吳 閔,安禎祥,2,何遠(yuǎn)利,3,何 松,2,劉 闖,2,孫 凱,2

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是臨床慢性肝病常見的病因,在沒有過量飲酒或其他慢性肝病的情況下,有5%以上肝細(xì)胞中有脂肪變性的存在,與代謝風(fēng)險相關(guān)[1],并且是肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因。NAFLD給患者帶來了沉重的負(fù)擔(dān),損害了與健康相關(guān)的生活質(zhì)量和工作效率。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但腸道微生物組與NAFLD發(fā)病有著重要關(guān)系。當(dāng)下還沒有明確NAFLD的治療方法,有研究[2]表明,腸道組織可以通過腸-肝軸途徑來參與NAFLD疾病的發(fā)生發(fā)展,通過調(diào)控腸道微生物改善NAFLD患者肝臟表型。盡管腸道微生物群與NAFLD密切相關(guān),但是其因果關(guān)系難以捉摸。孟德爾隨機(jī)化(Mendelian randomization,MR)是一種統(tǒng)計分析方法,主要采用遺傳變異為工具變量,觀察關(guān)聯(lián)結(jié)果推斷潛在的因果關(guān)系[3]。該研究采用孟德爾隨機(jī)化的思想,探討腸道微生物不同菌群之間與NAFLD風(fēng)險的潛在因果關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計采用兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析腸道微生物與NAFLD之間的因果關(guān)系。以腸道微生物為暴露因素,包含211種腸道細(xì)菌性狀,結(jié)局變量為NAFLD。

1.2 數(shù)據(jù)來源使用的腸道微生物數(shù)據(jù)來自于一項多個國家的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS),該研究納入了24個隊列,18 340 例受試者,分別來自美國、加拿大、以色列、荷蘭、比利時、瑞典、韓國、德國、丹麥、芬蘭和英國,對他們進(jìn)行基因測序譜和基因分型數(shù)據(jù),通過調(diào)整年齡、性別、技術(shù)及遺傳主成分等探索腸道微生物與人類染色體遺傳變異之間的關(guān)系,課題組在5個水平(門、綱、目、科和屬)評估了211個腸道微生物群分類群。該研究基于16S rRNA基因的3個不同可變區(qū)(V4、V3-V4和V1-V2)分析了腸道微生物群的組成,并使用微生物群數(shù)量性狀基因座(microbiome quantitative trait loci,mbQTL)作圖來鑒定影響微生物分類群相對豐度的遺傳變體[4]。NAFLD基因結(jié)果關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)來自FinnGen數(shù)據(jù)庫,包括894例NAFLD病例,217 898例對照。使用數(shù)據(jù)集來源詳見表1。

表1 全基因組關(guān)聯(lián)研究的細(xì)節(jié)與分析中使用的數(shù)據(jù)集

1.3 兩樣本孟德爾隨機(jī)化的假設(shè)為了保證暴露因素與結(jié)局指標(biāo)之間因果關(guān)系的真實(shí)性和準(zhǔn)確性,MR必須符合3個重要假設(shè)： ① 工具變量(single nucleotide polymorphism,SNP)與暴露因素腸道菌群強(qiáng)相關(guān)聯(lián)。② 工具變量SNP與結(jié)局變量NAFLD之間和其他混雜因素沒有關(guān)聯(lián),即排除如肥胖、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、自身免疫性疾病等混雜因素。③ 工具變量SNP僅通過影響暴露因素腸道微生物對結(jié)局變量NAFLD產(chǎn)生影響,不能通過其他途徑對NAFLD造成影響。F統(tǒng)計量一般用于評估工具變量與暴露之間的相關(guān)性強(qiáng)度。F統(tǒng)計量的計算公式為：

F應(yīng)>10,如果F<10,則說明工具變量與暴露之間的關(guān)聯(lián)較弱。

1.4 工具變量選擇與腸道微生物組明顯相關(guān)的SNPs作為工具變量,參照千個全基因組項目的全基因組信息,將全基因組統(tǒng)計顯著性閾值參數(shù)設(shè)置為P<5×10-8。將連鎖不平衡參數(shù)設(shè)置為r2<0.001,聚集距離=10 000 kb,從腸道微生物數(shù)據(jù)中挑選出無連鎖效應(yīng)的SNP,再從已選出的SNP中剔除與NAFLD有意義的SNP(P<0.05),系統(tǒng)收集SNPs的主要信息,包括效應(yīng)等位基因、其他等位基因、β、SE和P值,用于進(jìn)一步分析[5]。

1.5 孟德爾隨機(jī)化分析孟德爾隨機(jī)化方法是一種基于遺傳變異的隨機(jī)化方法,用于評估因果關(guān)系。它利用自然界中存在的基因變異,將個體分為不同的基因型,從而模擬隨機(jī)化試驗的效果,以評估某個因素對某種疾病的影響是否具有因果性。這種方法可以避免傳統(tǒng)流行病學(xué)研究中的混雜因素和反向因果關(guān)系,從而提高因果推斷的可信度。常使用包括逆方差加權(quán)(inverse-variance weighted,IVW)、MR-Egger、加權(quán)中位數(shù)法(weighted median, WM)、Simple Mode法、Weighted Mode法在內(nèi)的高效統(tǒng)計方法來推斷人類腸道微生物組對NAFLD風(fēng)險是否存在因果效應(yīng)。使用IVW方法作為主要分析,因為它提供了最精確的效應(yīng)估計,幾乎所有MR分析都將其作為主要分析。采用MR-Egger回歸檢驗潛在的水平多效性,如果截距的P<0.05,則可能存在SNP的水平多效性。MR-PRESSO檢測多效性偏差的異常值并糾正水平多效性。此外,Cochran的Q統(tǒng)計量用于量化所選SNP之間的異質(zhì)性。為確定是否存在潛在的強(qiáng)影響SNP,采用留一敏感度分析法驗證因果效應(yīng)估計的可靠性和穩(wěn)定性。使用R軟件(版本4.0.2,TwoSampleMR、MR-PRESSO包)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果IVW分析結(jié)果表明,丙型變形菌綱(OR=0.621,95%CI=0.412～0.934,P=0.022)、普氏菌屬7(OR=0.834,95%CI=0.714～0.974,P=0.021)、脫硫弧菌目(OR=0.714,95%CI=0.519～0.982,P=0.038)3種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD風(fēng)險負(fù)相關(guān)。腸桿菌科(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)、毛螺菌科(OR=1.405,95%CI=1.036～1.904,P=0.029)、普氏菌屬9(OR=1.251,95%CI=1.025～1.527,P=0.027)、腸桿菌目(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)4種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD風(fēng)險正相關(guān)。并且篩選出來SNP的F均>10,說明工具變量與暴露之間存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)?？紤]到NAFLD易受生活方式、飲酒的影響,本實(shí)驗使用PhenoScanner查詢了陽性結(jié)果的SNP,并排除了與上述混雜因素相關(guān)的SNP。詳見表2。IVW結(jié)果森林圖見圖1。

圖1 IVW結(jié)果森林圖

表2 孟德爾隨機(jī)化分析主要結(jié)果

2.2 敏感性分析Cochran Q檢驗結(jié)果顯示7種腸道細(xì)菌性狀Cochran Q檢驗P均>0.05,提示SNP間不存在異質(zhì)性;多效性分析MR-Egger結(jié)果顯示7種腸道細(xì)菌性狀的P值均>0.05,因此,以上腸道細(xì)菌性狀不存在多效性水平的情況。本研究的敏感性分析采用Leave-one-out檢驗并繪制圖,留一圖表明在去除其中任何一個SNP,剩下的SNPs均在無效線的同一側(cè),去掉任何一個SNP后對結(jié)果產(chǎn)生的影響均較小,則提示該MR研究結(jié)果比較穩(wěn)健。散點(diǎn)圖則提示7種腸道菌群不同的統(tǒng)計方法的趨勢基本一致,說明其偏差較小。漏斗圖顯示IVW左右兩邊的點(diǎn)大致對稱,說明發(fā)病偏移較小。敏感性分析見表3,留一圖見圖2,散點(diǎn)圖見圖3,漏斗圖見圖4。

圖2 兩樣本MR結(jié)果留一圖

圖3 兩樣本MR結(jié)果散點(diǎn)圖

圖4 兩樣本MR結(jié)果漏斗圖

表3 敏感性分析

3 討論

本研究采用兩樣本孟德爾隨機(jī)化方法對211種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD的GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行因果關(guān)聯(lián)分析,共確定了7種細(xì)菌性狀與NAFLD存在因果關(guān)系,其中丙型變形菌綱、普氏菌屬7、脫硫弧菌目3種細(xì)菌性狀與NAFLD的風(fēng)險成負(fù)相關(guān),腸桿菌科、毛螺菌科、普氏菌屬9、腸桿菌目4種腸道細(xì)菌性狀是NAFLD發(fā)病的風(fēng)險因素。

人類身體的胃腸道黏膜表面被數(shù)以萬計的腸道微生物所定植,這些腸道微生物組參與宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和維持。因腸道微生物群的差異,涉及了免疫、能量、脂質(zhì)和葡萄糖代謝等多種途徑,并參與了全身多種疾病的發(fā)生。近年來腸道微生物組在NAFLD中得到了廣泛的研究,有證據(jù)[6]表明,腸道微生物組-肝臟軸在NAFLD中發(fā)生作用,尤其是在纖維化和進(jìn)展到晚期的疾病階段,并且該研究證明腸道微生物組中腸桿菌科的改變會影響NAFLD疾病的發(fā)展。

丙型變形菌綱是腸道微生物主要類之一,丙型變形菌綱與NAFLD等疾病有關(guān)[7],并且在NAFLD中丙型變形菌綱豐度增加。普氏菌屬是常見且豐富的專性厭氧菌,該屬的成員屬于胃腸道和呼吸道的微生物群落,并與糖尿病、心血管疾病和NAFLD等疾病高度相關(guān),其共同特征是低度全身炎癥[8]。在非糖尿病隊列中[9],普氏菌屬豐度增加可能與胰島素抵抗有關(guān)。有研究[7]指出,患有NAFLD的兒童攜帶的普氏菌屬豐度較健康兒童高。并且使用富含普氏菌屬的生態(tài)失調(diào)微生物群從具有缺陷的炎癥小體途徑的小鼠轉(zhuǎn)移到野生型小鼠中,研究富含普氏菌屬的生態(tài)失調(diào)在NAFLD和肥胖中的作用,且該菌還加劇了蛋氨酸膽堿缺乏型飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎,使肝臟脂肪變性和炎癥增加以及肝功異常[10]。而另一項研究[11]則提示普氏菌屬豐度水平的降低可能對患有NAFLD的成年人有害,但毛螺菌科水平升高可能是NAFLD疾病進(jìn)展的主要因素。腸道微生物中腸桿菌科是變形桿菌門的重要成員,該菌群包括許多已知在哺乳動物的大腸和小腸中定植,并且在NAFLD及結(jié)直腸癌中該細(xì)菌水平升高[12]。脫硫弧菌目菌多與神經(jīng)類疾病[13]、消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[14]。而在NAFLD疾病中脫硫弧菌目菌與瘦的NAFLD患者成負(fù)相關(guān),與肥胖NAFLD患者呈正相關(guān),兩者表現(xiàn)出相反的趨勢,但與總NAFLD呈負(fù)相關(guān)[15]。這說明腸道微生物群與疾病的發(fā)生密切相關(guān),尤其是腸內(nèi)外疾病,但其對腸內(nèi)外疾病產(chǎn)生有益或有害作用的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

雖然本研究分析了腸道微生物群,但腸道微生物群太大且異質(zhì),因此數(shù)據(jù)有限;其次,本研究雖然單獨(dú)分析了腸道微生物群與NAFLD之間的遺傳因果關(guān)系,但未進(jìn)一步探索腸道微生物與NAFLD之間的生物學(xué)關(guān)系。