何 蕊,高變變,裴利國(guó),3,黃 蕾,許曉雪,趙君利,劉春蓮,3

濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征(WAS)是一種罕見(jiàn)的X連鎖隱性遺傳病,女性攜帶基因,男性發(fā)病[1]。以濕疹、血小板減少和免疫缺陷為臨床表現(xiàn)[2],易患自身免疫病和惡性腫瘤,人群中發(fā)病率約為1/10萬(wàn)至1/100萬(wàn),多于六個(gè)月以?xún)?nèi)的嬰兒期起病,目前研究認(rèn)為,該疾病是由在造血細(xì)胞中表達(dá)的WAS基因變異引起的[3]。WAS位于Xp11.22-p11.23,編碼一種WAS蛋白(WASp),WASp表達(dá)變化將影響淋巴細(xì)胞、血小板內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架組合,從而影響血小板生成、聚集和淋巴細(xì)胞遷移等功能[4]。本研究篩選并驗(yàn)證該WAS家系的致病基因位點(diǎn),為疾病臨床診斷、遺傳咨詢(xún)及PGT治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年2月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心遺傳門(mén)診的一例WAS家系,見(jiàn)圖1(封二)。咨詢(xún)者(Ⅱ2)曾生育2個(gè)男孩,均在1歲左右不幸夭折,以反復(fù)面色蒼白、皮膚黏膜出血為主要臨床表現(xiàn),多次血常規(guī)提示貧血、血小板減少,額部可見(jiàn)散在濕疹,臨床確診WAS綜合征,無(wú)近親結(jié)婚。咨詢(xún)者哥哥(Ⅱ4)在四歲因流鼻血去世,其弟弟、妹妹均正常,咨詢(xún)者父母表型均正常。

1.2 方法

1.2.1 外周血RNA提取及cDNA擴(kuò)增 采集外周靜脈血3～5mL,2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝,采用血液/組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒,提取咨詢(xún)者及其父母三人樣本RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 全外顯子測(cè)序 采用靶向捕獲技術(shù)+高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)人類(lèi)基因組中約2萬(wàn)個(gè)基因的外顯子區(qū)域以及上下游20bp信息(本檢測(cè)由貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及RT-PCR 根據(jù)全外顯子測(cè)序 結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)變異位點(diǎn),位于該轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子10號(hào)上,屬于非經(jīng)典剪切變異,可能造成11號(hào)外顯子跳躍性剪接異常,或形成內(nèi)含子10號(hào)插入的異常轉(zhuǎn)錄本,見(jiàn)圖2(封二)。通過(guò)RT-PCR、電泳和Sanger測(cè)序驗(yàn)證該剪切位點(diǎn)變異是否導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本剪接異常。上下游引物分別位于10號(hào)外顯子和12號(hào)外顯子,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度568bp。

1.2.3.1 Exon10F GCCATCTCGAGGAGGGAACC。

1.2.3.2 Exon12R TAACTCAGCCACTCAGTCATCC。

1.2.3.3 對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 觀察電泳條帶,理論上變異樣本RT-PCR產(chǎn)物產(chǎn)生2條電泳條帶,分別為568bp及453bp。用正常樣本作為對(duì)照,得到1條電泳條帶,為568bp。

1.2.4 家系變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序 對(duì)RT-PCR產(chǎn)物切膠回收,利用ABI 3730一代測(cè)序儀對(duì)產(chǎn)物分別進(jìn)行Sanger測(cè)序,并分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子測(cè)序結(jié)果 WAS在轉(zhuǎn)錄本NM_000377.2中包含12個(gè)外顯子,編碼502個(gè)氨基酸,檢測(cè)出WAS c.1339-12T>A雜合變異,位于X染色體的內(nèi)含子10,該變異在ClinVar數(shù)據(jù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中暫無(wú)記錄,見(jiàn)表1。

表1 WAS c.1339-12T>A變異基本情況一覽表

2.2 瓊脂糖凝膠電泳圖 對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,驗(yàn)證樣本和對(duì)照樣本均只有1條電泳條帶,見(jiàn)圖3(目次后)。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果 家系中咨詢(xún)者和其母親均檢測(cè)出WAS基因c.1339-12T>A雜合變異,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),Ⅱ2母親樣本(Ⅰ2)c.133912T>A的變異導(dǎo)致了內(nèi)含子10號(hào)的10個(gè)堿基(CCTGCTGCAG)的保留。Ⅱ2的一條鏈也出現(xiàn)了10個(gè)堿基(CCTGCTGCAG)的保留,推測(cè)其遺傳自母親,見(jiàn)圖4(目次后)。

2.4 NGS測(cè)序驗(yàn)證異常轉(zhuǎn)錄本情況 正常轉(zhuǎn)錄本和異常轉(zhuǎn)錄本reads,見(jiàn)表2。NM_000377.2:c.133912T>A的變異會(huì)導(dǎo)致10bp的內(nèi)含子,產(chǎn)生異常轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄水平NGS結(jié)果和Sanger測(cè)序結(jié)果一致。

表2 正常轉(zhuǎn)錄本和異常轉(zhuǎn)錄本reads統(tǒng)計(jì)

2.5 WAS基因表達(dá)水平分析 熒光定量檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常女性對(duì)照相比,待測(cè)樣本的WAS基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相對(duì)表達(dá)量均值分別為0.87、0.65及0.93。咨詢(xún)者與其母親的WAS基因整體表達(dá)水平正常,該結(jié)果提示異常轉(zhuǎn)錄本低水平可能不是樣本mRNA降解所致。

3 討論

WAS基因位于Xp11.22-p11.23,其編碼一種含502個(gè)氨基酸的WAS蛋白(WASp)。WASp是細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,主要表達(dá)在造血細(xì)胞中,可調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及血小板等的功能[4]。WAS基因變異導(dǎo)致WASp表達(dá)減低甚至缺失是WAS的主要發(fā)病機(jī)制,且臨床表現(xiàn)隨年齡的增加而加重。本研究中2例患兒均于1歲左右發(fā)病,Jiang等人通過(guò)對(duì)中國(guó)5個(gè)散發(fā)WAS家系分析,患兒發(fā)病年齡在1天至17個(gè)月,這與其他文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)病年齡多在6個(gè)月內(nèi)相一致[5]。

WAS基因變異類(lèi)型不同會(huì)導(dǎo)致WASp結(jié)構(gòu)域發(fā)生不同的構(gòu)象改變[6],造成不同的臨床表現(xiàn),因此WAS基因變異類(lèi)型與WASp表達(dá)情況與臨床表現(xiàn)關(guān)系密切[7]。目前,國(guó)內(nèi)外已報(bào)道400多種WAS基因變異,其中位于168C >T(T45M)、290C >N/291G >N(R86C/H/L)、IVS6+5G >A者,WASp表達(dá)減低,臨床癥狀相對(duì)輕微,多表現(xiàn)為X-連鎖血小板減少癥;當(dāng)變異位于665C >T(R211X)、IVS8+1G >N及IVS8+1-+6del GTGA時(shí),臨床癥狀較重,表現(xiàn)為典型WAS[8-9],出現(xiàn)血小板減少三聯(lián)征、反復(fù)感染和濕疹,常伴有免疫疾病和惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。有研究顯示,WAS基因變異最常見(jiàn)的是錯(cuò)義突變,其次是剪接突變、缺失和無(wú)義突變。錯(cuò)義突變主要位于外顯子1-4,其余變異位于外顯子7-11[10]。本研究中受檢者和其母親此次檢測(cè)出WAS基因c.1339-12T>A雜合變異,位于內(nèi)含子10,該變異屬于非經(jīng)典剪切變異,可能造成11號(hào)外顯子跳躍性剪接異常,或形成內(nèi)含子10插入的異常轉(zhuǎn)錄本,造成移碼變異,且編碼的蛋白形成多3個(gè)氨基酸的產(chǎn)物,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常,正常WASp表達(dá)減低,目前尚無(wú)該變異的相關(guān)報(bào)道。

由于WAS基因c.1339-12T>A經(jīng)評(píng)估為臨床意義未明變異,患兒的母親及外婆均為WAS c.1339-12T>A攜帶者,并且都沒(méi)有臨床表現(xiàn),由于X染色體非隨機(jī)失活,攜帶者的WASp表達(dá)一般不受影響。Jiang等人發(fā)現(xiàn)4例患者的母親是攜帶者,其中一位為部分WASp表達(dá)[5]。結(jié)合2例幼兒相似的發(fā)病情況和臨床表現(xiàn),本研究進(jìn)行定量PCR檢測(cè)WAS的表達(dá)水平,Ⅱ2的異常轉(zhuǎn)錄本變異占比約10.64%,其母親為4.56%,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)定量排除了樣本降解導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄水平低的可能性。轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到的異常轉(zhuǎn)錄本其比例較低,可能是女性X染色體存在失活現(xiàn)象,如果發(fā)生非隨機(jī)性失活,可能導(dǎo)致變異所在的染色體失活。目前有多個(gè)研究中報(bào)道攜帶WAS基因變異的家系中,有部分女性攜帶者因?yàn)樽儺愃赬染色體失活產(chǎn)生WAS表型,而同一個(gè)家系中女性表現(xiàn)出不同比例的X染色體失活[11-12]。本研究中Ⅱ2及其母親的異常轉(zhuǎn)錄本變異占比較低,這可能是她們沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀的原因,結(jié)合其曾生育2男孩均臨床確診WAS綜合征,提升證據(jù)該變異位點(diǎn)為有害變異。考慮到咨詢(xún)者目前尚無(wú)健康后代,建議其行PGT技術(shù)進(jìn)行輔助生育助孕。