靳傳洋 王真真 孫樂樂 劉亭亭 劉 紅 張福仁

1山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院,山東濟南,250022;2 山東省皮膚病性病防治研究所,山東濟南,250022

壞疽性膿皮病(pyoderma gangrenosum, PG)是一種以皮膚炎癥和潰瘍?yōu)橹饕憩F(xiàn)的非感染性、自身炎性、嗜中性皮膚病。PG表現(xiàn)為快速發(fā)展的疼痛性皮膚潰瘍,常常發(fā)生在下肢和軀干[1]。其發(fā)病率在美國成年人中為58/107,在英國人口中約為6/107[2]。其病因尚不明確,目前觀點認為,該病是在遺傳傾向的背景下,先天和適應性免疫系統(tǒng)失調造成的[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了10個與PG發(fā)病相關的基因:NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2和NFκB1[4-8]。這些基因突變后主要是通過影響NF-κB通路來影響多種細胞因子的過度表達(如IL-1α,IL-1β,IL-36,G-CSF等),進而影響中性粒細胞的聚集,延長中性粒細胞壽命,從而導致PG的發(fā)病[2]。

既往對PG易感基因的報道多集中在病例報道和小樣本的研究中(最大樣本量為14例PG患者和20例對照)[6],且研究的種群多集中在歐美人種,僅有1例對中國漢族群體的病例報道[9]。因此,我們匯總了一組可能與PG發(fā)病相關的基因,囊括了既往報道的10個基因(NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2和NFκB1);同時,在對既往報道的PG相關基因PTPN6所在炎癥通路的研究中發(fā)現(xiàn),MAP3K7,MyD88,SYK,RIRPK1在促進IL-1α、TNF、G-CSF等細胞因子分泌起關鍵作用[10]。此外,PG患者中存在髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)功能缺陷的報告[11]提示:髓過氧化物酶編碼基因MPO有害性突變可能是PG患者中髓過氧化物酶功能缺陷的原因。因此,我們也納入了PTPN6所在炎性通路中的4個相關基因(MAP3K7,MyD88,SYK,RIRPK1)和髓過氧化物酶編碼基因MPO,共計15個基因,對36例中國漢族PG患者的此組基因進行目標基因二代測序(next generation sequencing,NGS),旨在探索該病的遺傳學背景與種族差異性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015-2022年來我院就診的36例壞疽性膿皮病散發(fā)患者,年齡10～89歲,男22例,女14例,平均年齡56.06歲,平均發(fā)病年齡54.69歲。經過我院皮膚病醫(yī)師臨床診斷及組織病理學診斷確診為壞疽性膿皮病。448例對照采用全外顯子測序,測序結果儲存于山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院數據庫,對照組男356例,女92例,平均年齡69.67歲。該研究通過山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 從-80℃超低溫冰箱取出外周血,使用TIANamp Blood DNA Kit DP318-02(天根血液基因組DNA提取試劑盒),TGudieM16 全自動核酸提取儀提取外周血基因組DNA。

1.2.2 目標區(qū)域測序及注釋 使用Access Array公司微控流技術對36例壞疽性膿皮病患者的15個基因進行目標區(qū)域測序。15個基因包括既往文獻中報道的10個突變基因NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2,NFκB1以及可能與PG發(fā)病相關的基因共5個:SYK,MYD88,RIPK1,MAP3K7,MPO。測序結果基于hg19參考基因組,用ANNOVA軟件對所有36例PG患者與448例全外顯子測序數據中的此15個基因中存在的變異位點進行注釋。除去千人基因計劃數據庫2015版與ExAC數據庫中等位基因頻率大于0.005的數據后,滿足以下任意一條即認為該突變?yōu)橛泻ν蛔?(1)stop gain, stoploss, frameshift, splicing;(2)滿足 SIFT_score<0.05, Polyphen2_HDIV_score >=0.957, CADD_pred>15 并且排除ACMG 2015標準中“Benign”和“Likely benign”的突變位點。注釋后再進行顯性遺傳模式和隱性遺傳模式的基因負荷檢驗。

1.2.3 Sanger測序 我們對值得討論的致病性突變位點進行了Sanger測序驗證。使用NCBI網站的Primer-BLAST引物設計工具進行引物設計,分別獲取外顯子的跨側翼的上下游引物序列,由華大基因公司合成。PCR反應在美國ABI公司9700 型PCR擴增儀上完成,使用醋酸鈉乙醇沉淀法純化PCR產物。最后在美國ABI公司3500XL遺傳分析儀直接測序。

2 結果

2.1 NGS測序結果 按照我們的有害性篩選標準,在其中4例患者中的5個基因中,發(fā)現(xiàn)了6個有害性突變位點。包括一個移碼突變: NLRP12:c.908delT(p.F303fs)和 5個錯義突變:MAP3K7: c.815C>G(p.S272C), MPO: c.1484C>T(p.T495I), MPO: c.1705C>T(p.R569W), NOD2: c.2975G>A(p.R992Q), SYK: c.389A>G(p.E130G) (MAP3K7, MPO, NOD2, SYK 和NLRP12 的氨基酸序列分別基于NM_003188, NM_000250, NM_001293557, NM_001135052 和NM_001277126轉錄本)。經過顯性遺傳模式和隱性遺傳模式的基因負荷檢驗,我們未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學差異的突變基因(表1)。然而我們發(fā)現(xiàn)了兩個值得討論的突變。MAP3K7的雜合突變和MPO的純合(復合雜合)突變,此兩種突變僅存在于病例組,提示:MAP3K7與MPO可能是PG發(fā)病的關聯(lián)基因。

表1 基因負荷檢驗結果

2.2 Sanger測序結果 我們對3個值得討論的致病性突變位點進行了Sanger測序驗證,排除了假陽性。測序結果如圖1。

1a:MPO錯義突變: c.C1484T in exon 9;1b:MPO錯義突變: c.C1705T in exon 10;1c:MAP3K7錯義突變:c.C815G in exon 8;1d:MPO正常對照:c.1484C in exon 9;1e:MPO正常對照: c.1705C in exon 10;1f:MAP3K7正常對照:c.815C in exon 8圖1 Sanger測序結果

3 討論

在我們的病例樣本中,共在MAP3K7,SYK,NOD2,MPO,NLRP12基因中發(fā)現(xiàn)了致病性突變位點,其中MAP3K7的雜合突變和MPO純合(復合雜合)突變引起了我們的關注,這兩個基因突變僅見于PG患者群體中,在448例對照中均無出現(xiàn)。MAP3K7基因編碼TAK1(tumor growth factor-β activated kinase 1),Prajwal Gurung團隊通過對Ptpn6spin小鼠的研究發(fā)現(xiàn)TAK1是引發(fā)該種小鼠嗜中性粒細胞疾病的關鍵。Ptpn6spin小鼠是PTPN6基因純合突變模型,導致SHP1上208位氨基酸Tyr突變?yōu)锳sn,該種小鼠會出現(xiàn)持續(xù)性的足墊腫脹和化膿性炎癥,與人類嗜中性皮膚病非常相似[12]。在對該種小鼠的研究中發(fā)現(xiàn):脾酪氨酸激酶 (spleen tyrosine kinase,SYK)是一種可磷酸化MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)的關鍵激酶,MyD88磷酸化后可將信號轉導到RIRK1(receptor interacting protein kinase 1,由RIRPK1基因編碼)和TAK1(tumor growth factor-β activated kinase 1 ,由MAP3K7基因編碼),最終促進 IL-1α,TNF,G-CSF等細胞因子分泌,并在PTPN6spin小鼠中介導皮膚病;RIPK1支架功能和TAK1信號傳導在Ptpn6spin小鼠足墊炎癥中發(fā)揮重要作用,我們在人類PG患者中發(fā)現(xiàn)的MAP3K7突變,提示RIPK1-TAK1信號軸可能在人類PG發(fā)病過程中也發(fā)揮著相似的作用。

此外,我們發(fā)現(xiàn)的MPO復合雜合突變(c.1484C> T;c.1705C>T)是隊列中純合(復合雜合)狀態(tài)下觀察到的唯一變化。該患者具有的c.1705C>T錯義突變在先前髓過氧化物酶缺乏癥(MPOD)患者中曾被報道過[13]。 髓過氧化物酶是中性粒細胞嗜天青顆粒和單核細胞溶酶體中的重要成分[14],髓過氧化物酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病,在1954年首次描述,該病是吞噬細胞常見的遺傳缺陷,表現(xiàn)為對病原微生物殺傷能力受損[15]。MPOD患者可伴發(fā)嗜中性皮膚病,例如全身泛發(fā)性膿皰型銀屑病(Generalized pustular psoriasis,GPP)[13]和PG[11]。GPP是一種無菌性膿皰性疾病,可以表現(xiàn)為急性的或持續(xù)性進行性發(fā)作,有時可有危及生命的多系統(tǒng)炎癥發(fā)作。我們在該例MPO復合雜合突變的PG患者中,發(fā)現(xiàn)中性粒細胞計數[9.89×109,參考值(1.8～6.3)×109]增加和中性粒細胞比例(82.4%,參考值40%～55%)增加的現(xiàn)象,這一現(xiàn)象在MPO突變的GPP患者中也有出現(xiàn)。

MPO功能喪失突變導致GPP發(fā)病的機制,已經有了相對清晰的闡釋。Haskamp等證明,GPP患者中的MPO功能喪失突變導致中性粒細胞和單核細胞中的MPO缺乏,并且導致中性粒細胞中中性粒細胞絲氨酸組織蛋白酶(neutrophil serine proteases cathepsin G,CTSG)的活性增加。CTSG的活性增加會導致IL-36前體向IL-36的轉化增加。其次,MPO缺陷導致中性粒細胞細胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)的形成減少,導致與NET結合蛋白酶減少,激活IL-36前體的可溶性中性粒細胞蛋白酶占優(yōu)勢。此外,在MPO缺陷患者和MPO-/-小鼠中,單核細胞對中性粒細胞的吞噬作用(中性粒細胞胞葬作用)受損,這表現(xiàn)為中性粒細胞在皮膚炎癥部位的抵抗時間延長和外周血中性粒細胞計數增多[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明,MPO在皮膚中充當神經營養(yǎng)因子相關炎癥的調節(jié)劑,MPO的功能喪失突變通過IL-36高活化和中性粒細胞胞葬作用受損誘導膿皰型銀屑病的發(fā)生[16]。IL-36也是一種被認為在PG病理生理學中起重要作用的細胞因子[17],在PG患者的皮損中亦可觀察到密集的中性粒細胞浸潤和NET聚集[18],在我們MPO復合雜合突變的患者中也發(fā)現(xiàn)了中性粒細胞計數增加的現(xiàn)象。這些提示,MPO功能喪失突變在PG的發(fā)病過程中,可能發(fā)揮著與在GPP發(fā)病過程中相似的作用。

總之,我們對既往研究的可能與壞疽性膿皮病15個基因進行了目標區(qū)域測序,在MAP3K7,SYK,NOD2,MPO,NLRP12基因中發(fā)現(xiàn)了功能丟失突變位點,其中NOD2與NLRP12基因突變在一項針對意大利PG患者的研究中被報道過[4]。我們在中國漢族的PG患者中發(fā)現(xiàn)了這兩個基因的突變,表明壞疽性膿皮病中存在的NOD2,NLRP12基因的突變可能是跨越種族的。此外,我們發(fā)現(xiàn)了MAP3K7,MPO基因功能丟失突變可能與壞疽性膿皮病的發(fā)病相關。其中,MAP3K7在Ptpn6spin小鼠發(fā)生類似人類嗜中性皮膚病的過程中起著關鍵作用,PTPN6突變在美國壞疽性膿皮病患者中被報道過[5],MAP3K7基因上功能丟失的突變,提示了RIPK1-TAK1信號軸可能在PG發(fā)病過程中起著重要作用。早在1991年,Disdier等就發(fā)表過一例法國PG患者中存在髓過氧化物酶缺陷的病例報道[11],MPO突變可能是髓過氧化物酶缺陷的原因,這提示MPO與PG的發(fā)病可能有著密切的關系。

我們的研究也存在著不足,這可能是由于本研究的樣本量太小而沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異,需要后續(xù)更大樣本量的探索?？傊覀兊难芯堪l(fā)現(xiàn)了兩個有提示意義的基因:MPO與MAP3K7,證明了PG是一種復雜的多基因相關自身免疫性疾病,為進一步探明PG發(fā)病機制提供了遺傳學的視角。