劉鵬，彭岳

廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新綜合實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200

目前研究和應(yīng)用最廣泛的抑制性免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路為程序性細(xì)胞死亡受體-1（programmed cell death protein-1，PD-1）／程序性死亡受體配體-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4），其中PD-1／PD-L1 信號(hào)通路是最典型的代表。PD-1又稱(chēng)CD279，基因全長(zhǎng)867 bp，位于人2號(hào)染色體長(zhǎng)臂3 區(qū)7 帶第3 亞帶，PD-1 蛋白是1 個(gè)由288 個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，從N-端至C-端依次為信號(hào)肽、N-端胞外免疫球蛋白可變區(qū)（immunoglobulin variable region，IgV）樣結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)約20 個(gè)氨基酸組成的莖、跨膜區(qū)域和1 個(gè)包含酪氨酸信號(hào)基序的C-端胞質(zhì)尾部［6］。PD-1 除了在激活的T 淋巴細(xì)胞表達(dá)外，還在胸腺的雙陰性（CD4-、CD8-）T 細(xì)胞、激活的自然殺傷T 細(xì)胞、活化的B 細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞和未成熟的朗格漢斯細(xì)胞上呈低水平表達(dá)，是一種重要的免疫反應(yīng)抑制分子［7］。PD-1 有兩種已知配體：PD-L1（又稱(chēng)CD274和B7-H1）和PD-L2（又稱(chēng)CD273和B7-DC）［8］。其中PD-L1 是華人科學(xué)家陳列平團(tuán)隊(duì)在腫瘤微環(huán)境中率先發(fā)現(xiàn)的，在癌細(xì)胞上高度表達(dá)的一種免疫球蛋白樣分子［9］，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，與PD-1具有相似結(jié)構(gòu)，也具有信號(hào)肽、N-端胞外IgV 和IgC 樣結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜區(qū)域和C-端胞質(zhì)尾部［10］。PD-L1 通過(guò)IgV 結(jié)構(gòu)域與腫瘤浸潤(rùn)環(huán)境中的淋巴細(xì)胞上高表達(dá)的PD-1 結(jié)合后，誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡、功能喪失和耗竭，從而抑制腫瘤抗原特異性CD8+T 細(xì)胞的活化、增殖和抗癌功能，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸［11-12］。

目前靶向PD-1／PD-L1 信號(hào)通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑已在多個(gè)癌種中展現(xiàn)出顯著臨床療效。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外已上市的PD-1／PD-L1 抑制劑均為大分子抗體藥物，具有特異性強(qiáng)、毒副作用低等優(yōu)勢(shì)，但也有其固有劣勢(shì)，如研發(fā)成本高、批量生產(chǎn)難度大、組織滲透性差等弊端。近年來(lái)，越來(lái)越多的多肽類(lèi)藥物被開(kāi)發(fā)為免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于臨床。因此，本研究構(gòu)建了人PD-L1 IgV 結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行與課題組已構(gòu)建的肽適體骨架蛋白——人硫氧還蛋白（human thioredoxin，hTrx，11.91 kD）酵母雙雜交獵物質(zhì)粒之間相互作用的檢測(cè)，為后續(xù)從以hTrx 為骨架的肽適體文庫(kù)中篩選出能靶向結(jié)合PD-L1 IgV 的特異肽適體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGADT7-T、pGBKT7-53 及載體pGADT7、pGBKT7 均購(gòu)自陜西普因特生物工程有限公司；pENTER-PD-L1質(zhì)粒購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；pGADT7-hTrx質(zhì)粒、E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；Y187 感受態(tài)細(xì)胞、Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自陜西普因特生物工程有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司；DNA marker DSTM5000、Pfu Mix、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物及DNA 片段純化試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；C-Myc-Tag 兔源單克隆抗體、GAPDH 兔源單克隆抗體、HRP Goat anti-rabbit IgG 抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；YPDA 培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TureColor 雙色預(yù)染蛋白marker（常規(guī)范圍）、SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；YT-015 Minute?總蛋白提取試劑盒（酵母、細(xì)菌、微藻等厚胞壁微生物）購(gòu)自英文特生物技術(shù)（北京）有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DAB 辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；SD／-Trp、SD／-Leu、SD／-Trp／-Leu、X-α-Gal、金擔(dān)子素A（aureo-basidin A，AbA）、Carrier DNA、YPD Plus Medium、酵母轉(zhuǎn)化PEG／LiAC混合液、0.9%氯化鈉溶液（無(wú)菌）購(gòu)自陜西普因特生物工程有限公司；XY-SH-150-Ⅲ型智能生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；THZ-300C 型恒溫?fù)u床（可制冷）購(gòu)自上海一恒科技有限公司；T100TM Thermal Cycler 梯度PCR 儀、GelDoc XR + 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；5418 型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；EPS300型電泳儀、Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；NanoDropTMOne／OneC 型超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司。

1.3 PD-L1生物信息學(xué)分析 使用SignalP-6.0（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php?SignalP）預(yù)測(cè)PD-L1蛋白信號(hào)肽［13］；TMHMM 2.0（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)PDL1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域［14］；SMART（http：／／smart.emblheidelberg.de／）預(yù)測(cè)PD-L1 結(jié)構(gòu)域［15］；并用DOG 2.0繪制蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域示意圖［16］；使用NetNGlyc 1.0 Server（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php?NetNGlyc-1.0）查找PD-L1 蛋白糖基化位點(diǎn)［17］；NetPhos3.1 Server 查找PD-L1 蛋白磷酸化位點(diǎn)［18］；ITASSER（https：／／zhanggroup.org／I-TASSER／）預(yù)測(cè)PD-L1、PD-1蛋白三維結(jié)構(gòu)［19］；HAD-DOCK2.2（http：／／milou.science.uu.nl／services／HA-DDOCK2.2／）預(yù)測(cè)PD-L1 與PD-1 結(jié)合模式［20］，并利用PyMOL1.7.0 程序?qū)?fù)合物作用機(jī)制進(jìn)行解析并繪制對(duì)接模型圖。

1.4 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV誘餌質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI GenBank 中公布的人PD-L1 CDS序列（NM_014143）設(shè)計(jì)擴(kuò)增PD-L1 IgV結(jié)構(gòu)域的引物。上游引物：5'-CGGAATTCATGCCCAAGGACCTATATGTGG-3'（斜體部分為保護(hù)堿基，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-ACGCGTCGACTTAATTGACTTTCACAGTAATTCGC-3'（斜體部分為保護(hù)堿基，下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為330 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pENTER-PD-L1質(zhì)粒為模板，使用高保真DNA 聚合酶Pfu Mix PCR 擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系：2×Pfu Mix 25μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，模板質(zhì)粒（50 ng／μL）1μL，ddH2O 22μL，反應(yīng)總體積為50μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收純化，NanoDropTMOne／OneC 型超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)純度和濃度。

將純化回收的PCR 產(chǎn)物和酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7 分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，膠回收載體片段與目的片段，按1∶3摩爾比混合，T4 DNA連接酶4 ℃酶連過(guò)夜；42 ℃熱激法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含終濃度50μg／mL卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落，利用載體引物［BD-F：5'-CATCATCGGAAGAGAGTAGT-3'，BDR：5'-GAAAGCAACCTGACCTACAG-3'；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。挑取陽(yáng)性克隆子，接種至含終濃度50 μg／mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 將100 ng pGBKT7、pGBKT7-PD-L1 IgV分別加至預(yù)冷的1.5 mL EP 管中，加入5 μL carrier DNA（沸水浴變性5 min，冰浴快速處理2 min），混勻，加入100 μL Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞，混勻，加入500 μL PEG／LiAc緩沖液，混勻，30 ℃孵育30 min，每隔10 min上下顛倒6 ～8 次混合；加入20 μL DMSO，混勻，42 ℃水浴15 min，每隔5 min 上下顛倒6 ～8 次混合；10 000 ×g離心15 min；棄上清液，加入1 mL YPD Plus 液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30 ℃，200 r／min 振蕩培養(yǎng)60 min；10 000×g離心15 s；棄上清液，加入1 mL 0.9% NaCl 溶液重懸細(xì)胞；取菌液200 μL，涂布至100 mm SD／-Trp 平板上，30 ℃培養(yǎng)3 ～5 d，直至長(zhǎng)出2 mm左右單菌落。

1.6 重組陽(yáng)性克隆子的菌落PCR鑒定 PCR管中加入25μL無(wú)菌超純水，用無(wú)菌槍頭蘸取SD／-Trp平板上少量新鮮酵母菌斑，數(shù)量不可過(guò)多，以免抑制PCR反應(yīng)，水浴煮沸5 min；取1μL 作為PCR 模板，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為12μL：超純水4μL，PCR混合物6μL，載體上下游引物（10μmol／L）各0.5μL，菌液模板1μL。掌型離心機(jī)瞬時(shí)離心10 s混勻后，進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

目前，我國(guó)大多數(shù)的鄉(xiāng)村旅游建設(shè)是由政府主導(dǎo)，尤其是在各種扶持政策文件下，得到當(dāng)?shù)剜l(xiāng)鎮(zhèn)政府的極大重視，為鄉(xiāng)村旅游發(fā)展提供了基礎(chǔ)保證，但僅靠政府力量并不足夠，需要整合行業(yè)協(xié)會(huì)、企業(yè)、志愿者、村民等共同形成管理機(jī)構(gòu)，統(tǒng)一規(guī)范管理。如借鑒“法蘭西最美麗村莊”協(xié)會(huì)的經(jīng)營(yíng)模式，建立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕M織結(jié)構(gòu)和管理機(jī)制，讓本村的干部、提供資助的社團(tuán)或企業(yè)以及部分有經(jīng)驗(yàn)的并有一定學(xué)歷的服務(wù)行業(yè)從業(yè)者組成執(zhí)行代表團(tuán)，共同參與建設(shè)，更多地賦權(quán)給對(duì)本地區(qū)概況極其了解且有一定學(xué)歷背景的本地村民及有權(quán)威性的協(xié)會(huì)部門(mén)或企業(yè)，共同參與標(biāo)準(zhǔn)的制訂與考核，平衡各相關(guān)者的利益，達(dá)到利益均衡才是可持續(xù)發(fā)展的根本動(dòng)力。

1.7 誘餌蛋白PD-L1 IgV 表達(dá)的Western blot 分析按照YT-015 Minute?總蛋白提取試劑盒（酵母，細(xì)菌、微藻等厚胞壁微生物）說(shuō)明書(shū)提取酵母總蛋白：挑取SD／-Trp平板上的酵母菌至20 mL SD／-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r／min 培養(yǎng)18 ～24 h，至A600為0.8 ～1.0；于1.5 mL 離心管中離心收集菌體，菌體濕體積約30μL，加入1 mL 無(wú)菌超純水重懸菌體，室溫，12 000 ×g離心2 min；洗滌菌體，棄上清，取80 ～90 mg 蛋白提取粉，加入20 μL 變性緩沖液，研磨棒反復(fù)研磨2 min；加入150 ～200μL緩沖液，再研磨約30 s；渦旋振蕩10 s；室溫，12 000×g離心3 min；將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP 管，即為酵母總蛋白。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)濃度，控制上樣量為25μg，經(jīng)12%SDS-PAGE分離蛋白；采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，封閉液室溫封閉2 h；加入C-Myc Tag 兔源單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；加入HRP Goat anti-rabbit IgG（1∶2 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h；DAB 試劑盒顯色。內(nèi)參為GAPDH 兔源單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?，轉(zhuǎn)化酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7的酵母Y2HGold為陰性對(duì)照。

1.8 誘餌蛋白PD-L1 IgV毒性和自我激活及其與hTrx相互作用的檢測(cè) 分別轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體、pGBKT7-PD-L1 IgV質(zhì)粒至Y2HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞中，分別挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子、空載體轉(zhuǎn)化子于5 mL SD／-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r／min 培養(yǎng)24 h，至A600為0.8 ～1.0；用生理鹽水稀釋至1×10-4，取100μL涂布SD／-Trp、SD／-Trp／X-α-Gal、SD／-Trp／X-α-Gal／AbA或SD／-Leu固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d；觀察菌落生長(zhǎng)情況，對(duì)比菌落大小、顏色及數(shù)量。

采用滴板法檢測(cè)誘餌蛋白PD-L1 IgV 與hTrx 自我激活及相互作用。分別按照Y2HGold／pGBKT7-PD-L1IgV+Y187／pGADT7-hTrx、Y2HGold／pGBKT7-PD-L1 IgV+ Y187／pGADT7、Y2HGold／pGBKT7 +Y187／pGADT7-hTrx組合接種至2 × YPDA 培養(yǎng)基中，漩渦混勻，30 ℃，180 r／min 共培養(yǎng)12 ～16 h；設(shè)Y2HGold／pGBKT7-53 + Y187／pGADT7-T 為陽(yáng)性對(duì)照，Y2HGold／pGBKT7 + Y187／pGADT7 為陰性對(duì)照，漩渦儀混勻，30 ℃180 r／min 培養(yǎng)12 ～16 h；測(cè)A600值，進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?00、10-1、10-2、10-3共4個(gè)梯度），每個(gè)稀釋度取10μL，滴加至SD／-Trp／-Leu和SD／-Trp／-Leu／X-α-Gal／AbA 平板上，30 ℃培養(yǎng)3 ～5 d；拍照。

1.9 數(shù)據(jù)采集及分析 采用GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)及Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1 生物信息學(xué)分析 SignalP-6.0 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PD-L1 蛋白N-端1 ～18 號(hào)氨基酸（MRIFAVFIFMTYWHLLNA）為信號(hào)肽；TMHMM 2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PD-L1 蛋白C-端239 ～261 號(hào)氨基酸（THLVILGAILLCLGVALTFIFRL）為跨膜結(jié)構(gòu)域，C-端262 ～290 號(hào)氨基酸區(qū)域位于胞質(zhì)內(nèi)；SMART 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PD-L1 24 ～131號(hào)氨基酸為免疫球蛋白功能區(qū)域IgV，139 ～227 號(hào)氨基酸為IgC 結(jié)構(gòu)域，239 ～261 號(hào)氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域，與TMHMM 2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果一致；綜上結(jié)果用DOG 2.0 繪制蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域示意圖，見(jiàn)圖1A；NetNGlyc1.0 查找到PD-L1 蛋白糖基化位點(diǎn)為35、192、200、219 號(hào)氨基酸；NetPhos3.1 查找到PD-L1 存在30 個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，其中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)16個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)8 個(gè)；I-TASSER 預(yù)測(cè)獲得PD-L1 和PD-1蛋白全長(zhǎng)的三維結(jié)構(gòu)，用于HADDOCK 進(jìn)行分子對(duì)接，獲得最佳對(duì)接模式，使用PyMOL1.7.0 程序進(jìn)行解析，結(jié)果顯示，PD-L1 IgV 結(jié)構(gòu)域的113 ～126 氨基酸（RCMISYGGADYKRI）是與PD-1結(jié)合的核心區(qū)域，PD-1 的V64、N66、Y68、Q75、T76、K78、I126、L128、A132、I134 和E136 是其與PD-L1 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，見(jiàn)圖1B。

圖1 PD-L1 結(jié)構(gòu)模式圖（A）及其與PD-1 分子對(duì)接模型圖（B）Fig.1 Pattern diagram of PD-L1 structure（A）and its docking model diagram with PD-1 molecule（B）

2.2 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV誘餌質(zhì)粒的鑒定PD-L1 IgV基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)約330 bp的特異條帶，大小與預(yù)期相符，見(jiàn)圖2。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒回收純化，NanoDropTMOne／OneC 型超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)其濃度為56.1 ng／μL，A260／A280為1.88，可用于下游雙酶切試驗(yàn)，構(gòu)建至pGBKT7 載體上，見(jiàn)圖3。將純化回收的PD-L1 IgVPCR 產(chǎn)物和pGBKT7 載體分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切及純化回收，目的片段濃度為42.9 ng／μL，A260／A280為1.89，載體濃度為49.5 ng／μL，A260／A280為1.91，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂板，菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)732 bp 的重組片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖4。提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期序列一致，見(jiàn)圖5。

圖2 PD-L1 IgV基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of PD-L1 IgV gene PCR amplification products

圖3 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV誘餌質(zhì)粒圖譜Fig.3 The map of yeast two-hybrid recombinant pGBKT7-PD-L1 IgV bait plasmid

圖4 含重組質(zhì)粒pGBKT7-PD-L1 IgV 的陽(yáng)性克隆子菌落PCR篩選Fig.4 PCR screening of positive clones of recombinant plasmid pGBKT7-PD-L1 IgV

圖5 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV 誘餌質(zhì)粒測(cè)序圖譜Fig.5 Sequencing map of yeast two-hybrid recombinant pGBKT7-PD-L1 IgV bait plasmid

2.3 酵母雙雜交重組pGBKT7-PD-L1 IgV誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定 菌落PCR 鑒定結(jié)果顯示，導(dǎo)入空載體pGBKT7 的Y2HGold 酵母PCR 產(chǎn)物理論大小為402 bp，導(dǎo)入質(zhì)粒pGBKT7-PD-L1 IgV的Y2HGold 酵母PCR 產(chǎn)物理論大小為732 bp，均與預(yù)期相符，見(jiàn)圖6。表明質(zhì)粒已成功導(dǎo)入Y2HGold酵母。

圖6 酵母菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆子Fig.6 Screening of positive clones by yeast colony PCR

2.4 誘餌蛋白PD-L1 IgV 的鑒定 12% SDS-PAGE分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約14 400 處可見(jiàn)特異條帶，大小與PD-L1 IgV 理論值（14 950）相符；Western blot分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約14 400處可見(jiàn)明顯目的條帶，大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖7。表明誘餌蛋白PD-L1 IgV在Y2HGold酵母中能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖7 SDS-PAGE（A）和Western blot 法（B）鑒定誘餌蛋白PD-L1 IgV的表達(dá)Fig. 7 Analysis of the expression of bait protein PD-L1 IgV by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

2.5 PD-L1 IgV 蛋白毒性和自我激活效應(yīng)及其與hTrx 互作情況 空載體pGBKT7、質(zhì)粒pGBKT7-PDL1 IgV轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布SD／-Trp、SD／-Trp／X-α-Gal、SD／-Trp／X-α-Gal／AbA平板培養(yǎng)3 ～5 d后，結(jié)果顯示，兩者在SD／-Trp、SD／-Trp／X-α-Gal平板上生長(zhǎng)良好，菌落大小、數(shù)量一致，呈白色，在SD／-Trp／X-α-Gal／AbA平板上兩者均不生長(zhǎng)，見(jiàn)圖8。表明PD-L1 IgV 蛋白對(duì)酵母無(wú)毒性，且無(wú)自我激活效應(yīng)。采用滴板法檢測(cè)誘餌蛋白PD-L1 IgV與hTrx自我激活與相互作用，結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組在SD／-Trp／-Leu平板上生長(zhǎng)良好，僅陽(yáng)性對(duì)照組可在SD／-Trp／-Leu／X-α-Gal／AbA平板上生長(zhǎng)且呈藍(lán)色，見(jiàn)圖9。表明誘餌蛋白PD-L1 IgV、獵物蛋白hTrx不存在自我激活現(xiàn)象，且兩者之間也不存在相互作用。

圖8 PD-L1 IgV蛋白毒性及自我激活檢測(cè)Fig.8 Detection of PD-L1IgV protein toxicity and self-activation

圖9 PD-L1 IgV蛋白和hTrx相互作用檢測(cè)Fig.9 Detection of interaction between PD-L1 Igv protein and hTrx

3 討論

通過(guò)靶向阻斷PD-1／PD-L1 信號(hào)通路，重新激活T 細(xì)胞，已成為當(dāng)前腫瘤免疫治療焦點(diǎn)。本研究選擇PD-1／PD-L1 信號(hào)通路中的PD-L1 進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，其中IgV 結(jié)構(gòu)域是與PD-1 結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，克隆構(gòu)建的PD-L1 IgV酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，在酵母Y2HGold 中可穩(wěn)定表達(dá)，無(wú)細(xì)胞毒性和自我激活作用，且與hTrx之間無(wú)相互作用。

PD-L1基因全長(zhǎng)873 bp，定位于人9 號(hào)染色體短臂2 區(qū)4 帶第1 亞帶，胞內(nèi)合成的新生肽通過(guò)N-端信號(hào)肽（MRIFAVFIFMTYWHLLNA）引導(dǎo)，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體糖基化等修飾后成熟，通過(guò)細(xì)胞分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞表面。PD-L1 是一種跨膜糖蛋白，具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域IgV、IgC，以及跨膜結(jié)構(gòu)域和約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的胞質(zhì)尾巴［21-22］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PD-L1 35、192、200、219 號(hào)氨基酸高度N-糖基化有助于PD-L1蛋白的穩(wěn)定性及其與PD-1相互作用，促使腫瘤細(xì)胞免疫逃避［23-24］。PD-L1可在不同的絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾，影響其穩(wěn)定性和功能，可見(jiàn)對(duì)PD-L1 的修飾機(jī)制研究，將為提高靶向阻斷PD-1／PD-L1 信號(hào)通路的有效性提供新的策略，從而進(jìn)一步提高腫瘤免疫治療效果［25］。PD-L1 通過(guò)其IgV 結(jié)構(gòu)域與PD-1 相互作用，其中IgV 113 ～126 號(hào)氨基酸（RCMISYGGADYKRI）是與PD-1相互作用的核心區(qū)域，因此該區(qū)域常常成為小分子或者肽類(lèi)抑制劑的靶區(qū)域［26-27］。綜合生物信息分析及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究克隆構(gòu)建了人PD-L1 IgV結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold 細(xì)胞中，菌落PCR 直接檢測(cè)陽(yáng)性克隆子，其產(chǎn)物均為特異目標(biāo)條帶，表明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行培養(yǎng)，提取總蛋白，Western blot 分析表明，PD-L1 IgV 可在Y2HGold酵母細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

肽適體是一種小的組合蛋白質(zhì)，由兩部分組成：骨架蛋白以及在骨架蛋白上以環(huán)狀嵌入的一段由5 ～20 個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基組成的可變肽。常見(jiàn)的肽適體骨架蛋白有hTrx、細(xì)菌硫氧還蛋白、金黃色葡萄球菌核糖核酸酶SNase 等，其中hTrx 已被證實(shí)可在酵母細(xì)胞中作為GAL4轉(zhuǎn)錄因子激活域（GAL4 activation domain，Gal4 AD）融合蛋白表達(dá)［28-29］。肽適體類(lèi)似于抗體，又稱(chēng)類(lèi)抗體，既有類(lèi)似抗體的高親和力和特異性，又具有低毒和低免疫原性，尺寸小，在胞內(nèi)可溶表達(dá)，生產(chǎn)更快、更容易、成本更低，在抗腫瘤、抗菌、抗病毒等重要疾病的防治方面展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景［30］。酵母雙雜交技術(shù)常用于篩選靶向結(jié)合某些關(guān)鍵蛋白的特異肽適體，干擾靶蛋白的生物學(xué)功能。1989 年，F(xiàn)IELDS 等利用釀酒酵母GAL4 轉(zhuǎn)錄激活因子的特性，首次建立了酵母雙雜交系統(tǒng)，已成為發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的重要研究方法。GAL4 轉(zhuǎn)錄因子由功能上相互獨(dú)立的2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N-末端結(jié)構(gòu)域能識(shí)別結(jié)合上游激活序列（upstreaming activating sequence，UAS），又稱(chēng)為DNA 結(jié)合域（DNA-binding domain，DNA-BD）；C-末端結(jié)構(gòu)域又稱(chēng)激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）是激活轉(zhuǎn)錄所必需的，啟動(dòng)UAS 下游基因轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交系統(tǒng)由3 部分組成：與BD融合的蛋白表達(dá)載體pGBKT7，被表達(dá)的蛋白稱(chēng)誘餌蛋白（bait），與AD 融合的蛋白表達(dá)載體pGADT7，被其表達(dá)的蛋白稱(chēng)靶蛋白或獵物蛋白（prey），以及帶有報(bào)告基因的宿主菌株，如Y2HGold 酵母菌株，其報(bào)告基因?yàn)锳bAr（AbA 缺陷，可顯著降低假陽(yáng)性和背景）、HIS3（組氨酸缺陷）、ADE2（腺嘌呤缺陷你）和MEL1（X-α-gal 缺陷）。Y187 酵母菌株報(bào)告基因?yàn)閘acZ（β-半乳糖苷酶缺陷）、MEL1（X-α-gal缺陷）。同時(shí)pGBKT7質(zhì)粒具有卡那霉素抗性和色氨酸（Trp）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，pGADT7質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性和亮氨酸（Leu）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，用于質(zhì)粒的鑒定與分離。一般BD 和AD 單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，融合蛋白時(shí)需要檢測(cè)蛋白對(duì)宿主菌種毒性及自我激活能力，可顯著降低酵母雙雜交假陽(yáng)性概率。當(dāng)誘餌蛋白和獵物蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，BD 與AD 才會(huì)相互接近，形成完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)［31-32］。本研究通過(guò)將pGBKT7 及其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，pGADT 及其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后分別涂布SD／-Trp、SD／-Leu，使用AUR1-C和MEL1報(bào)告基因檢測(cè)PDL1 IgV 和hTrx 毒性及自我激活效應(yīng)，以及兩者之間是否有相互作用，在后續(xù)肽適體篩選中將會(huì)顯著降低假陽(yáng)性概率。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了人PD-L1 IgV酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并檢測(cè)出PD-L1 IgV 對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性且無(wú)自我激活效應(yīng)，且與hTrx 無(wú)相互作用。后續(xù)可利用hTrx 為骨架蛋白構(gòu)建肽適體文庫(kù)，用于篩選能與PD-L1 IgV 特異結(jié)合的肽適體，開(kāi)發(fā)靶向抑制PD-1／PD-L1信號(hào)通路的抗腫瘤肽適體藥物。