屈瀟瀟,哈靈俠,杜玉冬,王金娟

近年來(lái),玻璃化冷凍胚胎移植(FET)技術(shù)在輔助生殖過(guò)程中的應(yīng)用越來(lái)越普遍。221家生殖中心的ART數(shù)據(jù)顯示,2019年常規(guī)IVF周期全胚冷凍率可達(dá)50.68%,ICSI周期全胚冷凍率可達(dá)54.09%[1]。然而迄今為止,關(guān)于胚胎冷凍時(shí)間是否影響凍胚復(fù)蘇結(jié)局及凍胚移植妊娠結(jié)局仍存在較大爭(zhēng)議。有研究表明,隨著冷凍胚胎保存時(shí)間的延長(zhǎng),胚胎復(fù)蘇率顯著下降[2]。且玻璃冷凍胚胎儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)降低生化妊娠率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[3]。然而也有研究表明玻璃化胚胎的冷凍保存時(shí)間并不會(huì)影響臨床妊娠結(jié)局[4]。由此可見(jiàn),對(duì)不同玻璃化冷凍胚胎的移植時(shí)限仍有待進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2020年9月至2022年9月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受FET的550例患者的資料。根據(jù)胚胎的不同玻璃化冷凍時(shí)間分為5組,A組239例,玻璃化冷凍時(shí)間≤3個(gè)月;B組138例,3個(gè)月<玻璃化冷凍時(shí)間≤6個(gè)月; C組74例,6個(gè)月<玻璃化冷凍時(shí)間≤1年; D組75例,1年<玻璃化冷凍時(shí)間≤5年;E組24例,玻璃化冷凍時(shí)間>5年。并對(duì)所有資料的一般情況、復(fù)蘇結(jié)局及妊娠結(jié)局等進(jìn)行記錄分析。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 選取年齡在20～45歲,接受胚胎冷凍并進(jìn)行凍胚復(fù)蘇移植的患者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①夫妻一方或雙方染色體異常的患者;②患有子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥等內(nèi)膜病變的患者;③孕前患有嚴(yán)重生殖器官畸形及腫瘤的患者;④合并有嚴(yán)重內(nèi)外科疾病的患者;⑤有不良孕產(chǎn)史的患者。

1.2 胚胎玻璃化冷凍及復(fù)蘇方法

1.2.1 玻璃化冷凍過(guò)程 冷凍液分為ES和VS,室溫下胚胎先放入 ES冷凍培養(yǎng)基,胚胎皺縮后膨脹,待恢復(fù)至最飽滿(mǎn)時(shí)迅速轉(zhuǎn)移至VS培養(yǎng)基中。在1 min內(nèi)迅速把胚胎取出放在冷凍載桿上,并放入液氮中冷卻。

1.2.2 玻璃化復(fù)蘇過(guò)程 解凍液分為 TS、DS、WS-1、WS-2。迅速把載桿從液氮中去除,放入TS解凍培養(yǎng)基,待細(xì)胞完全皺縮后,依次將胚胎轉(zhuǎn)移至DS(3 min) 、WS-1(5 min) 、WS-2(5 min)中,待胚胎形態(tài)完全恢復(fù),然后將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中等待移植。

1.3 患者子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備 本中心以自然周期及激素替代周期兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為主。自然周期是有規(guī)律月經(jīng)周期的患者在月經(jīng)第11～12 d進(jìn)行B超監(jiān)測(cè),評(píng)估卵泡和內(nèi)膜發(fā)育情況,于排卵日(自然排卵/HCG扳機(jī)后)給予黃體酮(30 mg,每天2次)支持,3～5 d后行胚胎移植。激素代替周期一般是在月經(jīng)周期或采用藥物行撤退性出血的第2～3 d 起開(kāi)始口服戊酸雌二醇(4 mg,每天1次),根據(jù)B超監(jiān)測(cè)患者子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況調(diào)整劑量,當(dāng)口服戊酸雌二醇11～12 d、子宮內(nèi)膜厚度≥7.0 mm時(shí),開(kāi)始加黃體酮(30 mg,每天2次)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜,3～5 d 后解凍胚胎行FET。

1.4 胚胎質(zhì)量的評(píng)估 根據(jù)Puissant[5]的胚胎等級(jí)標(biāo)準(zhǔn),解凍后胚胎卵裂球數(shù)≥50%冷凍前卵裂球數(shù)量為存活胚胎;卵裂期胚胎有6～10個(gè)細(xì)胞2級(jí)及以上的為優(yōu)質(zhì)胚胎;囊胚分期在4期或以上,外滋養(yǎng)層及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)為B級(jí)或A級(jí)囊胚。

1.5 各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算公式 胚胎存活率=解凍后存活胚胎/解凍胚胎數(shù)×100%;胚胎完好率=解凍后完好胚胎數(shù)/解凍胚胎數(shù)×100%;解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率=解凍后優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)×100%;種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同玻璃化冷凍時(shí)間的凍胚移植周期一般情況比較 與胚胎冷凍時(shí)間較短的A組相比較,胚胎冷凍時(shí)間較長(zhǎng)的D組、E組AMH顯著增高(P<0.05)。其余各項(xiàng)指標(biāo),各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

2.2 不同玻璃化冷凍時(shí)間胚胎移植的復(fù)蘇結(jié)局比較 與A、B、C組比較,胚胎冷凍時(shí)間較長(zhǎng)的D組胚胎存活率及胚胎完好率顯著降低(P<0.05);與A、B組比較,胚胎冷凍時(shí)間較長(zhǎng)的E組胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(P<0.05);E組較C組胚胎完好率顯著降低(P<0.05);E組較D組解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)胚胎的妊娠結(jié)局比較 在保證至少移植一枚優(yōu)質(zhì)胚胎的情況下,各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率及早產(chǎn)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)表3。

2.4 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的妊娠結(jié)局比較 在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎時(shí),各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相較于胚胎冷凍時(shí)間較短的B組,胚胎冷凍時(shí)間較長(zhǎng)的E組早產(chǎn)率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表4。

表1 不同玻璃化冷凍時(shí)間的凍胚移植周期一般情況比較

表2 不同玻璃化冷凍時(shí)間胚胎移植的復(fù)蘇結(jié)局比較(%)

表3 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)胚胎的妊娠結(jié)局比較(%)

表4 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的妊娠結(jié)局比較(%)

2.5 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局比較 在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí),各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相較于胚胎冷凍時(shí)間較短的A組,胚胎冷凍時(shí)間較長(zhǎng)的C組早產(chǎn)率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 不同玻璃化冷凍時(shí)間移植優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局比較(%)

3 討論

在新鮮胚胎移植周期中,胚胎分裂過(guò)快或過(guò)慢都因不能與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育而無(wú)法作為胚胎移植的首選[6]。而冷凍胚胎移植為鮮胚移植失敗或卵巢過(guò)度刺激取消移植的人群提供了再次胚胎移植并獲得臨床妊娠的機(jī)會(huì),且進(jìn)行凍胚移植的患者患卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險(xiǎn)更低[7]。因此,近年來(lái),胚胎冷凍時(shí)間對(duì)復(fù)蘇結(jié)局及臨床妊娠結(jié)局的影響也更加受到關(guān)注。

本研究結(jié)果提示,較長(zhǎng)的玻璃化冷凍時(shí)間會(huì)對(duì)胚胎復(fù)蘇結(jié)局產(chǎn)生不利影響。隨著玻璃化冷凍時(shí)間的延長(zhǎng),復(fù)蘇后的胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著降低。有文獻(xiàn)指出,長(zhǎng)期在液氮中保存會(huì)降低胚胎存活率[8]。較長(zhǎng)凍存時(shí)間組胚胎解凍后的胚胎復(fù)蘇率顯著降低(P<0.05),且1～6個(gè)月組胚胎復(fù)蘇率最高(P<0.05)[2]。胚胎冷凍超過(guò)6年的復(fù)蘇率低于冷凍3～5年的胚胎(P<0.05)[9]。其原因是胚胎冷凍保存可能會(huì)影響基因的穩(wěn)定性,造成胚胎DNA碎片的增加、線(xiàn)粒體DNA的突變等[10]。在冷凍保存過(guò)程中,高滲應(yīng)激可能導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂頻率增加或抑制DNA修復(fù),從而導(dǎo)致染色體畸變[11]。在真核生物中,DNA與組蛋白和非組蛋白染色體蛋白連接形成染色質(zhì)以確保DNA穩(wěn)定性,而低溫會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而影響DNA的穩(wěn)定性。除了核基因組外,細(xì)胞還擁有線(xiàn)粒體DNA。冷凍保存會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)的過(guò)度產(chǎn)生[12-13],最終損傷線(xiàn)粒體DNA。除此之外,玻璃化冷凍誘導(dǎo)的應(yīng)激,包括滲透性休克、溫度和pH值的變化以及冷凍保護(hù)劑的毒性,也可能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞和胚胎的表觀(guān)遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化[14]。以上因素可能是導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間冷凍胚胎的復(fù)蘇結(jié)局較短時(shí)間冷凍胚胎差的原因。另有研究表明,不同卵裂期胚胎復(fù)蘇率、胚胎解凍完整存活率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[15]。與本研究結(jié)果不同的原因可能在于分組及納入研究的胚胎形態(tài)不同。

本研究提示,在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)凍胚后,各組間胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究顯示,玻璃化冷凍卵裂期胚胎的時(shí)間對(duì)復(fù)蘇及妊娠結(jié)局沒(méi)有顯著影響[16-17]。凍囊胚的胚胎存活率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率[18]及新生兒結(jié)局[19]差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wan[20]等人也認(rèn)為:胚胎冷凍時(shí)間小于60天和大于60天2組的活產(chǎn)率、生化妊娠率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率和新生兒畸形率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果與本研究結(jié)果一致。但其同時(shí)表明不同玻璃化冷凍時(shí)間對(duì)單胎早產(chǎn)率沒(méi)有影響,該結(jié)果與本研究不一致,其原因可能是對(duì)不同玻璃化冷凍時(shí)間分組不一致且納入樣本量較少有關(guān),仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,相較于短期冷凍胚胎,較長(zhǎng)的胚胎冷凍時(shí)間對(duì)凍胚復(fù)蘇結(jié)局有不利影響。然而在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)胚胎后,凍胚移植的臨床妊娠結(jié)局并無(wú)顯著性差異,但長(zhǎng)期冷凍保存的胚胎對(duì)后期子代安全性的影響尚未明確。這意味著對(duì)凍胚移植來(lái)說(shuō),臨床醫(yī)生擁有了更加自由靈活的移植時(shí)限。