薛鑫 綜述，張英英，王漢杰 審校

1.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072；2.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇 徐州 221004

近年，基于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironments，TMEs）已設(shè)計(jì)出大量細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤診療劑，為腫瘤的診療提供了安全有效的手段。由于TMEs 壞死的腫瘤核心富營養(yǎng)化、實(shí)體腫瘤缺氧微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞外pH 較低等原因，許多兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?，如鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、新生梭菌（Clostridium novyi）及雙歧桿菌（Bifidobacterium）等，均具有顯著的腫瘤靶向和殺傷能力［1-7］。因此，該類細(xì)菌可作為一種新型遞送載體，通過運(yùn)輸細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性藥物、前藥轉(zhuǎn)化酶、治療肽／蛋白質(zhì)或siRNA、多模態(tài)成像劑等進(jìn)行腫瘤靶向診療［8］。合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，有效提高了工程菌構(gòu)建的安全性、靶向性和可控性［9-11］。

合成生物學(xué)技術(shù)與納米技術(shù)的有效結(jié)合大幅擴(kuò)展了后者的應(yīng)用范疇。納米技術(shù)可滿足腫瘤診療和預(yù)防等多樣化的要求，在藥物遞送過程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，如可增加難溶藥物的溶解度、促進(jìn)藥物的溶酶體逃逸、避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬清除并可控制藥物的時(shí)空釋放等［12］。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，其與工程菌的有機(jī)結(jié)合可有效促進(jìn)治療藥物、成像分子的高效輸送，更好地抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如用于動(dòng)物腫瘤診療的結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌是在細(xì)菌表面附著納米顆粒，通過尾靜脈注射后到達(dá)TMEs，對腫瘤進(jìn)行有效診療。本文就近年結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌用于腫瘤診療的研究進(jìn)展及其面臨的挑戰(zhàn)和可能的解決方案作一綜述，以期為推動(dòng)腫瘤診療研究的快速發(fā)展提供參考。

1 結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌在腫瘤診療中的應(yīng)用

根據(jù)細(xì)菌與納米技術(shù)的結(jié)合方式，可將其分為3類：細(xì)菌表面納米工程、細(xì)菌內(nèi)納米工程及基于細(xì)菌的仿生納米顆粒。

1.1 細(xì)菌表面納米工程 細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性及其對外部信號的響應(yīng)能力可用于設(shè)計(jì)構(gòu)建細(xì)菌微／納米機(jī)器人［13］，其具有較高的載藥率、良好的生物相容性、可降解性和臨床轉(zhuǎn)化潛力。細(xì)菌表面也可作為納米藥物的遞送平臺，實(shí)現(xiàn)納米藥物進(jìn)入腫瘤組織、TMEs積累及定點(diǎn)釋放等。細(xì)菌微／納米機(jī)器人能夠在體內(nèi)外接收外界或內(nèi)部信號，如光、熱、磁、超聲波與細(xì)菌群感信號等［14-16］，實(shí)現(xiàn)腫瘤診療的智能與可控。

1.1.1 可視化遞送 ZHANG 等［17］將表達(dá)抗人表皮生長因子受體2（anti-human epidermal growth factor receptor 2，anti-HER2）的細(xì)菌與磁性納米粒子結(jié)合，通過磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）觀察該系統(tǒng)靶向過表達(dá)HER2 腫瘤的過程。XING 等［14］將負(fù)載吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）的納米顆粒共價(jià)吸附在趨磁細(xì)菌AMB-1 表面，構(gòu)建具有光激活和磁操縱雙重特性的微型細(xì)菌機(jī)器人。在磁場操縱下，微型細(xì)菌機(jī)器人顯示出一致的遷移軌跡，在腫瘤部位呈現(xiàn)增強(qiáng)的熒光信號，為細(xì)菌微／納米機(jī)器人可視化靶向遞送提供了方法。HARIMOTO 等［18］利用合成生物學(xué)技術(shù)開發(fā)了一種基因編碼的微生物封裝系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)其表面的莢膜多糖表達(dá)，為細(xì)菌穿上一層“隱身衣”，協(xié)助細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)，提高治療性細(xì)菌遞送效率，再通過熒光成像（fluorescence imaging，F(xiàn)I）手段實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤可視化的過程。

1.1.2 高效腫瘤治療

1.1.2.1 化學(xué)治療 化學(xué)治療是一種傳統(tǒng)的治療方式，但其藥物毒副作用給患者帶來了沉重的身體負(fù)擔(dān)。EKTATE 等［15］將負(fù)載阿霉素（doxorubicin，DOX)的低溫敏感脂質(zhì)體附著在減毒沙門菌（Salmonella）表面，用于結(jié)腸癌的化療，當(dāng)藥物遞送至腫瘤部位時(shí)，利用高強(qiáng)度聚焦超聲和40～42 ℃的熱療釋放DOX。SONG等［19］將負(fù)載DOX 和索拉非尼（sorafenib，SOR）的脫氧膽酸（deoxycholic acid，DA）修飾在凝結(jié)芽孢桿菌的孢子（Bacillus coagulanspores）表面，納米載體可有效保護(hù)藥物通過胃部，在腸道部位，孢子-DA制劑可穿透腸上皮細(xì)胞，增加基底側(cè)藥物釋放，表面崩解的疏水蛋白涂層和親水性DA 自組裝形成納米載體，用于結(jié)腸癌治療。

1.1.2.2 光熱治療 厭氧菌與功能性納米載體結(jié)合可有效改善缺氧腫瘤的治療效果。LUO 等［20］設(shè)計(jì)了兩種策略，一是將短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）與納米顆粒結(jié)合，靶向輸送至腫瘤中；二是先注射梭狀芽胞桿菌孢子（Clostridiumspores），再注射梭狀芽孢桿菌單克隆抗體修飾的納米顆粒，與梭狀芽胞桿菌孢子進(jìn)行靶向結(jié)合，納米顆粒由上轉(zhuǎn)換納米棒（upconversion nanorods，UCNRs）和金納米棒（aunanorods，AuNRs）組成，可用于腫瘤的CT 成像和光熱消融，結(jié)果表明，以抗體為導(dǎo)向的第二種策略可提供更強(qiáng)的成像效果和更長的滯留期，有效消除腫瘤。WANG等［21］將大腸埃希菌MG1655設(shè)計(jì)為一種熱響應(yīng)細(xì)菌，生物礦化的AuNPs 在激光照射下產(chǎn)熱，用于光熱治療的同時(shí)誘導(dǎo)溶細(xì)胞素A 表達(dá)，該系統(tǒng)具有良好的腫瘤消融能力。

1.1.2.3 光動(dòng)力治療 WU等［22］將AIE納米顆粒（AIE photosensitizer nanoparticles，TDNP）、聚乙基亞胺（polyethylenimine，PEI）與E.coli構(gòu)成生物混合系統(tǒng)TDNP，該系統(tǒng)在光照條件下不僅可增加E.coli中蛋白質(zhì)的釋放，還可產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），殺死腫瘤細(xì)胞。DENG 等［16］在工程E.coli的表面修飾光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6），利用Ce6 介導(dǎo)的熒光成像實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向診斷，E.coli在腫瘤部位表達(dá)H2O2酶，催化H2O2生成O2，緩解了TMEs 缺氧問題，從而提高了光動(dòng)力治療效果。

1.1.2.4 化學(xué)動(dòng)力治療 ZHANG 等［23］報(bào)道，金和鉑復(fù)合物修飾的E.coli（Bac-Au@Pt）在酸性條件下可催化釋放ROS。體內(nèi)成像結(jié)果表明，該納米酶系統(tǒng)大量聚集在腫瘤區(qū)域，還可刺激T細(xì)胞釋放IFNγ，特異性降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗氧化性。

1.1.2.5 基因治療 HU 等［24］在工程細(xì)菌表面修飾陽離子聚合物負(fù)載質(zhì)粒DNA 納米顆粒，促進(jìn)質(zhì)粒DNA 從吞噬小體中逃逸，從而有效遞送編碼血管內(nèi)皮生長因子受體2的DNA 疫苗，用于腫瘤免疫治療，小鼠正電子發(fā)射斷層成像（positronemission tomography，PET）技術(shù)檢測結(jié)果顯示，腫瘤體積明顯減小，表明工程細(xì)菌表面的陽離子聚合物具有良好的質(zhì)子酸緩沖作用，提高了細(xì)菌在胃部的耐酸能力。

1.1.2.6 免疫治療 NACIUTE 等［25］將含腫瘤抗原和佐劑的脂質(zhì)體附著在E.coli表面，顯著提高了小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞表面CD80、CD40 和CD86 蛋白的表達(dá)。WEI 等［26］將免疫佐劑雷西莫特（Resiquimod，R848）負(fù)載在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylacticco-glycolic acid，PLGA）中制備PLGA-R848，通過靜電作用連接至MG1655表面，Toll樣受體7／8激動(dòng)劑R848 和E.coli可顯著促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化為M1 巨噬細(xì)胞。

1.1.2.7 聯(lián)合治療 LIU 等［27］將載有ICG 的人血清白蛋白納米顆粒（HSA／ICG）通過酰胺鍵附著在Synechococcus7942表面，Synechococcus7942在660 nm激光照射下產(chǎn)生O2，可顯著改善腫瘤缺氧，促進(jìn)產(chǎn)生更多的ROS，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，并可促進(jìn)產(chǎn)生IL-10 和IFNγ，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境。CHEN等［7］在SalmonellaVNP20009表面修飾聚多巴胺納米顆粒，在腫瘤部位用近紅外激光照射，并聯(lián)合局部注射負(fù)載抗程序性細(xì)胞死亡-1 肽AUNP-12 凝膠，可在晚期黑色素瘤小鼠模型中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤效果。WANG 等［28］在表達(dá)黑色素的工程E.coli表面附著抗程序性死亡蛋白1抗體（anti-programmed death-1 antibodies，αPD-1）的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在NIR光照下，黑色素可產(chǎn)生溫和而均勻的熱，與局部抑制劑結(jié)合，從而發(fā)揮雙重免疫激活效應(yīng)。

1.1.2.8 細(xì)菌代謝物治療 CHEN 等［29］利用希瓦菌（S.oneidensis，SO）將電子轉(zhuǎn)移至金屬礦物質(zhì)的能力，在SO表面修飾二氧化錳（MnO2）納米花，構(gòu)建乳酸燃料生物雜交體。通過細(xì)菌的缺氧趨化作用，將MnO2納米花遞送至腫瘤中，與腫瘤代謝物乳酸分別作為電子受體和電子供體，促進(jìn)乳酸在腫瘤細(xì)胞間隙的持續(xù)分解代謝，減少腫瘤外乳酸含量，限制了腫瘤利用乳酸抑制產(chǎn)生IFNγ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視。WANG 等［30］將裝載DOX 的MOF納米顆粒及透明質(zhì)酸與SO 結(jié)合，構(gòu)建了一種自驅(qū)動(dòng)生物反應(yīng)器，通過SO 介導(dǎo)的腫瘤內(nèi)乳酸消耗、電子從SO 轉(zhuǎn)移至MDH、Fe3+還原誘導(dǎo)MDH 分解、藥物控制釋放和H2O2介導(dǎo)的Fe2+至Fe3+再轉(zhuǎn)化的系列過程，實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性殺傷。

功能細(xì)菌不僅能分解腫瘤生長所需原料，如乳酸、氨基酸來抑制腫瘤生長［30-31］，也能利用代謝物（如NO3-）制備大量抗腫瘤藥物。ZHENG等［32］將氮化碳（C3N4）整合至E.coli表面，C3N4在光照射下生成的電子轉(zhuǎn)移至表達(dá)硝酸鹽或亞硝酸鹽還原酶的E.coli中，促進(jìn)內(nèi)源性NO3-代謝為細(xì)胞毒性NO，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)菌表面納米工程有效改善了靶向性、安全性和有效性，但也存在一些不足，如納米材料完全包裹細(xì)菌外膜時(shí)，細(xì)菌趨化能力會受到影響，靶向腫瘤能力被削弱；納米材料與細(xì)菌之間需要更強(qiáng)的結(jié)合方式，如酰胺鍵，可有效防止納米材料的提前脫落［33］；另外，細(xì)菌不會立即被清除，可能在器官中積累，誘發(fā)慢性炎性反應(yīng)或其他有害影響［34］。

1.2 細(xì)菌內(nèi)納米工程 細(xì)菌內(nèi)納米工程包括合成金屬納米顆粒和蛋白質(zhì)納米顆粒。許多金屬納米顆粒是通過化學(xué)合成方法開發(fā)的，有毒溶劑和試劑的加入導(dǎo)致金屬納米顆粒的生物相容性差。另外，金屬納米顆粒的尺寸、形狀和形態(tài)重現(xiàn)性均較低［35］。因此，細(xì)菌內(nèi)納米工程合成金屬納米顆粒的研究越來越受到關(guān)注。細(xì)菌綠色生物制造蛋白質(zhì)納米顆粒表現(xiàn)出更好的生物安全性，越來越多的蛋白質(zhì)納米顆粒應(yīng)用于腫瘤診療研究。

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)合成金屬納米顆粒 近年，細(xì)菌內(nèi)合成的大多數(shù)金屬納米顆粒的抗腫瘤活性已得到證實(shí)，為腫瘤治療領(lǐng)域帶來新的活力。ALMALKI 等［36］用芽孢桿菌KFU36（Bacillus spKFU36）合成15～40 nm的銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs），從腫瘤血管腔穿過內(nèi)皮進(jìn)入TMEs 并積累，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。YANG 等［37］發(fā)現(xiàn)生物合成的AgNPs 可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，增加脂質(zhì)過氧化，有效改善甲狀腺癌化療效果。VAIRAVEL等［38］利用腸球菌（Enterococcus sp）合成金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs），在細(xì)胞間產(chǎn)生ROS 抑制腫瘤細(xì)胞，也可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞線粒體損傷，從而引起細(xì)胞凋亡。RAJKUMAR等［39］利用惡臭假單胞菌合成硒納米顆粒，可在低濃度下殺死腫瘤細(xì)胞。

磁小體是由趨磁細(xì)菌合成的生物相容性磁性納米顆粒，主要由鐵和鐵的氧化物組成。在特定條件下，具有高矯頑力和高熱容的磁小體在較高溫度下表現(xiàn)出較好的磁性能，可顯著提高熱效率。有研究將磁小體注射至小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，暴露在幾種交變磁場中可產(chǎn)生較強(qiáng)的熱效應(yīng)，使腫瘤消失，無明顯副作用［40］。

E.coli可合成不同類型的金屬納米顆粒，如Cd-SeZn、PrGd、CdCs、FeCo、Au 和AgNPs［41］。通過調(diào)節(jié)金屬離子的濃度控制合成金屬納米顆粒的大小。利用細(xì)菌合成金屬納米顆粒不僅具有治療效果，還可作為藥物輸送載體，拓寬了細(xì)菌療法的臨床應(yīng)用。

1.2.2 細(xì)菌內(nèi)合成蛋白質(zhì)納米顆粒 細(xì)菌不僅可合成金屬納米顆粒，也可合成蛋白質(zhì)納米顆粒，這是一種更安全、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的藥物,主要包括成像劑與抗原遞送載體，如氣泡、鐵蛋白籠、封裝體、小熱休克蛋白和細(xì)菌微組分等［42-46］。有研究利用能編碼合成氣泡的細(xì)菌實(shí)現(xiàn)在體腫瘤的超聲成像（ultrasound imaging，UI），并利用低頻超聲空化引起的機(jī)械效應(yīng)治療腫瘤［42］。HAN 等［47］開發(fā)了一種以細(xì)菌微組分為載體，含有腫瘤模擬抗原雞卵清蛋白（ovalbummin，OVA）的蛋白質(zhì)納米疫苗，工程細(xì)菌微膠囊在體內(nèi)通過產(chǎn)生裂解基因回路，釋放該蛋白質(zhì)納米疫苗，可激活小鼠的特異性免疫以預(yù)防腫瘤，通過表達(dá)近紅外熒光蛋白（infrared fluorescent protein，iRFP）實(shí)現(xiàn)細(xì)菌體內(nèi)熒光成像，該系統(tǒng)具有持久釋放蛋白質(zhì)納米疫苗的潛力，是一種有前途的長效原位藥物設(shè)計(jì)策略。

1.3 基于細(xì)菌的仿生納米顆粒 仿生納米顆粒是指從天然細(xì)菌中提取的生物活性成分，包括細(xì)菌膜、細(xì)菌囊泡和其他活性物質(zhì)，具有良好的生物相容性、獨(dú)特的靶向特性和抗腫瘤能力。近年，細(xì)菌仿生納米顆粒是裝載化療和免疫治療藥物的有效載體，其本身也是一種強(qiáng)大的免疫佐劑，可有效激活機(jī)體免疫。

1.3.1 細(xì)菌生物膜 WANG 等［48］利用羅伊乳酸桿菌生物膜（Lactobacillus reuteribiofilms，LRM）包裹高錳酸鋅-介孔二氧化硅納米顆粒（ZGGO@SiO2@LRM），能夠耐受胃部強(qiáng)酸環(huán)境，實(shí)現(xiàn)5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在結(jié)直腸癌中的釋放。KUMERIA 等［49］從澳大利亞Murray河細(xì)菌的生物膜廢物中提取氧化鐵納米線（bacteria iron oxide nanowires，Bac-FeOxNWs），并負(fù)載DOX，用于體外腫瘤光熱治療。負(fù)載DOX的Bac-FeOxNWs孵育乳腺癌細(xì)胞，暴露在交變磁場10 min后，細(xì)胞活力降低36%。YI等［50］采用銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中提取的鼠李糖脂組裝成納米粒子，并載有光敏劑脫鎂葉綠素a（pheophorbide a，Pba），通過近紅外熒光成像技術(shù)觀察納米顆粒的分布，結(jié)果表明，在小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞7（mouse squamous cell carcinoma 7，SCC7荷瘤小鼠中，該納米離子具有良好的抑瘤作用。因此，細(xì)菌生物膜在腫瘤治療中具有較大的應(yīng)用潛力。

1.3.2 細(xì)菌菌蛻（bacterial ghosts，BG） 革蘭陰性菌裂解產(chǎn)生的空細(xì)胞膜BG 具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢，如BG 可誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且能夠減少化療藥物的使用劑量，從而降低對健康組織的損害［51］。RABEA等［52］利用Salmonella細(xì)菌BG作為疫苗，免疫大鼠后，血清中檢測到較高水平的IgG。

1.3.3 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV） 與BG 相似，OMV 是革蘭陰性菌在生長過程中脫落的外膜。OMV 攜帶許多免疫刺激物，可在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，并與負(fù)載藥物的納米顆粒發(fā)揮協(xié)同作用［53］。CHEN 等［54］報(bào)道，OMV 包覆的聚合物納米顆粒不僅發(fā)揮化療作用，直接殺死腫瘤細(xì)胞，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，顯著抑制腫瘤生長。CHENG 等［55］利用合成生物學(xué)技術(shù)開發(fā)出“即插即用”型工程菌OMV 腫瘤疫苗平臺，可快速展示腫瘤抗原并實(shí)現(xiàn)高效遞送和免疫刺激。該平臺有望滿足復(fù)雜多變的腫瘤抗原的臨床需求，推動(dòng)腫瘤疫苗發(fā)展。

1.3.4 微細(xì)胞（minicells） 細(xì)菌微細(xì)胞也是一種有應(yīng)用前景的遞送載體［56］。微細(xì)胞為納米級大小、無核，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。有研究通過敲除minCD基因，提高E.coliNissle1917（EcN）中minE的表達(dá)，可促進(jìn)產(chǎn)生更多的微細(xì)胞，通過在微細(xì)胞表面插入低pH 多肽，靶向酸性TMEs，并進(jìn)行生物熒光成像，利用腫瘤靶向的微細(xì)胞負(fù)載DOX，可使原位乳腺癌顯著消退，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)［57］，表明細(xì)菌微細(xì)胞可有效降低納米藥物對體內(nèi)正常組織的毒副作用。目前，裝載紫杉醇的Salmonella微細(xì)胞已在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中獲得成功，觀察期間無患者死于不良事件［58］。

1.3.5 其他活性物質(zhì) ZHENG等［59］采用仿生策略將來自多種細(xì)菌不同結(jié)構(gòu)的佐劑活性成分融為一體，以發(fā)揮協(xié)同的免疫刺激作用，將Salmonella脂多糖減毒成分單磷酰脂質(zhì)A 和分枝桿菌（Mycobacteria）胞壁酰二肽的類似物米伐木肽嵌入脂質(zhì)體磷脂雙分子層中，模擬細(xì)菌細(xì)胞壁；脂質(zhì)體表面連接重組表達(dá)的Salmonella鞭毛蛋白，模擬細(xì)菌鞭毛；脂質(zhì)體包載含有非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸序列的DNA 納米顆粒，模擬細(xì)菌擬核，制備得到細(xì)菌仿生腫瘤疫苗佐劑。通過熒光成像觀察，發(fā)現(xiàn)該佐劑可轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)，能通過多條信號通路激活免疫系統(tǒng)，對小鼠黑色素瘤的治療和預(yù)防效果顯著優(yōu)于弗氏佐劑。該免疫佐劑與光熱治療相結(jié)合可作為光熱治療腫瘤疫苗。

基于細(xì)菌的腫瘤診療納米工程匯總見表1。

2 臨床轉(zhuǎn)化中的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

細(xì)菌與納米技術(shù)結(jié)合可有效提高腫瘤診療效果，在基礎(chǔ)科學(xué)研究中取得了較好的成果。將其用于臨床治療仍有一些問題需要解決，如增強(qiáng)遞送過程的可視化是首要條件，不僅可檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況，也可監(jiān)測細(xì)菌在體內(nèi)實(shí)時(shí)繁殖情況。增強(qiáng)細(xì)菌靶向腫瘤的能力是另一個(gè)挑戰(zhàn)，這將使診療制劑更加安全，易于獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。目前，已有相關(guān)細(xì)菌制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)，均顯示出良好的安全性，但治療效果不顯著。因此，提高治療效果也是一個(gè)亟待解決的問題。

2.1 可視化遞送 遞送過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測對促進(jìn)結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌的臨床應(yīng)用具有重要意義。目前，有研究已開發(fā)了多種方法來識別腫瘤內(nèi)的細(xì)菌，如生物發(fā)光、熒光、MRI、PET 和UI［14，17，24，42，60］。由于可見光在組織中的穿透率較低，且存在背景信號干擾，光學(xué)成像技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍具有挑戰(zhàn)性。UCNPs具有發(fā)光穩(wěn)定、發(fā)射峰窄、熒光壽命長的特點(diǎn)［61］，其介導(dǎo)的時(shí)間分辨成像技術(shù)可有效消除背景信號干擾，提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性［62-63］。另外，MRI 和PET技術(shù)具有更好的靈敏度和穿透深度，在增強(qiáng)可視化遞送方面具有良好的應(yīng)用前景。趨磁細(xì)菌合成磁小體或直接修飾磁納米顆粒賦予了細(xì)菌MRI成像的能力［64］?；?8F-脫氧溶糖醇和代謝2-硝基咪唑?yàn)榛A(chǔ)的PET 成像能夠?qū)崿F(xiàn)E.coli在腫瘤部位定植的可視化［65］。

2.2 提高靶向性 為實(shí)現(xiàn)更安全有效的細(xì)菌療法，需要開發(fā)具有更強(qiáng)腫瘤靶向能力的細(xì)菌。專性厭氧菌利用乏氧靶向的特性，可特異性靶向腫瘤組織，而不擴(kuò)散至健康組織。同時(shí)，可通過基因工程提高兼性厭氧菌的靶向能力，以減少其對健康組織的侵襲［20］，如通過合成生物學(xué)技術(shù)將乏氧啟動(dòng)子構(gòu)建至“專性”厭氧Salmonella typhimurium菌株YB1 和ST4基因組中，使其只能定植于腫瘤組織壞死區(qū)域，從而提高菌株靶向能力及安全性［10］。而早期轉(zhuǎn)移性腫瘤區(qū)域是部分含氧的，專性厭氧菌無法進(jìn)入。因此，為提高細(xì)菌療法的診療效率，依據(jù)細(xì)菌的多重趨向性，即趨化性、趨磁性和趨酸性，來實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療［66-69］。如由Fe3O4納米顆粒修飾的天然鉑螺旋藻可用于腫瘤組織的磁靶向［66］。目前，仍有許多細(xì)菌趨向性機(jī)制需要探索，如趨熱性、趨光性和趨電性［70］，這均離不開與納米技術(shù)的結(jié)合。

2.3 提高治療結(jié)果 目前，將減毒沙門菌、梭狀芽孢桿菌和李斯特菌用于腫瘤治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，在患者中未觀察到明顯的腫瘤消退。雖然細(xì)菌療法表現(xiàn)出良好的安全性，但未能達(dá)到預(yù)期的治療效果。因此，將細(xì)菌療法與納米技術(shù)結(jié)合，通過協(xié)同治療增強(qiáng)治療效果，該方法在臨床應(yīng)用中具有較大潛力［5，71］。

3 小結(jié)與展望

迄今為止，卡介苗是唯一獲得FDA 批準(zhǔn)的細(xì)菌類腫瘤治療藥物，雖然有許多基于細(xì)菌的腫瘤治療方式正處于臨床研究階段，主要涉及到沙門菌、李斯特菌、新生梭狀芽胞桿菌、大E.coli Nissle1917［72］，但結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌仍未開展臨床研究。結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌用于腫瘤診療，能夠?qū)⒍叩膬?yōu)勢互補(bǔ)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)可視化遞送、增強(qiáng)靶向性及提高治療效果并降低副作用，在臨床研究方面顯示出巨大的潛力，但現(xiàn)階段結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌仍有一些問題需要解決：①對于結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌制劑，納米材料的負(fù)載效率會影響細(xì)菌的靶向性和安全性，過多的負(fù)載量會限制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)及對外界信號的響應(yīng)；過低的負(fù)載量會大幅降低診療效果。另外，結(jié)合強(qiáng)度較低將會導(dǎo)致納米材料在運(yùn)輸和細(xì)菌增殖過程中發(fā)生脫離，限制了其診療作用的發(fā)揮。因此，需將納米醫(yī)學(xué)、材料學(xué)與細(xì)菌結(jié)合研究，探索納米材料與細(xì)菌的不同負(fù)載方式［73-74］。②細(xì)菌和納米材料的安全性評價(jià)。細(xì)菌由于存在宿主免疫反應(yīng)、固有的細(xì)菌毒性、遺傳不穩(wěn)定等問題，其安全性在臨床試驗(yàn)中具有較大挑戰(zhàn)［8］。納米材料的被動(dòng)積累及生物降解性需要研究人員進(jìn)一步探索［75］，開發(fā)基于細(xì)菌的仿生納米顆粒將受到廣泛關(guān)注，結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌用于腫瘤診療需要立足于診療效果和安全性的平衡。細(xì)菌具有靈活的基因可編輯性，將為改善細(xì)菌治療效果、降低毒力及細(xì)菌清除提供無限可能［71］。另外，在該過程中仍存在許多阻礙其向臨床轉(zhuǎn)化的問題，包括劑量依賴性、納米材料的生產(chǎn)成本和質(zhì)量可控性及培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化等［76］。盡管結(jié)合納米技術(shù)的細(xì)菌存在這些未解決的問題，作為一種新興的腫瘤診療方式，將納米技術(shù)與細(xì)菌的性質(zhì)和優(yōu)勢結(jié)合，使兩個(gè)或更多診療方法集成至單個(gè)微／納米平臺，從而產(chǎn)生更好的腫瘤診療效果，值得進(jìn)一步深入研究。