于魯敏,信 陽,楊傳宗,羅 茜,高艷宏,薛 挺

(1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院,山東臨沂 276000;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230036)

禽致病性大腸埃希氏菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)是腸道外致病性大腸埃希氏菌(extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)的一個亞群,能夠引起雞、鴨、鵝等禽類局部或全身性腸道外感染性細(xì)菌病,并伴有多器官損傷的復(fù)雜性綜合征,比如氣囊炎(Airsacculitis)、心包炎(Pericarditis)、腹膜炎(Peritonitis)、 多發(fā)性漿膜炎(Polyserositis)、滑膜炎(Arthromeningitis)、骨髓炎(Osteomyelitis)、 敗血癥(Septicemia)、全眼球炎(Panophthalmitis)、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)、肝周炎(Perihepatitis)、肉芽腫(Granuloma)、蜂窩組織炎(Cellulitis)、輸卵管炎(Salpingitis)和卵黃囊感染(Yolk sac infection)等,統(tǒng)稱為禽大腸桿菌病,從而導(dǎo)致禽類的高發(fā)病率和高病死率,同時不但對世界養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失,而且限制了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。近年來的研究證明APEC能夠通過禽類及其產(chǎn)品或者其他感染方式引起包括人在內(nèi)的哺乳動物疾病,表明APEC是人獸共患病的潛在病原體[5-6]。因此,控制APEC的感染具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌生物被膜的形成不但增強(qiáng)細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性,而且導(dǎo)致宿主持續(xù)和反復(fù)性感染[7-8]。為了了解由生物被膜引起的APEC感染,本文概述了生物被膜的形成過程及各調(diào)控系統(tǒng)對生物被膜的影響,以期探尋破壞生物被膜形成的新策略,從而控制由生物被膜引起的感染和抗菌藥物耐藥性。

1 生物被膜

在APEC感染宿主的過程中,生物被膜的形成有助于APEC從免疫系統(tǒng)中逃逸而持續(xù)定植于宿主細(xì)胞,引發(fā)禽大腸桿菌病[9]。生物被膜是生長在生物表面的微生物群落,它們在一個由胞外多糖、蛋白質(zhì)和eDNA組成的自產(chǎn)胞外基質(zhì)中緊密地黏附在一起[8-9]。生物被膜的形成是一個非常復(fù)雜的過程包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、生物被膜的成熟和解離5個階段[10-11]。生物被膜的早期黏附階段由多種細(xì)胞表面附屬物,如鞭毛、Ⅰ型菌毛、Curli菌毛以及胞外多糖(如纖維素、可拉酸等)參與附著在生物表面[8,11]。在生物被膜的成熟過程中,細(xì)菌細(xì)胞的增殖導(dǎo)致微菌落的擴(kuò)大,從而達(dá)到數(shù)百微米的厚度,并展示出復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能骨架[8-9]。而生物被膜的解離有利于浮游細(xì)菌的傳播和尋找新的定植區(qū)域,以促使浮游細(xì)菌開啟生物被膜形成的新一輪循環(huán)[7]。生物被膜是APEC的一層保護(hù)膜,用于保護(hù)APEC免受抗菌藥物治療和逃避宿主的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致宿主持續(xù)和反復(fù)性感染,并且很難被預(yù)防、控制和清除[12-13]。因此,詳細(xì)闡釋調(diào)控APEC生物被膜形成的分子機(jī)制對探尋抗生物被膜感染的藥物靶標(biāo)變得尤為重要。

2 調(diào)控系統(tǒng)

為了更好地適應(yīng)宿主細(xì)胞外環(huán)境的變化,APEC已經(jīng)發(fā)展了一系列嚴(yán)密的調(diào)控系統(tǒng),這些調(diào)控系統(tǒng)在生物被膜形成的每一個階段均有參與,以調(diào)控生物被膜相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而維持生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性[11]。該調(diào)控系統(tǒng)主要包括群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)、雙組份系統(tǒng)(two-component system,TCS)和第二信使(second messenger,SM)等[14-16]。其中,自誘導(dǎo)物-2 (autoinducer-2,AI-2)、BasSR和環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)均在信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮了重要的作用,并參與調(diào)控生物被膜的形成[12,17-18]。

2.1 自誘導(dǎo)物-2群體感應(yīng)

QS是一種細(xì)胞與細(xì)胞交流的過程,在此過程中細(xì)菌細(xì)胞利用其自身分泌的化學(xué)分子也稱為自誘導(dǎo)物(autoinducers,AIs)來調(diào)節(jié)特定的生理功能,以響應(yīng)群體密度的波動,從而更好地適應(yīng)外部環(huán)境[1,14]。當(dāng)AIs濃度達(dá)到閾值時,能夠觸發(fā)下游基因的表達(dá),進(jìn)而引起細(xì)菌的群體性變化并且調(diào)節(jié)細(xì)菌的各種生理特性,如生物發(fā)光、細(xì)胞運(yùn)動性、毒力基因表達(dá)、抗菌藥物敏感性和生物被膜形成等[19-20]。其中,AI-2 QS被許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生,并且在細(xì)菌種內(nèi)和種間的通訊中起了重要的作用[21]。在E.coli中,胞外AI-2的濃度在指數(shù)期達(dá)到閾值水平時,激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)以促使ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體攝取和修飾AI-2[1]。隨后,胞內(nèi)AI-2被胞質(zhì)激酶LsrK磷酸化形成活性分子AI-2-P,該分子與其胞內(nèi)受體LsrR結(jié)合以激活QS系統(tǒng),進(jìn)而調(diào)控毒力基因表達(dá)、抗菌藥物敏感性和生物被膜形成等[1,2,11,14]。為此,有學(xué)者提出,通過抑制QS的方式抑制生物被膜的形成,進(jìn)而控制E.coli感染[14,21]。

2.2 BasSR雙組份系統(tǒng)

TCS是一種獨(dú)特的對外部環(huán)境持續(xù)監(jiān)控的系統(tǒng)。致病菌依靠它檢測環(huán)境中各種生理因素的變化,并據(jù)此迅速調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和生理行為,以達(dá)到適應(yīng)新環(huán)境和生存繁殖的目的[22-23]。在TCS信號傳導(dǎo)通路中,TCS參與調(diào)控生物發(fā)光、生物被膜形成、致病基因的表達(dá)以及抗菌藥物耐藥性等多種生物過程[15]。BasSR是一個典型的TCS,由位于細(xì)胞膜上的組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和位于胞漿內(nèi)的響應(yīng)調(diào)節(jié)子(response regulator,RR)組成,其功能研究已有相關(guān)報道,如在E.coliK-12中,BasSR不僅調(diào)控膜結(jié)構(gòu)的形成和修飾相關(guān)的基因表達(dá),而且調(diào)控壓力響應(yīng)細(xì)胞功能的基因表達(dá),包括生物被膜形成的主要調(diào)節(jié)子CsgD[24];而在APEC臨床分離株中,BasSR不僅特異性結(jié)合多重藥物外排泵EmrD的啟動子以激活EmrD的表達(dá),進(jìn)而影響APECX40對多西環(huán)素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、林可霉素、克林霉素、SDS和紅霉素8種抗菌藥物的耐藥性[25],BasSR還通過調(diào)控生物被膜形成相關(guān)基因bcsA、csgA、fliC、fimA、motA和wcaF的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)APECX40生物被膜的形成[26]。該研究為探究TCS調(diào)控生物被膜形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為抑制TCS以破壞生物被膜形成提供了新線索。

2.3 環(huán)二鳥苷酸

SM是細(xì)胞表面受體接受胞外信號后通過一系列酶促反應(yīng)在胞內(nèi)產(chǎn)生的一種小分子物質(zhì)[27]。細(xì)菌中常見的第二信使包括環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、鳥苷四磷酸(guanosine tetraphosphate,ppGpp)和c-di-GMP等[27]。其中,c-di-GMP是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細(xì)菌中的一種第二信使分子,與細(xì)菌的致病性、運(yùn)動性、毒力、鞭毛合成、生物被膜的形成以及細(xì)胞分化等生物功能過程密切相關(guān)[28]。一般來說,低濃度c-di-GMP與浮游細(xì)菌的運(yùn)動性和高致病性有關(guān),而高濃度c-di-GMP促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞表面黏附、生物被膜形成以及慢性感染[29]。在c-di-GMP信號傳導(dǎo)途徑中,胞外信號經(jīng)傳導(dǎo)后轉(zhuǎn)變?yōu)閏-di-GMP的濃度變化,而c-di-GMP的濃度受二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的調(diào)控[27,30]。研究發(fā)現(xiàn),腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)O157:H7 c-di-GMP PDE VmpA的失活增強(qiáng)生物被膜形成以及降低其泳動性[31];而E.coliK-12 c-di-GMP PDE YfgF參與調(diào)控K-12細(xì)胞表面的重塑、c-di-GMP濃度變化以及生物被膜形成[32]。這些結(jié)果為干擾c-di-GMP代謝和信號傳導(dǎo)以控制生物被膜形成奠定了基礎(chǔ),并為探尋破壞生物被膜的形成提供了新思路。

2.4 兩個系統(tǒng)間的互作研究

近年來,盡管c-di-GMP信號網(wǎng)絡(luò)將環(huán)境刺激與細(xì)菌細(xì)胞的特定適應(yīng)性反應(yīng)建立了關(guān)聯(lián),但是仍然存在許多問題有待解決,如依賴于c-di-GMP的不同調(diào)控通路之間的相互作用是如何被規(guī)避的?以及c-di-GMP信號網(wǎng)絡(luò)是如何與細(xì)菌細(xì)胞中其他的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互聯(lián)系的?基于上述問題的研究已有相關(guān)報道,如Liu Y T等[33]報道,RstAB TCS通過調(diào)節(jié)c-di-GMP濃度控制EHEC O157:H7生物被膜的形成和毒力因子的表達(dá)。Li S Y等[34]報道,AI-2 QS通過激活YeaJ DGC誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)胞內(nèi)c-di-GMP合成,進(jìn)而調(diào)控生物被膜的形成和Ш型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)活性以影響S.typhimurium的致病性。作者前期研究工作發(fā)現(xiàn),BasSR TCS通過調(diào)控c-di-GMP PDE YfgF影響APEC生物被膜的形成[1]。這些研究表明,QS和TCS信號通路整合到c-di-GMP,進(jìn)而調(diào)控生物被膜的形成和毒力因子的表達(dá)。這或許為干擾c-di-GMP代謝以破壞生物被膜的形成或預(yù)防細(xì)菌感染提供了新途徑。

3 展望

生物被膜形成是一個非常復(fù)雜的過程,包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、成熟和解離5個階段。在生物被膜形成的每個階段中,都需要多個系統(tǒng)共同參與調(diào)控生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)以促進(jìn)生物被膜的形成和維持生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性。盡管學(xué)者們在分子水平上已經(jīng)詳細(xì)的闡明了生物被膜的形成機(jī)制,以及QS、TCS、c-di-GMP 等系統(tǒng)均參與調(diào)控生物被膜形成的分子機(jī)制,但是仍然沒有提出任何破壞生物被膜形成的新策略[7]。因此,充分了解多系統(tǒng)間的互作網(wǎng)絡(luò)以及多系統(tǒng)共同調(diào)控生物被膜形成的分子機(jī)制仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。換言之,探尋多系統(tǒng)互作或者共同調(diào)控生物被膜形成的中間調(diào)控蛋白,或許可以作為破壞生物被膜形成的研究策略。希望通過本文的概述,利用中間調(diào)控蛋白阻斷生物被膜的早期黏附,以期從源頭破壞生物被膜的形成,從而為控制由生物被膜引起的抗菌藥物耐藥性和慢性感染或持續(xù)性感染提供研究方向,最終為徹底治療與生物被膜相關(guān)的疾病帶來希望。

被動治療是養(yǎng)禽業(yè)中一件不得已而為之的事情,只有嚴(yán)格認(rèn)真地做好了平時的預(yù)防工作,才能保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。在禽病防控過程中,要做到給禽群以舒適的飼養(yǎng)環(huán)境,平衡的日糧營養(yǎng),良好的飼養(yǎng)管理,科學(xué)合理及時的藥物預(yù)防,只有這樣才能夠阻止各種致病菌的侵入,以防止禽群受到疾病的危害,真正做到“養(yǎng)防結(jié)合、養(yǎng)重于防、防重于治、預(yù)防為主”的綜合防控措施,從而提高禽群的健康水平和抗病能力,控制禽群不發(fā)病[35]。