張 蕾,陳 亮,江波濤,馮萬(wàn)宇,蘭世捷,苗 艷,沈思思,李 丹,田秋豐,楊昊天,張 艷,劉雪松,黃宣凱,鐘 鵬,史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江齊齊哈爾 161000)

體外核酸擴(kuò)增(invitronucleic acid amplification,NAA)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病病原體的分子診斷, 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)均已被證實(shí)是精準(zhǔn)和高效的診斷工具。但是,此類擴(kuò)增方法需要具備專業(yè)儀器、嚴(yán)格的加熱和冷卻熱循環(huán)條件、高質(zhì)量的核酸反應(yīng)組分、熟練的操作人員和良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。近年來(lái),常規(guī)PCR隨著技術(shù)的發(fā)展已有所改進(jìn),但仍比較耗時(shí)。

為了突破傳統(tǒng)PCR的局限性,學(xué)者們已經(jīng)開發(fā)了基于不同酶(反應(yīng))機(jī)制和擴(kuò)增系統(tǒng)的多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcription mediated amplification,TMA)、鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification,SDA)、解旋酶依賴性擴(kuò)增((helicase-dependent amplification,HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)和滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增(rolling loop amplification,RCA)等[1]。與常規(guī)PCR相比,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)更易于在低資源配置環(huán)境中實(shí)施,并且該技術(shù)可通過(guò)去除加熱和冷卻步驟,允許多種分子反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,縮短了反應(yīng)時(shí)間。在多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中,RPA技術(shù)雖然開發(fā)較晚,卻因其不依賴專業(yè)設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、高敏感性和特異性的特點(diǎn)而得到快速發(fā)展和應(yīng)用[2]。迄今為止,基于RPA開發(fā)的動(dòng)物疾病診斷和病原檢測(cè)(病毒、細(xì)菌、真菌和和寄生蟲)方法已有諸多報(bào)道。

1 重組酶聚合酶技術(shù)

1.1 反應(yīng)體系和原理

RPA是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),由Niall Armes(ASM Scientific Ltd of Cambridge,UK)于2006年研發(fā),其優(yōu)勢(shì)是不依賴于常規(guī)PCR反應(yīng)的熱循環(huán)。RPA反應(yīng)體系包括3種關(guān)鍵蛋白、枯草芽孢桿菌DNA聚合酶Ⅰ(Bsu)或金黃色葡萄球菌聚合酶(Sau)、引物、模板和輔助組分。3種關(guān)鍵蛋白分別是T4 UvsX蛋白、T4 UvsY蛋白和T4 gp32蛋白。T4 UvsX蛋白是具有識(shí)別配對(duì)和轉(zhuǎn)移活性的重組酶。介體蛋白T4 UvsY是重組酶負(fù)載因子。單鏈結(jié)合蛋白T4 gp32可優(yōu)先與解開的單鏈DNA結(jié)合[3]。

反應(yīng)體系在恒溫條件下開始擴(kuò)增時(shí),重組酶T4 UvsX在負(fù)載因子T4 UvsY的幫助下與引物結(jié)合,形成重組酶引物復(fù)合物。復(fù)合物在雙鏈DNA中尋找同源序列位點(diǎn),一旦識(shí)別到靶位點(diǎn),復(fù)合物直接侵入雙鏈DNA并結(jié)合,引發(fā)鏈交換反應(yīng),形成D環(huán)結(jié)構(gòu),D環(huán)的另一側(cè)仍然是單鏈。移位的單鏈則會(huì)被單鏈結(jié)合蛋白T4 gp32結(jié)合,以防止復(fù)合物中的引物解離[4]。隨后,重組酶引物復(fù)合物在水解ATP的同時(shí),自身構(gòu)象發(fā)生改變,繼而重組酶從核蛋白細(xì)絲釋放出來(lái),并可立即與另一對(duì)引物結(jié)合,開始新一輪的鏈置換反應(yīng)。同時(shí),引物的3′端暴露并被DNA聚合酶識(shí)別,由DNA聚合酶催化開始擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)從兩端的正向和反向引物同時(shí)進(jìn)行,合成的擴(kuò)增產(chǎn)物不斷成為新的模板,從而實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增[1,5]。值得注意的是,負(fù)載因子T4 UvsY阻礙了單鏈結(jié)合蛋白與重組酶T4 UvsX競(jìng)爭(zhēng)引物結(jié)合位點(diǎn),避免引物與單鏈結(jié)合蛋白相結(jié)合[6]。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)

RPA反應(yīng)引物的推薦長(zhǎng)度為30～35個(gè)核苷酸,以利于重組酶和引物形成復(fù)合物,引物過(guò)短(18～25個(gè)核苷酸)可能降低反應(yīng)的速度和靈敏度,引物過(guò)長(zhǎng)(大于45個(gè)核苷酸)則會(huì)形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)引物時(shí),在5′端不推薦使用長(zhǎng)鏈鳥嘌呤,3′端則應(yīng)包含鳥嘌呤和胞嘧啶,G、C含量應(yīng)為30%～70%,以及避免回紋結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)[7]。也可以引入自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRs)寡核苷酸,天然堿基被A*、T*、G*和C*取代,其中A*和T配對(duì),T*和A配對(duì),G*和C配對(duì),C和G配對(duì),但A*不和T*配對(duì),G*不和C*配對(duì),從而避免形成引物二聚體。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)中使用的Exo探針(46～52個(gè)核苷酸)和Fpg探針(32～35個(gè)核苷酸),以及側(cè)流層析結(jié)合RPA反應(yīng)中使用的Nfo探針(46～52個(gè)核苷酸)的設(shè)計(jì),Twist D xTM商品化RPA反應(yīng)試劑盒手冊(cè)中有較細(xì)的描述。RPA反應(yīng)的引物和探針比較復(fù)雜,要獲得最佳組合,必需經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)、優(yōu)化和評(píng)估。RPA反應(yīng)獲得的目的片段長(zhǎng)度應(yīng)少于500 bp,多數(shù)研究成果表明最佳擴(kuò)增長(zhǎng)度是100～200 bp,然而也有學(xué)者報(bào)告擴(kuò)增了79 bp和1 941 bp的目的片段[1]。

1.3 反應(yīng)條件

除了保障反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵蛋白和酶,RPA反應(yīng)的原理決定了目標(biāo)序列的選擇以及引物、探針的設(shè)計(jì)是其敏感性和特異性的內(nèi)在決定因素,在下文中會(huì)做詳細(xì)闡述。外部影響因素則包括溫度和攪拌。RPA檢測(cè)不需要精確的溫度控制,重組酶在25～42 ℃就可以發(fā)揮活性,然而,幾個(gè)研究小組在15～50 ℃的溫度范圍對(duì)RPA反應(yīng)進(jìn)行了測(cè)試,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的臨界溫度應(yīng)大于30 ℃,如果溫度低于30 ℃,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間也無(wú)法保證RPA反應(yīng)的穩(wěn)定性[4,8],研究表明,RPA反應(yīng)的最佳溫度為37～42 ℃[9]。在反應(yīng)體系中,重組酶通?？梢栽?5 min內(nèi)消耗所有ATP,所以無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)。攪拌可以促進(jìn)RPA反應(yīng)各組分間的相互作用,在反應(yīng)開始和第4分鐘對(duì)體系進(jìn)行攪拌,可以提高反應(yīng)效率,并且持續(xù)的溫和振動(dòng)也使RPA擴(kuò)增結(jié)果能更快速、穩(wěn)定地顯示在側(cè)流層析試紙條上[7]。

2 檢測(cè)方法

2.1 常用檢測(cè)方法

常規(guī)的PCR檢測(cè)方法適用于RPA,如凝膠電泳和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物常含有蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì),不適宜直接進(jìn)行凝膠電泳,因?yàn)檫@會(huì)影響電泳時(shí)目的基因片段的正確遷移,從而干擾結(jié)果判定。擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳檢測(cè)前,可通過(guò)去污劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)、加熱(如65 ℃或95 ℃加熱10 min)、酶消化(如蛋白酶 K)以及進(jìn)行純化回收等方法處理。其中,加熱、SDS洗滌和蛋白酶K消化效果相似,相比之下,經(jīng)過(guò)試劑盒純化后的目的條帶特異性更好,但純化后會(huì)產(chǎn)生一些DNA損耗[10]。另外,Babu B等[11]報(bào)道,通過(guò)高速離心將待檢物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀,效果與在65 ℃ 加熱10 min相似。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可用于檢測(cè)RPA反應(yīng)過(guò)程中和反應(yīng)終點(diǎn)的結(jié)果,然而,當(dāng)使用如SYBR Green的熒光染料時(shí),由于無(wú)法區(qū)分?jǐn)U增的目的基因和引物二聚體,可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。為了避免這個(gè)問(wèn)題,可以使用不同格式的探針,包括以相應(yīng)酶命名的Exo、Fpg和Nfo探針。熒光PCR的常規(guī)探針與RPA不兼容(如TaqMan探針),是由于5′- 3′端的核酸外切酶活性與RPA不兼容,阻礙DNA擴(kuò)增。Exo探針是與靶序列同源的寡核苷酸,它的3′端被阻斷以防止探針伸長(zhǎng),探針兩端分別攜帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),二者之間被四氫呋喃(tetrahydrifuran,THF)隔開,反應(yīng)時(shí)核酸外切酶Ⅲ識(shí)別并切割THF,使兩個(gè)基團(tuán)分開,從而促使熒光產(chǎn)生[12]。Fpg探針與Exo探針相似,Fpg酶在堿性脫氧核糖(deoxyribose,dR)基團(tuán)的位置切割并釋放熒光基團(tuán),產(chǎn)生熒光信號(hào)[13]。在實(shí)時(shí)熒光RPA試驗(yàn)中,應(yīng)設(shè)計(jì)和評(píng)估多組引物和探針,以獲得最佳組合。

側(cè)流層析(lateral flow chromatography,LFC)是目前應(yīng)用廣泛的RPA終點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)。RPA-LFC技術(shù)可以快速、便捷地實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化判斷,通常用來(lái)定性或半定量檢測(cè),適用于條件有限和非實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境[14]。RPA-LFC技術(shù)通常使用TwistAmp?nfo試劑盒、生物素(biotin)標(biāo)記的引物和羧基熒光素(carboxyfluorescein,FAM)標(biāo)記的探針。反應(yīng)中,攜帶FAM標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng),使5′端形成FAM標(biāo)記,攜帶生物素標(biāo)記的下游引物使3′端擴(kuò)增產(chǎn)物形成生物素標(biāo)記。經(jīng)過(guò)雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物吸附在側(cè)向流動(dòng)試紙條樣品墊上,產(chǎn)物上的FAM與抗FAM抗體的膠體金顆粒結(jié)合形成免疫復(fù)合物,免疫復(fù)合物在擴(kuò)散的過(guò)程中,被檢測(cè)線上的鏈霉親和素(streptavidin,SA)捕獲,從而產(chǎn)生顏色變化[15]。除了常用的羧基熒光素外,地高辛(DIG)或Alexa fluor 488染料也是較好的抗原候選標(biāo)記。在此方法基礎(chǔ)上,以不同的抗原標(biāo)記結(jié)合生物素,設(shè)計(jì)多重檢測(cè)線,同時(shí)設(shè)置內(nèi)部控制,即可達(dá)到在同一擴(kuò)增體系內(nèi)檢測(cè)不同病原基因的目的[13]。

2.2 特殊檢測(cè)方法

除了常規(guī)檢測(cè)方法,還有多種檢測(cè)方法已經(jīng)與RPA相結(jié)合,如電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光、絮凝分析和基于硅微環(huán)諧振器 (silicon microring resonator,SMR) 的光子檢測(cè)、表面增強(qiáng)拉曼散射 (surface enhanced Raman scattering,SERS)和CRISPR/Cas( clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated)系統(tǒng)。電化學(xué)RPA的原理是通過(guò)電化學(xué)活性化合物來(lái)產(chǎn)生與擴(kuò)增產(chǎn)物相關(guān)的信號(hào),一種方法是使用磁珠標(biāo)記的正向引物和金納米顆粒(AuNP)標(biāo)記的反向引物,獲得的雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被磁體捕獲到工作電極上,通過(guò)電催化析氫反應(yīng)直接檢測(cè)AuNP。Ng B Y C等[16]以AuNP作為RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)傳感器,能夠檢測(cè)到低至1 CFU單位的結(jié)核分支桿菌DNA,且便攜式電化學(xué)傳感器的使用為即時(shí)醫(yī)療(point-of-care,POC)提供了便利。此外,也可使用差分脈沖伏安法進(jìn)行基于AuNP的電化學(xué)檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)是將氧化或水解反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可見光的發(fā)射。Kober C等[17]開發(fā)了一種流式化學(xué)發(fā)光DNA微陣列,使其結(jié)合等溫不均勻RPA,可在1 h內(nèi)定量檢測(cè)軍團(tuán)菌以及嗜肺軍團(tuán)菌的活菌和死亡菌體。此方法程序相對(duì)繁瑣,在聯(lián)合便攜式檢測(cè)設(shè)備使用時(shí),可提高其現(xiàn)場(chǎng)實(shí)用性。橋接絮凝試驗(yàn)是使長(zhǎng)聚合物交聯(lián)多個(gè)顆粒,從而在特定緩沖體系(如 pH和鹽濃度)中從溶液中絮凝出來(lái)。一般情況下,交聯(lián)的DNA長(zhǎng)度需大于100 bp,將磁珠與RPA擴(kuò)增產(chǎn)物混合,經(jīng)過(guò)乙醇洗滌后使顆粒懸浮在低pH緩沖液中,如果形成絮凝物則說(shuō)明結(jié)果陽(yáng)性[18]?；诠栉h(huán)諧振器 (SMR) 的光子檢測(cè)是以不對(duì)稱方式進(jìn)行核酸擴(kuò)增,首先將一個(gè)引物固定在SMR上,核酸與之結(jié)合后可引起波導(dǎo)表面處折射率的變化,通過(guò)SMR 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獲得檢測(cè)結(jié)果。DAO等報(bào)告了一種RPA-SMR與富集病原體的微流體平臺(tái)相結(jié)合的方法,該系統(tǒng)對(duì)10 mL 尿液中沙門氏菌和布魯氏菌的檢測(cè)線分別為50 CFU和102 CFU[1]。表面增強(qiáng)拉曼散射 (SERS)的原理是一些分子被吸附到某些粗糙的金屬(如銀、銅、金等) 表面時(shí),它們共振驅(qū)動(dòng)表面電荷,產(chǎn)生高度局域化(等離子體)光場(chǎng),使拉曼散射強(qiáng)度增加。Wang J等[19]報(bào)告了多重RPA-SERS檢測(cè),將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物與銀納米顆粒孵育,對(duì)43例患者尿液樣本進(jìn)行分析,所得結(jié)果的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率分別為95.3%、93.0%和94.2%。 CRISPR/Cas系統(tǒng)是新興的基因編輯工具,基于CRISPR的檢測(cè)依賴于Cas蛋白的切割活性,當(dāng)Cas蛋白結(jié)合到CRISPR RNA(crRNA)時(shí),crRNA與靶序列特異性配對(duì),隨后誘導(dǎo)靶序列被酶切以及單鏈DNA、RNA被非靶向側(cè)切。CRISPR/Cas聯(lián)合RPA,通過(guò)靶向結(jié)合后切割熒光淬滅基團(tuán),可以放大信號(hào)來(lái)提高檢測(cè)靈敏度。但是,CRISPR/Cas-RPA需要使用額外標(biāo)記的ssDNA、ssRNA報(bào)告基因,增加了檢測(cè)成本,該方法用于動(dòng)物病原檢測(cè)仍需要更多的探究[20]。

3 重組酶聚合酶技術(shù)在動(dòng)物病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用

RPA技術(shù)可用于檢測(cè)多種目標(biāo)生物,包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等。細(xì)菌是感染人和動(dòng)物的重要病原,在世界范圍內(nèi)危害人類健康,威脅生物安全,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)是有效防治細(xì)菌性疾病的重要手段。過(guò)去十幾年,動(dòng)物細(xì)菌病的分子診斷技術(shù)取得了顯著進(jìn)步,RPA技術(shù)作為具有現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值的新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),在動(dòng)物常見病原菌檢測(cè)中已有諸多研究報(bào)道,其中,檢測(cè)方法仍以凝膠電泳、RT-RPA和RPA-LFD最為常見。

3.1 革蘭氏陽(yáng)性菌

革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、結(jié)核分支桿菌、炭疽桿菌等,能引發(fā)動(dòng)物和人體不同程度的疾病。吳華華等[21]以金黃色葡萄球菌nuc基因保守序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物,優(yōu)化擴(kuò)增條件,對(duì)培養(yǎng)物、牛奶和肉質(zhì)樣本進(jìn)行RPA檢測(cè),在35 min內(nèi)獲得了特異性強(qiáng)、靈敏度高的結(jié)果。徐健皓等[22]基于金黃色葡萄球菌femB基因設(shè)計(jì)并優(yōu)化引物和Exo熒光探針,建立了金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光 RPA檢測(cè)方法,可在39 ℃、5～10 min快速檢出最低量為 3.82 fg的金黃色葡萄球菌基因組DNA,檢測(cè)模擬臨床血液樣本的敏感性好,有潛力應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?；赗PA-LF可視化技術(shù),兩組研究分別報(bào)告了針對(duì)豬肺炎鏈球菌2型的cpsJ2基因和豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶(gdh)基因設(shè)計(jì)引物、探針,建立了比細(xì)菌分離和常規(guī)PCR方法更高效率的RPA-LF檢測(cè)法,有效指標(biāo)評(píng)估和臨床檢測(cè)適用性較好[22-24]。由于疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)能穿過(guò)死亡細(xì)菌的細(xì)胞膜與 DNA 結(jié)合。Chen J等[25]首次使用PMA處理的DNA作為模板,排除雜質(zhì)DNA產(chǎn)生的假陽(yáng)性干擾,開發(fā)了快速、準(zhǔn)確的化膿性鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌雙實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)系統(tǒng),適用于食品和臨床檢測(cè)。炭疽桿菌作為烈性傳染病病原體,其快速準(zhǔn)確的診斷深受重視。王素華等[26]根據(jù)炭疽桿菌BA5445保守基因序列,建立了最低檢測(cè)線為100拷貝/μL的RPA檢測(cè)方法,該方法對(duì)被炭疽桿菌污染的毛皮標(biāo)本的檢出率為65.71%,稍低于RT-PCR(71.43%),具有重要的臨床診斷和防控價(jià)值。兩組研究分別報(bào)告了單核細(xì)胞增生李斯特菌 RPA-LFD 檢測(cè)系統(tǒng)與qRPA和免疫磁分離(immunomagnetic separation,IMS)相結(jié)合的技術(shù)。前者在基因組上選取多組序列設(shè)計(jì)、優(yōu)化引物,完全去除了引物二聚體的假陽(yáng)性干擾,后者用IMS技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,達(dá)到了純化和濃縮樣本、排除干擾的目的,提高了敏感性和特異性[27-28]。此外,RPA技術(shù)還應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念珠球菌等的快速檢測(cè)[29-31]。

3.2 革蘭氏陰性菌

革蘭氏陰性菌包含有多種常見的動(dòng)物病原菌,RPA技術(shù)問(wèn)世以來(lái)已經(jīng)在此領(lǐng)域報(bào)告了許多新的檢測(cè)方法。劉婧文等應(yīng)用RT-RPA技術(shù)在20 min內(nèi)完成了對(duì)人工污染大腸埃希氏菌樣品增菌9 h培養(yǎng)物的定性檢測(cè),最低檢測(cè)限為0.01 ng/μL。McQuillan J S等[33]針對(duì)大腸埃希氏菌ybbW基因設(shè)計(jì)RT-RPA方法,在3 min內(nèi)可獲得檢測(cè)結(jié)果,對(duì)從99株大腸埃希氏菌提取的DNA檢出率為100%,最低檢測(cè)限為100拷貝/μL,并排除了30種非目標(biāo)菌。針對(duì)大腸埃希氏菌O157:H7 的RPA-LFD技術(shù)不僅能快速、靈敏地檢測(cè)出飲用水和生牛乳中的大腸埃希氏菌,還通過(guò)結(jié)合PMA處理做到了僅檢測(cè)大腸埃希氏菌O157:H7活菌,檢出限為102CFU/mL[34-35]。不同血清型的沙門氏菌對(duì)人/動(dòng)物具有致病性,已報(bào)道的針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌開發(fā)的RPA-LFD檢測(cè)方法不僅最低檢測(cè)限可達(dá)到1 CFU/μL,并且通過(guò)在引物和探針序列中引入特定的替換堿基,經(jīng)分析和篩選,消除了引物二聚體和引物-探針復(fù)合物的假陽(yáng)性干擾[36-37]。Stringer O W等[38]報(bào)道,針對(duì)胸膜肺炎放線桿菌種特異性apxIVA基因建立了最低檢測(cè)限為10拷貝/μL的RPA診斷方法,對(duì)61份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果敏感性和特異性分別為84.3%和100%,同時(shí),將14份肺組織樣本直接在FTA卡上形成印記,RPA檢測(cè)結(jié)果的敏感性和特異性分別為76.9%和100%,表明該方法用于現(xiàn)場(chǎng)篩查病原菌是可行的。多殺性巴氏桿菌可引發(fā)家畜呼吸道疾病和出血性敗血癥,以KmtⅠ基因?yàn)榘行蛄薪⒌腞PA-LFD檢測(cè)方法能在39 ℃、30 min內(nèi)檢測(cè)到多殺性巴氏桿菌,最低檢測(cè)限為120拷貝/μL,對(duì)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示出高敏感性和特異性[39]。 張珊珊等[40]基于布魯氏菌bcsp31基因序列保守區(qū)建立的RPA-LFD檢測(cè)方法,最低檢測(cè)限為5.89 CFU/mL,對(duì)比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),臨床樣本檢測(cè)結(jié)果一致。溶血性曼氏菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和牛支原體是引發(fā)牛呼吸道疾病(BRD)的4種主要病原體,Conrad C C等[41]基于以上病原的種特異性基因、7種耐藥基因和整合結(jié)合元件(ICE)設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了11種RPA反應(yīng),建立了多重RPA檢測(cè)方法,并對(duì)100份牛場(chǎng)采集的深鼻咽拭子進(jìn)行試驗(yàn),與培養(yǎng)法和常規(guī)PCR相比,該方法能在更短的時(shí)間內(nèi)從樣本中直接鑒定4種病原體和AMR/ICE基因,具有作為BRD和耐藥基因現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具的巨大潛力。RPA技術(shù)在革蘭氏陰性菌檢測(cè)方面的開發(fā)還包括空腸彎曲菌、鼠疫耶爾森菌等,兼具反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高和易操作的特點(diǎn)是RPA與其他分子生物學(xué)方法相比較的優(yōu)勢(shì)[42-43]。

4 小結(jié)與展望

RPA是一種新興的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),自2006年首次被報(bào)道以來(lái),該技術(shù)在刊物發(fā)表、普及度和應(yīng)用方面均呈指數(shù)增長(zhǎng)。學(xué)者們除了對(duì)RPA的應(yīng)用做了廣泛的研究外,還在尋求進(jìn)一步提升RPA性能的方法。RPA在等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中具有簡(jiǎn)單、快速、敏感性高和環(huán)境要求低的突出優(yōu)勢(shì),并且與其他檢測(cè)技術(shù)的兼容性好。此外,即使樣本是粗提或存在PCR抑制劑,RPA也可以在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增。然而,RPA也存在一些局限性,RPA試劑盒供貨商的單一可能會(huì)影響其定價(jià),也限制了用戶的靈活使用。并且,由于RPA靈敏度較高,檢測(cè)容易受到氣溶膠污染,未來(lái)的研究可考慮建立DNA 提取與RPA反應(yīng)一體的系統(tǒng)或試劑盒,降低暴露和氣溶膠污染的可能性。需要注意的是,RPA的實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)是基于時(shí)間閾值而不是周期閾值,而時(shí)間閾值受到模板濃度、溫度和混合步驟的影響,為了能更好的控制實(shí)時(shí)RPA,建議減慢反應(yīng)速率和降低乙酸鎂濃度。RPA對(duì)引物和探針有嚴(yán)格的要求,但目前尚沒(méi)有設(shè)計(jì)軟件和成熟的設(shè)計(jì)方案,未來(lái)可以開發(fā)相關(guān)引物、探針的設(shè)計(jì)軟件或網(wǎng)站,用于篩選最佳的引物、探針組合,從而提高檢測(cè)效率。

細(xì)菌性病原體危害全球養(yǎng)殖業(yè),造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,并威脅人類的健康、生命和公共生物安全,為了滿足對(duì)病原體的檢測(cè)要求,必須建立靈敏、快速、特異、多元的檢測(cè)方法。雖然RPA技術(shù)已在人的醫(yī)學(xué)和藥學(xué)廣泛應(yīng)用,并開始用于檢測(cè)人畜共患病病原體,但是其在動(dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用還不夠先進(jìn)和多樣化,將RPA與便攜式設(shè)備、生物傳感器、橫向流動(dòng)裝置和微流體設(shè)備等結(jié)合,開發(fā)用于動(dòng)物疾病現(xiàn)場(chǎng)診斷的便攜、易操作和多重分子診斷方法,將成為重要的研究領(lǐng)域,有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。