提取質(zhì)粒,將提取出的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測序。

1.3 慢病毒包裝感染MH7A構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株

1.3.1慢病毒包裝體系 人HEK 293T細(xì)胞以每孔1×106細(xì)胞接種于6孔板中,10% DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2箱中孵育24 h,至細(xì)胞達(dá)到對數(shù)增長期更換新鮮培養(yǎng)基,進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將PLKO.1-TRAF2-shRNA質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK 293T細(xì)胞中：① 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：取無菌 1.5 ml EP 管,加入 200 μl的jet PRIME buffer,再加入2 μg DNA混合物,快速渦旋10 s,混勻后,加入4 μl的jet PRIME reagent 轉(zhuǎn)染試劑,快速渦旋10 s,混勻后室溫靜置10 min。② 轉(zhuǎn)染： 將6孔板中培養(yǎng)基棄去,加入 2 ml 10% DMEM,將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中,置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)基變黃,收集上清溶液至無菌離心管中,4 000 r/min離心5 min。使用0.45 μm過濾器過濾,分裝到無菌離心管中于-80 ℃保存。

1.3.2嘌呤霉素篩選最佳濃度的確定 提前1 d接種0.5×105個細(xì)胞/孔至24孔板中,加入0.5 ml含血清培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至MH7A細(xì)胞生長密度達(dá)到40%～50%,加入嘌呤霉素濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基,每隔1 d換新鮮含嘌呤霉素的溶液(濃度不變)。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d,顯微鏡下觀察細(xì)胞的死亡情況。細(xì)胞處理0、24、48、72 h后細(xì)胞死亡情況,使MH7A細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素濃度即為篩選濃度。

1.3.3病毒液感染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的篩選 按照每孔1×106的細(xì)胞密度鋪板6孔板,觀察細(xì)胞長勢;當(dāng)密度在50%～70%,將PLKO.1空載體及PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒病毒液感染MH7A細(xì)胞,加入最適篩選濃度的嘌呤霉素,維持嘌呤霉素濃度,每日觀察細(xì)胞狀態(tài),約2～3 d后篩選出TRAF2敲低的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株,更換新鮮篩選培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)TRAF2敲低的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.4 qRT-PCR檢測使用TRIzol收取細(xì)胞RNA裂解液,按照說明書提取RNA,測定RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測,TRAF2正向引物：5′-CTGCGGCAAGAAGA AGATCC-3′,反向引物： 5′-AATCTGCAAGGGACTCG ACA-3′;內(nèi)參基因 GAPDH 正向引物：5′- ACCCA GAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物：5′-TCAGCT CAGGGATGACCTTG-3′,使用2-ΔΔCt算法處理原始CT數(shù)值。

1.5 Western blot在6孔板中每孔接入1×106個MH7A和TRAF2低表達(dá)的MH7A細(xì)胞,小心棄去上清培養(yǎng)基,使用冷PBS清洗2次,將細(xì)胞使用已加蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA刮下收集在1.5 ml EP管中,冰上裂解30 min,4 ℃離心取上清液使用BCA濃度定量試劑盒進(jìn)行定量,加入5 × SDS loading buffer,95 ℃、10 min進(jìn)行蛋白變性,隨后使用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳,5%脫脂牛奶封閉2 h,1 ∶1 000 比例稀釋一抗抗體4 ℃孵育過夜,次日TPBS洗滌3次后,1 ∶50 000比例稀釋二抗抗體,室溫孵育2 h,TPBS洗滌3次,ECL化學(xué)發(fā)光顯影,以GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖在96孔培養(yǎng)板中分別加入1×104個MH7A和TRAF2低表達(dá)的MH7A細(xì)胞懸液100 μl,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。提前4 h分別將培養(yǎng)基更換為90 μl DMEM完全培養(yǎng)基和10 μl CCK-8混合液,繼續(xù)孵育30 min,用酶標(biāo)儀分別檢測450 nm處的光密度(optical density, OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PLKO.1-TRAF2-shRNA敲低質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定查找人源TRAF2基因,通過shRNA設(shè)計網(wǎng)址設(shè)計TRAF2-shRNA引物對,合成TRAF2-shRNA(1)、TRAF2-shRNA(2)和TRAF2-shRNA (3)引物對,通過PCR進(jìn)行引物對退火,同時雙酶切PLKO.1-puro載體,將獲得的線性PLKO.1-puro片段進(jìn)行1% 瓊脂糖電泳,回收酶切產(chǎn)物。通過連接酶連接TRAF2-shRNA引物對和線性PLKO.1-puro片段,將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,挑選陽性克隆質(zhì)粒PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)(圖1A)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)(圖1B)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)(圖1C),進(jìn)行DNA測序和比對分析,測序結(jié)果與目的基因序列完全一致,成功構(gòu)建3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒。

圖1 3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒的部分測序結(jié)果

2.2 MH7A細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素濃度篩選MH7A分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)24、48、72 h。結(jié)果表明,培養(yǎng)48 h后,嘌呤霉素濃度為2.0、2.5 μg/ml作用所有的細(xì)胞均全部死亡,故確定嘌呤霉素作用時間為48 h, 篩選濃度為2.0 μg/ml(圖2)。

圖2 不同濃度嘌呤霉素培養(yǎng)不同時間對MH7A細(xì)胞的影響 ×10

2.3 PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2 mRNA的影響3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒分別和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK 293T細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,收集病毒液,通過病毒液感染MH7A,加入2 μg/ml嘌呤霉素,篩選TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株,通過3次獨(dú)立qPCR實(shí)驗(yàn)檢測MH7A中TRAF2的表達(dá)情況,結(jié)果表明,與PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株相比,只有PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) 可以顯著下調(diào)MH7A的TRAF2 mRNA水平(t=5.015,P<0.01),提示TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功(圖3)。

圖3 qPCR檢測MH7A細(xì)胞中TRAF2 mRNA的表達(dá)情況

2.4 PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2蛋白表達(dá)的影響進(jìn)一步通過Western blot檢測PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2蛋白的抑制效果。結(jié)果顯示,與PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株相比,只有PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) 可以顯著下調(diào)MH7A的TRAF2蛋白水平(t=8.847,P<0.01),進(jìn)一步證明了TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功(圖4)。

圖4 Western blot 檢測MH7A細(xì)胞中TRAF2蛋白的表達(dá)

2.5 TRAF2低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖的影響分別將PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株和PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株接入96孔板中,分別給予TNF-α(20 ng/ml)作用,48 h后,采用CCK-8法檢測MH7A細(xì)胞增殖能力。結(jié)果表明,在陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,給予TNF-α作用可以促進(jìn)其異常增殖(t=20.00,P<0.01);在TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株中, 給予TNF-α作用未促進(jìn)TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株增殖(t=1.731,P>0.05),提示低表達(dá)TRAF2可以減弱TNF-α誘導(dǎo)的MH7A增殖能力(圖5)。

圖5 CCK-8法檢測TRAF2敲低對MH7A細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 TRAF2低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中P65磷酸化的影響分別將PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株和PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株接入6孔板中,分別給予TNF-α(20 ng/ml)作用,作用48 h后,通過Western blot檢測TRAF2下游信號P65和p-P65的表達(dá)。結(jié)果表明,在陰性對照MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,給予TNF-α 作用可以顯著促進(jìn)其p-P65的表達(dá)(t=29.20,P<0.01);在TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,給予TNF-α作用未顯著促進(jìn)TRAF2低表達(dá)的MH7A穩(wěn)轉(zhuǎn)株中p-P65的表達(dá);提示低表達(dá)TRAF2可以降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A中P65磷酸化水平(圖6)。

圖6 Western blot 檢測TRAF2敲低對MH7A細(xì)胞中P65磷酸化水平的影響

3 討論

TNF-α作為一種重要的炎性因子,在RA患者血清及關(guān)節(jié)滑膜中水平升高,研究[6]表明抑制TNF-α的作用能顯著改善RA患者的臨床癥狀,提高生活質(zhì)量。TRAF2作為TNF-α信號下游的一種重要銜接蛋白,TNF-α刺激條件下,TRAF2與TAK1發(fā)生泛素化,促進(jìn)NF-κB活化,促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖以及促炎因子的釋放。TRAF2可以激活I(lǐng)KK,IKK使IκB磷酸化,釋放NF-κB二聚體,并遷移到細(xì)胞核。這些二聚體結(jié)合特定的DNA序列并激活各種NF-κB的靶基因,促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP的轉(zhuǎn)錄和分泌。在RA的滑膜細(xì)胞異常增殖中起著重要作用[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建TRAF2低表達(dá)的滑膜細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,為探索TRAF2調(diào)控RA滑膜細(xì)胞異常增殖的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)方法[9]。常用病毒載體包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。腺病毒一般不能整合到染色體上,適用于瞬時感染;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞,而且容量有限;而慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。較腺病毒而言,慢病毒載體可以長期表達(dá)且能產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度慢病毒;較轉(zhuǎn)錄病毒載體而言,慢病毒載體具有更廣的宿主范圍,可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能持續(xù)數(shù)月,且不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答,可作為一種體外基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ遊6, 10-11]。慢病毒包裝系統(tǒng)由慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝載體組成。

本研究通過雙酶切慢病毒表達(dá)載體PLKO.1-puro,設(shè)計TRAF2-shRNA引物,成功構(gòu)建了PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒。將慢病毒包裝載體與PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,獲得病毒液后感染MH7A,經(jīng)過嘌呤霉素篩選、qPCR和Western blot驗(yàn)證,成功構(gòu)建了TRAF2敲低的MH7A細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。將篩選的TRAF2敲低的MH7A細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行功能驗(yàn)證,CCK-8檢測細(xì)胞增殖,結(jié)果表明TRAF2敲低后抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A異常增殖能力,Western blot結(jié)果表明TRAF2敲低后會明顯下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A中p-P65的表達(dá),因?yàn)門RAF2是NF-κB下游的關(guān)鍵蛋白,敲低TRAF2抑制下游p-p65的磷酸化水平。為后續(xù)進(jìn)一步研究TNF-α-TRAF2信號介導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞異常增殖的機(jī)制提供初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。