段慧慧,于 瑞,劉忠虎,杜向黨,商艷紅*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,河南鄭州 450046;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院,河南鄭州 450046)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要病原體,可使豬出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎等疾病[1],嚴重時會發(fā)生猝死現(xiàn)象[2]。1998年江蘇省和2005年四川省暴發(fā)的兩起致命性人類鏈球菌中毒性休克綜合征,證實了豬鏈球菌也具有感染人并使人患病的能力[3]?？咕幬锏牟徽_使用導致臨床分離豬鏈球菌耐藥范圍逐漸擴大,這預示著耐藥機制也更加復雜。先前的研究已將豬鏈球菌描述為關鍵的抗菌藥物抗性基因庫和驅(qū)動抗菌藥物發(fā)生耐藥性進化的基因傳遞系統(tǒng)[4]。

可移動遺傳元件(mobilizable genetic elements,MGEs)包括質(zhì)粒、基因組島、整合性接合元件(integrative and conjugative elements,ICEs)、轉(zhuǎn)座子、噬菌體和嵌合元件,它們都可攜帶單/多個抗菌藥物抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)且將其轉(zhuǎn)移到相同/不同細菌中[3]。細菌的大多數(shù)耐藥機制與ARGs表達有關,且基因的水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)在細菌耐藥性方面占據(jù)主要地位,不斷促進細菌發(fā)生進化。與基因的垂直轉(zhuǎn)移相比,HGT能夠在遠親細胞之間獲得外源基因[5]。HGT的3種常見機制是轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導[6],其中,接合機制是豬鏈球菌在外界壓力存在時獲得優(yōu)勢生長條件的最常見機制。ICEs是近年來在豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的一種越來越常見且能夠發(fā)生移動的基因水平轉(zhuǎn)移載體[7]。它位于宿主細胞的染色體上,可將細菌間的基因通過接合轉(zhuǎn)移的方式發(fā)生水平轉(zhuǎn)移,使細菌獲得更多具有多種功能且有利于其生存的適應性基因。研究證明[8]ICEs是一類兼具質(zhì)粒和噬菌體特征的鑲嵌元件,它依據(jù)噬菌體的方式對宿主細胞的染色體進行復制,通過質(zhì)粒接合的方式對染色體進行轉(zhuǎn)移。ICEs的存在對宿主細菌的進化起著重要作用,包括增強細菌毒力、對抗菌藥物和重金屬的抗性、生物膜形成和毒素/抗毒素系統(tǒng)。因此,對豬鏈球菌中的ICEs等可移動元件的研究是十分必要的。本文主要通過對ICEs的發(fā)現(xiàn)、分類、存在形式和相互作用、轉(zhuǎn)移途徑和相關結(jié)構作用及其與細菌耐藥性和致病性等方面進行介紹,為豬鏈球菌中ICEs的研究提供理論基礎。

1 整合性接合元件的發(fā)現(xiàn)

ICEs又稱為接合轉(zhuǎn)座子,是編碼蛋白質(zhì)的可移動元件,其通過接合的方式從宿主細胞轉(zhuǎn)移到受體中。1967年人們在雷氏普羅維登斯菌中發(fā)現(xiàn)一個可對金屬元素和卡那霉素產(chǎn)生抗性的89 kb基因元件Inc J質(zhì)粒(R391)。隨后,又在霍亂弧菌O139中鑒定出62 kb基因元件SXT,其能夠引起流行性霍亂且攜帶的部分基因促使細菌對磺胺甲惡唑和甲氧芐胺嘧啶表現(xiàn)出抗性。由于此類元件越來越多,為了更好地研究它們的特性,人們將其統(tǒng)稱為ICEs[7]。隨著基因分析技術不斷進步,R391家族和SXT家族被認定為一個家族,同時明確了SXT/R391家族目前是由40多個成員構成,核心結(jié)構包含52個保守基因和1個位于prfC基因5′端的共同染色體整合位點。它們的不同之處在于骨架結(jié)構上的4個高頻插入位點處被插入了不同種類的DNA片段,使ICEs具有特殊的功能[9]。隨后,在美國的1株無乳鏈球菌2603V/R中發(fā)現(xiàn)了和SXT/R391家族具有相似功能的ICEs(ICESa2603)[10]。在中國的高毒力SS2菌株中發(fā)現(xiàn)了89K毒力島(89K PAI),它的出現(xiàn)不僅傳播了四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs,而且還造成了毒力基因的傳播[11]。

隨著生物信息技術的快速發(fā)展,人們對ICEs的研究日益增多,為了讓人們更方便地獲得與ICEs相關的信息,Bi等創(chuàng)建了ICEs數(shù)據(jù)庫ICEberg(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)并且不斷地對其進行更新[12]。經(jīng)過ICEberg對數(shù)據(jù)信息的分析,將ICEs分為了28個家族,促進了人們對ICEs在其他領域的創(chuàng)新性研究[13]。

2 整合性接合元件的分類

由于所有革蘭氏陰性菌和大多數(shù)革蘭氏陽性菌中ICEs以線性單鏈DNA (ssDNA)的形式傳遞,傳遞過程中涉及一種松弛酶,因此以這種方式轉(zhuǎn)移的屬于接合型Ⅳ分泌系統(tǒng) (type Ⅳ secretion system,T4SS)[14]。然而,在放線菌中,一些ICEs以雙鏈DNA (dsDNA)的形式發(fā)生轉(zhuǎn)移,其過程涉及RepSA或RepAM型復制起始蛋白(Rep)和包含F(xiàn)tsK/SpoIIIE結(jié)構域的蛋白(Tra)用于易位。因此,根據(jù)整合酶分類的28個ICEs家族,又可分為T4SS型ICEs和放線菌ICEs (actinomycete ICEs,AICEs)[15]。

2.1 Ⅳ型分泌系統(tǒng)型整合性接合元件

T4SS是一種跨膜的多蛋白復合物,專門用于細菌中蛋白質(zhì)的分泌或接合DNA的轉(zhuǎn)運,從而傳播耐藥性和致病性特征[14]。T4SS蛋白家族分別是:激活組分(運動蛋白)家族、PG水解酶家族、T4SS支架/核心組分家族和表面因子/黏附素家族。這些蛋白家族在ICEs的轉(zhuǎn)移中進行分工合作,促進它在親緣關系密切的細菌中傳播ARGs和毒力因子[16]。此外,T4SS型ICEs在接合過程中涉及到的一種特殊的松弛酶是多種蛋白DNA加工復合體的關鍵元件,松弛酶在轉(zhuǎn)移起始處與DNA接合并切割DNA,形成的松弛酶-DNA核蛋白復合物通過Ⅳ型接合蛋白(type Ⅳ coupling proteins,T4CP)與T4SS接合,隨后,T4SS通過供體細胞的細胞膜將松弛酶-DNA復合物轉(zhuǎn)運到受體細胞的細胞質(zhì)中[17]。

雖然接合元件已經(jīng)研究了幾十年,但在原核生物中ICEs的數(shù)量和多樣性尚不清楚。先前的研究[18]發(fā)現(xiàn)ICEs是原核生物中最豐富的接合元件,但含有T4SS的部分細菌染色體缺乏T4SS共定位松弛酶,因此,推測出T4SS也許是用于蛋白質(zhì)運輸而不是接合。這類元素在小型基因組中占優(yōu)勢,與整合酶的關聯(lián)較少,在質(zhì)粒中也較為罕見。當然,在變形菌中,ICEs和接合質(zhì)粒對不同類型的T4SS有不同的偏好,但所有類型的T4SS都存在于染色體和質(zhì)粒中,且質(zhì)粒與ICEs之間的轉(zhuǎn)換是頻繁的。雖然接合質(zhì)粒和ICEs具有不同的基因組穩(wěn)定方式,但它們通過接合的遷移機制卻驚奇的一致,這為原核生物通過HGT從而獲得基因組接合的統(tǒng)一觀點提供了證據(jù)[9]。

2.2 放線菌整合性接合元件

AICEs[15]是在鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)的一類能夠像質(zhì)粒一樣自主復制的MGEs ,大小為9～24 kb之間,它的復制起始蛋白大多是RepSA和RepAM這兩類蛋白,也有一部分是Prim-Pol類型聚合酶。由于鏈霉菌菌屬是一類革蘭氏陽性、多細胞的絲狀土壤微生物,它以菌絲體形式生長,遺傳物質(zhì)通過菌絲轉(zhuǎn)移,因此,AICEs從供體到受體的過程是以雙鏈的形式通過菌絲間的緊密接合進行接合轉(zhuǎn)移的[19]。鏈霉菌S.coelicolorA3中多個AICEs有著不同的功能和插入位點[20];阿維鏈霉菌[21]中的兩個AICEs以串聯(lián)的形式整合在同一個tRNA-Arg位點,但二者功能獨立且完整,此現(xiàn)象說明了它們編碼的整合酶在插入到tRNA-Arg位點時具有特異性。此外,鏈霉菌中的AICEs還攜帶有一些與限制修飾系統(tǒng)相關的基因,這些基因主要位于MGEs上,它們的存在可抵抗外來DNA入侵宿主,對宿主形成一種保護作用[20]。

3 整合性接合元件在豬鏈球菌中的存在形式

到目前為止,已經(jīng)報道的豬鏈球菌中ICEs主要以單個[5]、串聯(lián)[21](ICEs-ICEs和ICEs-前噬菌體)和雜合[3](ICEs在其他ICEs中進行整合)的形式在生物界中存在并繼續(xù)發(fā)揮作用。豬鏈球菌中報道的ICEs家族主要有Tn5252、Tn1549、TnGBS2、Tn916、vanG和ICESt3和TnGBS1家族。Tn5252家族中出現(xiàn)的新的染色體整合位點(ADP核糖焦磷酸酶基因)使得部分ICEs擁有6個靶基因;Tn1549家族常與Tn5252家族以串聯(lián)的形式呈現(xiàn);其他家族的出現(xiàn)頻率較低[3]。研究表明豬鏈球菌ICESsu32457和無乳鏈球菌ICESa2603的接合產(chǎn)生了串聯(lián)ICEs,在實驗室條件下可在化膿鏈球菌菌株之間轉(zhuǎn)移,ICESa2603還可以獲得其他MGEs,產(chǎn)生“嵌合”或“復合”[22]。有趣的是,串聯(lián)ICEs攜帶的ARGs更容易被轉(zhuǎn)移到受體菌中,進而表達[23]。

4 整合性接合元件之間的相互作用

由于ICEs的存在形式多樣化,它們之間的相互作用也值得研究。通常情況下,細胞內(nèi)不會同時存在兩種同/不同類型ICEs[7]。但SXT/R391家族卻與眾不同,雖然兩種ICEs的接合基因幾乎相同,且都擁有一個入口排斥系統(tǒng)(能夠特異性抑制帶有相同類型ICEs的細胞之間發(fā)生重復的接合轉(zhuǎn)移),但是它們之間卻沒有編碼相互排斥的基因,因此,受體細胞并沒有因為已經(jīng)存在的ICEs而降低自身獲得另外一種ICEs的能力;且當細胞內(nèi)含有SXT/R391家族兩種ICEs時,它們會以串聯(lián)的形式共同轉(zhuǎn)移[7]。串聯(lián)ICEs的出現(xiàn)不會妨礙它們的移動性,反而會促使種間基因發(fā)生轉(zhuǎn)移[24]。與此同時,豬鏈球菌和其他鏈球菌中串聯(lián)MGEs轉(zhuǎn)移頻率增多,這種流行趨勢表明了串聯(lián)MGEs在細菌進化中發(fā)揮重要作用;但值得注意的是,部分MGEs或ARGs整合到ICEs中后,會造成ICEs中原有的整合酶活性降低或與ARGs相關的元素出現(xiàn)衰變從而失去流動性[24]。此外,ICEs之間或ICEs與其他的MGEs(例如噬菌體)之間的相互作用可能改變插入位點特異性或產(chǎn)生修改宿主范圍的新型ICEs[22]。

5 整合性接合元件的轉(zhuǎn)移途徑及其相關結(jié)構的作用

5.1 整合性接合元件的轉(zhuǎn)移途徑

ICEs是在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)的一組不同的移動元件,它能整合到細菌染色體上,具有編碼功能齊全的接合機制,可在細菌細胞之間傳播。ICEs又是基因島的一員,因此,豬鏈球菌中ICEs從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌的步驟為切離、裂缺、解旋、識別和整合[6]。

豬鏈球菌中部分ICEs能夠以反式或順式方式移動其他遺傳元件,例如染色體攜帶的整合可移動元件(integrative mobilizable elements,IMEs)[24]和順式可移動元件(cis-movable element,CIME)[25]。IMEs是編碼自身切除和整合的基因組島,但缺乏用于自主接合轉(zhuǎn)移的完整接合裝置,而CIME丟失了整合和轉(zhuǎn)移基因,但保留了完整的attL和attR重組位點。這些元素雖然沒有接合裝置,但是經(jīng)常充當ICEs和其他接合元件的便車。在嗜熱鏈球菌中,CIMEL3catR3可以通過ICESt3的整合被ICESt3以順式方式調(diào)動,隨后作為一個復合元件切除和轉(zhuǎn)移。IMEs和CIME因在鏈球菌中呈現(xiàn)出多樣性被認為是比ICEs更能廣泛傳播毒力因子基因和獲得性ARGs的重要載體[25]。

5.2 整合性接合元件相關結(jié)構在轉(zhuǎn)移途徑中的作用

ICEs通常由一個主干(整合與剪切模塊、接合對形成模塊、DNA移動和加工模塊和調(diào)節(jié)模塊)組成,附屬基因(編碼毒力因子和獲得性ARGs等)被插入其中,可以賦予宿主選擇性優(yōu)勢,使ICEs成為細菌適應和進化的重要驅(qū)動力[6]。除此之外,它還擁有位于核心區(qū)間的插入熱點區(qū)(hot spots,HS)和可變區(qū)(variable region,VR),位于HS和VR的特性基因使得ICEs具有獨特的功能[26]。研究證實rplL和rumA基因位點是鏈球菌和其他革蘭氏陽性菌中的兩個跨物種保守插入熱點[22]。

豬鏈球菌ICEs中的整合酶(Int)基因和切離酶(Xis)基因是其整合與剪切模塊的重要組成部分,Xis負責將ICEs從宿主細胞的染色體中切離,Int用于將切離的環(huán)狀DNA整合到受體菌中[27],且Int和Xis的兩端一般為attL和attR的反向重復序列。負責ICEs重組的Int通常局限于酪氨酸、絲氨酸或DDE家族。此外,豬鏈球菌中ICEs與T4SS存在大量相似的基因,因此T4SS在ICEs的接合對形成模塊中起著很大的作用[26]。ICEs在發(fā)生接合轉(zhuǎn)移前其DNA移動和加工模塊可對ICEs的DNA進行加工處理,整個過程類似于質(zhì)粒DNA的加工,即環(huán)狀DNA與釋放酶共價接合后,在轉(zhuǎn)移起始位點(origin of transfer,oriT)處生成開環(huán)缺口,隨后在oriT處合成單鏈DNA,借助接合轉(zhuǎn)移蛋白G,穿過接合孔道,最終抵達宿主菌體內(nèi)[8]。

ICEs的轉(zhuǎn)移受多種因素的影響,這些因素對它的轉(zhuǎn)移既有促進作用又有抑制作用。SXT/R391家族的主要調(diào)節(jié)因子為setR,它可以抑制setC和setD產(chǎn)生用于編碼SXT轉(zhuǎn)錄的蛋白[7];ICESa2603家族擁有3個具有促進作用的特征基因,即ICESa2603rplL的Int基因(整合在無乳鏈球菌2603 V/R的rplL基因)、ICESa2603 tRNA Lys的2個Int基因(整合在無乳鏈球菌2603 V/R的tRNA賴氨酸基因和Tn916的松弛酶基因)。銅綠假單胞菌中的ICEPapi-1可以通過專門的GI-T4SS方式發(fā)生水平轉(zhuǎn)移,且ICEPapi-1編碼的調(diào)節(jié)劑TprA在轉(zhuǎn)移過程中起誘導作用。此外,由于某些細胞會受到營養(yǎng)、細胞信號傳導限制或兩者兼有者,其體內(nèi)部分ICEs具有生長階段依賴性切除的特征[28]。

6 整合性接合元件與細菌耐藥性及致病性

細菌通過HGT獲得遺傳信息,HGT是在不同細菌種/屬之間交換ARGs的重要方式,因此它們能夠迅速適應多變的生態(tài)環(huán)境,并導致菌株之間的基因序列有很大差異[5]。豬鏈球菌ICEs除了參與其移動、調(diào)節(jié)或維持相關的基因外,還含有多種ARGs;ICEs與其他MGEs的交換能力促使它成為ARGs儲存庫[23]。此外,ICEs增強了生物體定殖真核宿主、固定氮、促進生物膜形成和插入毒力基因的能力[29]。隨著研究的深入,豬鏈球菌中ICEs可在相同/不同種屬間發(fā)生轉(zhuǎn)移,且能夠在受體細菌中復制和表達相同的功能,賦予細菌獨特的生長優(yōu)勢,給臨床預防和治療造成困難[5,30-32]。

近些年,世界上關于感染耐多種抗菌藥物鏈球菌的事件逐漸增多,部分國家具有季節(jié)性和聚集性[33]。豬鏈球菌感染事件于1987年在曼谷被首次報道,隨后世界各地均出現(xiàn)零星病例[33]。人類感染豬鏈球菌主要是表現(xiàn)為腦膜炎或鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)[34],與之前流行的STSS為特征的ST1毒株相比,流行性ST7菌株中的89K毒力島被認為是造成菌株毒力增加的原因。值得注意的是,易感人員大多從事相關職業(yè),且發(fā)病率大多與種族起源、部落、文化和生活方式有關。

7 小結(jié)

目前報道的豬鏈球菌中ICEs形式多樣化,可攜帶單個/多個ARGs和毒力基因等元素通過接合/自然轉(zhuǎn)化的方式從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中,賦予細菌更多的生長優(yōu)勢,造成耐藥機制復雜多樣,給臨床預防和治療造成了很大程度的困難。本文通過對豬鏈球菌中ICEs進行綜述,闡述了其發(fā)現(xiàn)、分類、存在形式和相互作用、轉(zhuǎn)移途徑和相關結(jié)構作用及與細菌耐藥性和致病性等方面的研究進展,為防范豬鏈球菌病提供一定的思路,也為新藥物和疫苗的研發(fā)提供參考。