馬春英，趙蕾，王子凡，侯剛，馬花，馬忠仁，王家敏，

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730010

片狀載體又稱紙片載體或大載體［1-2］，主要是由醫(yī)用級(jí)高分子化合物聚酯纖維聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）通過靜電超聲波紡絲技術(shù)熱粘合加工成多孔結(jié)構(gòu)的纖維無紡布基材，進(jìn)一步經(jīng)焊接、成型、清洗、等離子體或化學(xué)電荷處理等工藝制成的培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的一種片狀固體支持生長(zhǎng)基質(zhì)［3］。片狀載體由于其高效、簡(jiǎn)單、易控制的培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)，目前一直應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)［4-5］。近年來，細(xì)胞源病毒疫苗迅速發(fā)展，使得片狀載體市場(chǎng)需求量增多［6-7］，但其原材料受限，進(jìn)口載體占市場(chǎng)使用量的一半，且價(jià)格昂貴，因此，對(duì)片狀載體原材料的開發(fā)與應(yīng)用一直是研究的重點(diǎn)［8-9］。

片狀載體作為動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的基質(zhì)材料，其與細(xì)胞的生物相容性主要表現(xiàn)在細(xì)胞的黏附與增殖，細(xì)胞黏附分子結(jié)合到基質(zhì)中的能力，顯著影響細(xì)胞在其上的附著力［10］。因此，載體材料的化學(xué)元素組成和親疏水性是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。本研究對(duì)3 種片狀載體化學(xué)元素組成和親疏水特性進(jìn)行分析，并對(duì)Vero、MDCK、MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)效果進(jìn)行比較，以期為片狀載體后續(xù)研究及生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及片狀載體 貼壁培養(yǎng)型細(xì)胞Vero、MDCK、MRC-5從ATCC引進(jìn)，由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心保存；PET 基質(zhì)多層片狀載體（菱形，A）由蘭州百靈塑料制品有限公司生產(chǎn)；Fibra-Cel圓片載體（B）購(gòu)自美國(guó)Eppendorf 公司；多層片狀載體（菱形，C）購(gòu)自上海楚鯤生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 M199（批號(hào)：20220419，葡萄糖濃度為1.2 g／L）、MEM（批號(hào)：20220217，葡萄糖濃度為1.0 g／L）、MDCK 專用培養(yǎng)基（批號(hào)：20220209，葡萄糖濃度為4.5 g／L）、0.25%胰酶（批號(hào)：20220215）和PBS 溶液（批號(hào)：20220214）均購(gòu)自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）熒光染料購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司；vario-EL cube元素分析儀購(gòu)自德國(guó)Elementar 公司；EscaLabXi+ X 射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；生物傳感器分析儀（型號(hào)：S-10）購(gòu)自深圳市西爾曼科技有限公司。

1.3 載體的預(yù)處理 分別稱取3種載體各0.5 g進(jìn)行預(yù)處理：用純化水浸泡5 min以上，再浸泡于0.1 mol／L NaOH 溶液中4 h以上后，用純化水反復(fù)清洗至pH為中性，控干水分，裝入各含50 mL PBS溶液的125 mL搖瓶中，121 ℃，40 min高壓滅菌后，分別用不同的細(xì)胞培養(yǎng)液過夜預(yù)孵備用。

1.4 元素分析 使用vario-EL cube 元素分析儀測(cè)定載體的組成元素。在EscaLabXi+XPS 上測(cè)定X 射線光電子能譜，獲得載體表面的元素組成。

1.5 接觸角測(cè)定 通過實(shí)驗(yàn)室自行搭建的接觸角儀測(cè)定載體表面接觸角，以表征載體表面的親疏水性質(zhì)。測(cè)定過程中手動(dòng)向載體表面滴加3μL 超純水，并在1 s內(nèi)拍照，再利用LabView編程程序計(jì)算接觸角。

1.6 細(xì)胞貼附率檢測(cè) 分別復(fù)蘇Vero、MDCK和MRC-5

細(xì)胞，利用常規(guī)培養(yǎng)方法傳代擴(kuò)增至足夠細(xì)胞數(shù)量時(shí)，Vero 和MDCK 細(xì)胞按50×104個(gè)／mL，MRC-5 細(xì)胞按100 × 104個(gè)／mL，接種體積為50 mL 分別接種3 種載體于125 mL 錐形瓶中，各接種3 組，置于37 ℃，120 r／min，5%CO2搖床培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)30、60、90、120、150、180 min 時(shí)取樣，計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，按下式計(jì)算不同細(xì)胞在不同載體上的貼附率。

貼附率（%）=（初始細(xì)胞接種密度-不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度）／初始細(xì)胞接種密度×100%

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)效果檢測(cè) 待細(xì)胞貼附載體后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，換至新的125 mL錐形瓶中，加入50 mL 新的細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)［11］。由于二倍體細(xì)胞增殖周期較長(zhǎng)，MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)周期為10 d ，Vero 和MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)周期為7 d，期間每隔24 h 取樣，利用生物傳感器分析儀檢測(cè)葡萄糖消耗量，根據(jù)糖耗換液。按下式計(jì)算葡萄糖消耗速率和消耗總量，通過整個(gè)培養(yǎng)周期葡萄消耗速率曲線和消耗總量評(píng)估各載體對(duì)不同細(xì)胞的培養(yǎng)效果。

葡萄糖消耗速率（g／d）=［上次葡萄糖測(cè)定值（g／L）-本次時(shí)間點(diǎn)葡萄糖測(cè)定值（g／L）］×培養(yǎng)體積（L）／本次與上次取樣間隔時(shí)間（h）×24（h）；

累計(jì)葡萄糖消耗總量（mg）=葡萄糖消耗速率×培養(yǎng)體積×1 000

分別于培養(yǎng)7 和10 d 時(shí)取出1 ～2 片載體，用PBS 溶液溫和洗滌2 ～3 次，以除去培養(yǎng)基中的活性酯酶，再加入一定量的Calcein-AM 熒光染色工作液（沒過載體），37 ℃孵育15 ～30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 元素分析

2.1.1 組成元素分析結(jié)果 通過元素分析，得出3種載體主要由C、H、O 3 種元素組成，且含有少量的N元素。載體A 和C 4 種元素含量基本一致，載體B 的C 和H 元素含量均高于載體A 和C，O 和N 元素含量略低于載體A和C。見表1。

表1 元素分析結(jié)果Tab.1 Elemental analysis results

2.1.2 XPS 表面元素分析結(jié)果 3 種載體表面分別在285、533、399.9 和168.4 eV 電子結(jié)合能下均產(chǎn)生了C、O、N、S 4 種元素不同強(qiáng)度的電子波峰，其中，除載體A 無S 元素外，3 種載體均在不同電子結(jié)合能下產(chǎn)生了相應(yīng)元素的電子波峰，載體B 的表面元素O與C 和N 與C 比值均高于載體A 和C，而載體B 與C的表面元素S基本一致。見表2。

表2 XPS表面元素含量Tab.2 XPS surface element content

整體分析，除S 元素增加，3 種載體的XPS 分析與元素分析結(jié)果具有很好的相關(guān)性。

2.2 接觸角 預(yù)處理前，載體B 在1 s 內(nèi)迅速吸干水滴，接觸角為0°，顯著低于載體A 和C（F均為709.1，P均＜0.000 1）；而載體A 和C 水滴球未吸干，接觸角分別為（109 ± 3.13）°和（121 ± 6.82）°，且載體A的接觸角顯著低于載體C（F=709.1，P=0.035 8）。經(jīng)0.1 mol／L NaOH 溶液預(yù)處理后，3 種載體的接觸角均為0°，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.069 4，P＞0.05）。見圖1。

圖1 3種載體預(yù)處理前后接觸角固定圖Fig.1 Contact angle images of three carriers before and after pretreatment

2.3 貼附率 Vero、MDCK 和MRC-5 細(xì)胞分別接種于3種載體后，3 h內(nèi)的貼附率均在80%以上，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Vero 細(xì)胞：載體A 與B 和C 比較，F(xiàn)均為0.074 2，P分別為0.997 8和0.952 7；載體B與C比較，F(xiàn)=0.074 2，P=0.931 7。MDCK 細(xì)胞：載體A 與B和C比較，F(xiàn)均為4.867，P分別為0.098 3和0.946 8；載體B與C比較，F(xiàn)=4.867，P=0.065 9。MRC-5細(xì)胞：載體A與B和C比較，F(xiàn)均為1.276，P分別為0.525 5和0.918 4；載體B與C比較，F(xiàn)=1.276，P=0.339 8）。見圖2和圖3。

圖2 3種載體對(duì)不同細(xì)胞的貼附趨勢(shì)Fig.2 Adhesion trend of three carriers to different cells

圖3 3種載體對(duì)不同細(xì)胞的貼附率比較Fig.3 Comparison of adhesion efficiency of three carriers to different cells

2.4 不同細(xì)胞培養(yǎng)效果 3 種細(xì)胞在3 種載體上長(zhǎng)勢(shì)均均勻，葡萄糖消耗曲線均趨于“S”型。Vero 和MDCK 細(xì)胞均在培養(yǎng)120 h 時(shí)葡萄糖消耗達(dá)平臺(tái)期，此時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞在載體纖維上致密；MRC-5細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)第9 天時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞在載體纖維上致密，葡萄糖消耗達(dá)平臺(tái)期。見圖4 ～6。

圖5 培養(yǎng)5 d（MRC-5 細(xì)胞第9 天）細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察（×100）Fig.5 Observation of cell growth morphology on 5 d of culture（MRC-5 cells on 9 d）（×100）

圖6 3種載體培養(yǎng)不同細(xì)胞的葡萄糖消耗曲線Fig.6 Glucose consumption curves of different cells cultured with three carriers

Vero、MDCK 和MRC-5 細(xì)胞葡萄糖消耗總量載體A 與C 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為60.09、9.941和38.16，P分別為0.370 7、0.972 3和0.777 0）；載體B顯著低于載體A和C（Vero細(xì)胞：F均為60.09，P分別為0.000 1和0.000 3；MDCK細(xì)胞：F均為9.941，P分別為0.017 3 和0.022 4；MRC-5 細(xì)胞：F均為38.16，P分別為0.000 9 和0.000 5），這與載體本身的表面積有關(guān)，多層載體的表面積大于圓片載體。見圖7。

圖7 3種載體培養(yǎng)不同細(xì)胞的葡萄糖消耗總量比較Fig.7 Comparison of total amount of glucose consumption of different cells cultured with three carriers

3 討論

片狀載體作為貼壁型動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要載體之一，在生物制藥領(lǐng)域備受關(guān)注［12-13］，其主要優(yōu)勢(shì)在于貼附面積大，吸附效率更高且損傷小，活細(xì)胞密度和產(chǎn)率高，培養(yǎng)基利用率高，接種密度較低，占地面積小，自動(dòng)化程度高，更有利于灌流培養(yǎng)以及下游純化，且更適用于無血清培養(yǎng)［14-15］，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)、抗體以及病毒疫苗的生產(chǎn)［16-17］。

片狀載體作為目前培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞應(yīng)用最多的載體之一，目前國(guó)內(nèi)就其原材料本身的相關(guān)報(bào)道較少，尤其關(guān)于其化學(xué)元素組成與其親疏水特性之間關(guān)系的報(bào)道更少。因此，本研究選取3 種片狀載體，通過元素分析和XPS 表面元素分析以及水接觸角檢測(cè)技術(shù)對(duì)其元素組成和親疏水性進(jìn)行對(duì)比分析，并通過Vero、MDCK 和MRC-5 細(xì)胞對(duì)3 種載體的細(xì)胞貼附率及培養(yǎng)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，3 種載體均主要由C、H、O 3 種元素組成，且含有少量的N 和S 元素。預(yù)處理前，載體B 的親水性最強(qiáng)，A 和C親水性較差；預(yù)處理后，A、B、C 3 種載體均親水，且培養(yǎng)3 h 內(nèi)對(duì)3 種細(xì)胞的貼附率均在80%以上，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)效果良好。

3 種載體XPS 表面元素分析結(jié)果顯示，載體B 表面的O 和N 元素均高于A 和C，且H 元素組成最高，其預(yù)處理前的水接觸角為0°，顯著低于載體A 和C（P均＜0.000 1），親水性最強(qiáng)。表明載體B 表面的-OH 和-COOH 親水性基團(tuán)含量較高；而載體A 和C的H 和O 元素基本一致，其水接觸角分別為（109 ±3.13）°和（121±6.82）°，均親水性較差，證明其表面缺少親水性基團(tuán)，經(jīng)0.1 mol／L NaOH 溶液預(yù)處理后，載體A 和C 的水接觸角均為0°，則是由于通過堿水解反應(yīng)使得載體PET 表面的酯鍵部分?jǐn)嗔?，產(chǎn)生親水性-OH 和-COOH 基團(tuán)，使得其親水性增強(qiáng)［18-19］。而N 和S 元素的引入則是為了細(xì)胞能在其表面更好地黏附生長(zhǎng)［20］。尤其是N 元素引入，不僅可使材料表面帶一定數(shù)量的正電荷，促進(jìn)細(xì)胞黏附，還可與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)肽鏈產(chǎn)生分子水平官能團(tuán)之間的相互作用，從各角度促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)［21-22］。其中具體含量的影響，尚有待進(jìn)一步研究。本研究還比較了3種細(xì)胞在3 種載體上的貼附率和培養(yǎng)效果，貼附率均在80%以上；連續(xù)培養(yǎng)7 ～10 d后，細(xì)胞均致密，長(zhǎng)勢(shì)均勻，葡萄糖消耗曲線均趨于“S”型，載體A 和C在3種細(xì)胞上的葡萄糖消耗總量基本一致，載體B葡萄糖消耗總量均低于載體A和C，這與載體本身的表面積有關(guān)，多層載體的表面積大于圓片載體。

綜上所述，本研究對(duì)3種片狀載體的化學(xué)元素組成和親疏水特性關(guān)系進(jìn)行了分析，并對(duì)Vero、MDCK和MRC-5 3 種細(xì)胞的貼附率及培養(yǎng)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為片狀載體的后續(xù)研究及生產(chǎn)應(yīng)用提供了參考。