江秋虹，陶立峰 綜述，王國治，趙愛華 審校

1.安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司，安徽 合肥 230088；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

新型佐劑以及新型佐劑疫苗逐漸成為疫苗研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。美國食品藥品監(jiān)督管理局（the Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）將佐劑分為3 類：①增強(qiáng)抗原向抗原呈遞細(xì)胞和／或淋巴結(jié)的傳遞，從而改善免疫反應(yīng)，如鋁鹽和油包水乳劑，如諾華公司的MF59、葛蘭素史克公司（GSK）的AS03系統(tǒng)以及其他脂質(zhì)體；②免疫刺激劑或免疫增強(qiáng)劑，主要通過受體介導(dǎo)的信號通路來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的質(zhì)量，如單磷酸脂質(zhì)（monophosphoryl lipid，MPL）、QS21、CpG、細(xì)胞因子等；③由①和②組合而成，稱為佐劑系統(tǒng)（adjuvant system），如GSK的AS04和AS01［1］。

目前采用新佐劑的人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗、乙肝疫苗和帶狀皰疹疫苗等均已通過臨床研究證實(shí)具有較大突破，如HPV疫苗和乙肝疫苗采用AS04（因其中的組分MPL 可誘導(dǎo)更高水平的體液免疫反應(yīng)和Th1 型細(xì)胞免疫反應(yīng)）已經(jīng)上市［2］；皰疹病毒疫苗采用AS01，因脂質(zhì)體加入QS-21 和MPL 免疫增強(qiáng)劑后可明顯使機(jī)體產(chǎn)生高效價抗體并增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，已在美國和歐洲上市銷售［3-4］。美國Novavax 的新冠疫苗應(yīng)用自己開發(fā)的Matrix-M 佐劑，采用新配方增強(qiáng)了佐劑效果，且耐受性良好，分別被《歐盟委員會》和英國批準(zhǔn)有條件上市許可［5-6］；此外，國外還有多種新型佐劑（系統(tǒng)）產(chǎn)品已在開展臨床試驗(yàn)，而中國目前為止除鋁佐劑廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)生產(chǎn)，鮮有其他新型佐劑成功上市。

綜上可以看出，佐劑對提高基因工程類疫苗的免疫原性具有重要作用，開發(fā)能夠大規(guī)模生產(chǎn)且效果好的佐劑對于基因工程類疫苗意義重大。疫苗的競爭實(shí)際上是佐劑的競爭。

目前國內(nèi)外對于含有CpG 基序的寡核苷酸（CpG-ODN）佐劑疫苗報(bào)道較多，該佐劑能誘導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫，與細(xì)菌類或病毒類疫苗聯(lián)用可誘導(dǎo)較高的抗體水平和較強(qiáng)的T 輔助細(xì)胞（Th）1 類細(xì)胞免疫應(yīng)答［7-11］。CpG-ODN 來源有兩種：一種是人工合成的未甲基化CpG ODN，因其片段小，在體內(nèi)易降解，為增加其在體內(nèi)穩(wěn)定性，一般均進(jìn)行全部硫代磷酸化修飾，這種非天然堿基的加入，不但增加了合成成本，也增加了對機(jī)體作用的復(fù)雜性；第二種是原核生物，如細(xì)菌基因組DNA。前者具有代表性的CpG 1018 作為佐劑的乙肝疫苗HEPLISAV-B 在美國批準(zhǔn)上市［12］，但一度由于其安全性，經(jīng)過3 次臨床試驗(yàn)，最終才因其優(yōu)勢的療效予以批準(zhǔn)，但FDA專家仍提示上市后監(jiān)測應(yīng)特別關(guān)注其在心血管方面的副作用和安全問題［13］。

天然大分子核酸配以無機(jī)鹽與緩沖體系構(gòu)成BC 佐劑系統(tǒng)，其中天然大分子核酸是擁有自主獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的BCG-CpG-DNA 生物佐劑，是從卡介菌（BCG）中提取的富含CpG基序DNA純度極高的單一DNA，與已上市的約10 億人次臨床使用的BCG 多糖核酸（商品名：斯奇康）中的核酸為同一物質(zhì)；采用該佐劑系統(tǒng)的凍干重組結(jié)核病疫苗已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，重組帶狀皰疹疫苗（CHO 細(xì)胞）正在新藥臨床試驗(yàn)申請（investigational new drug，IND）階段，已有的研究結(jié)果均顯示安全有效［14-15］。以上研究證明該佐劑用于人體是安全的。本文對該佐劑的來源、發(fā)展歷史以及生物學(xué)活性和免疫機(jī)制的研究進(jìn)展、安全性評價等作一綜述。

1 BC佐劑來源及其發(fā)展歷史

1.1 BCG-CpG-DNA佐劑來源及其生物學(xué)特性 BCGCpG-DNA 佐劑是從目前約5億人次在臨床上使用的BCG中提取的，具有免疫刺激活性、不同大小（3 000 ～10 000 bp）、不同序列的雙鏈DNA片段混合物。免疫刺激的有效成分為含有的非甲基化的胞苷磷酸鳥苷核心及其特定的側(cè)翼序列（CpG 基序），其結(jié)構(gòu)特征為5'-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3'，CpG 有效含量為20% ～30%，該含量與全基因組DNA 中的CpG 含量基本一致。即該佐劑BCG-CpG-DNA 片段基本保留了BCG 全基因組DNA 中全部的CpG 基序［16］。基于以上特性，由于提取的DNA 片段含有大量未甲基化CpG基序，因此將其命名為BCG-CpG-DNA。

1.2 BC佐劑系統(tǒng)的發(fā)展歷史

1984年，日本TOKU-NAGA 等［17］發(fā)現(xiàn)，從BCG 中提純的核酸（MY-I）能刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，開啟了細(xì)菌DNA 免疫刺激性的研究。1995 年，KRIEG 等［18］證實(shí)，細(xì)菌DNA 中非甲基化的CpG 基序才是細(xì)菌DNA免疫刺激作用的關(guān)鍵。為模擬細(xì)菌DNA 的免疫刺激作用，合成的CpG ODN 被廣泛用在實(shí)驗(yàn)中［19］。但人工合成的CpG ODN制備成本較高。

2004年，本課題組采用機(jī)械破碎、溴化十六烷基三甲基胺（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）沉淀、酚∶氯仿∶異戊醇抽提法，從BCG 中制備BCGCpG-DNA，經(jīng)化學(xué)方法確定其理化成分［20］。首次制備一種來源于細(xì)菌提取物、并證實(shí)該佐劑本身具有免疫活性、與疫苗中抗原在體內(nèi)作用能誘導(dǎo)Th1 型為主的免疫應(yīng)答的CpG-DNA 免疫佐劑，為第一代佐劑?？紤]到第一代佐劑采用化學(xué)法提取，應(yīng)用于生產(chǎn)存在安全風(fēng)險，因此對制備工藝進(jìn)行改進(jìn)，獲得精制CpG-DNA，此為第二代佐劑；鑒于復(fù)合佐劑在發(fā)揮疫苗的免疫效用方面越來越顯著的協(xié)同佐劑優(yōu)勢，開展BCG-CpG-DNA 與鋁鹽和緩沖體系聯(lián)用構(gòu)成CpG復(fù)合佐劑（BC02）與細(xì)菌類及病毒類抗原配伍制備疫苗的安全性及有效性研究，結(jié)果顯示，免疫保護(hù)效果顯著增強(qiáng)且安全性良好，此為第三代佐劑。

1.2.1 第1代佐劑 為單一BCG-CpG-DNA佐劑（BC01，指代單一BCG-CpG-DNA，取BCG-CpG-DNA 前兩個英文字母首字母，并與復(fù)合佐劑相區(qū)分），BCG培養(yǎng)后菌體經(jīng)機(jī)械破碎、高速冷凍離心、收集上清，CTAB 沉淀、氯化鈉溶液溶解，酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，70%乙醇洗滌，溶于TE緩沖液（Tris-Cl pH 8.0）中經(jīng)透析、除菌、過濾獲得。通過核酸含量測定，確定BC01 佐劑的核酸總含量；通過CpG 有效含量測定，確定BC01 佐劑核酸中有效組分含量；通過核酸分子量測定，確定BC01 佐劑分子量范圍。大量研究證實(shí)，該新型富含CpG 基序佐劑本身具有免疫活性，作為佐劑誘導(dǎo)的是Th1 型為主的免疫反應(yīng)，機(jī)體產(chǎn)生抗體類型以IgG2a 為主，對細(xì)菌類抗原、病毒性抗原、寄生蟲類抗原均有顯著的佐劑作用，既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，也能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，提高疫苗的保護(hù)效果，可作為治療及預(yù)防用疫苗佐劑，且初步確定用于疫苗佐劑的BCG-CpG-DNA 含量為每單位劑量疫苗中10 ～250 μg／人份，該含量與抗原及疫苗種類相關(guān)，且與鋁佐劑有協(xié)同作用。該佐劑已獲得國家發(fā)明專利（200410033878.1）［20-25］。

1.2.2 第2代佐劑 為單一BCG-CpG-DNA佐劑（BC01），因第一代佐劑制備過程中使用有機(jī)溶劑酚、氯仿去除多糖、蛋白等雜質(zhì)，酚、氯仿均為有毒試劑，在制藥生產(chǎn)中使用具有潛在危險。如果用于生產(chǎn)，不但有安全隱患，產(chǎn)品中殘留量需進(jìn)行檢測，也增加了質(zhì)量控制檢測項(xiàng)目。第二代佐劑對第一代佐劑制備工藝進(jìn)行了改進(jìn)，采用離子交換層析純化的方法，從BCG菌體裂解液中直接將多糖、蛋白和RNA 等雜質(zhì)去除，經(jīng)離子交換層析置換緩沖液、超濾濃縮后，獲得高濃度、高純度的BCG菌體DNA（BCG-CpG-DNA），無有機(jī)溶劑殘留，該方法尤其適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要。該佐劑已獲得國家發(fā)明專利（201310586057.X）［26］。

1.2.3 第3 代佐劑 為BC01 佐劑與鋁鹽和緩沖體系聯(lián)用構(gòu)成CpG 復(fù)合佐劑BC02（BCG CpG DNA combination adjuvant system 02）。

研究表明，復(fù)合佐劑可在最大程度上增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答，上調(diào)對機(jī)體的全面保護(hù)，已成為佐劑研究的一個重要方向，在研制中具有巨大優(yōu)勢［27］。走在前沿的主要為GSK公司的佐劑系統(tǒng)（adjuvant systems），包括AS01 ～AS04 等。除已用于上市制品的AS04、AS01，AS02（MPL 與QS21 水包油系統(tǒng)）用于瘧疾疫苗及結(jié)核病疫苗并已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，AS01 用于結(jié)核病疫苗M72：AS01二期臨床試驗(yàn)已獲得較好成果，在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的HIV 陰性成人體內(nèi)接種后的3 年內(nèi)，降低肺結(jié)核發(fā)病率的總效力約為50%，有望在結(jié)核病防控中發(fā)揮重要作用［8，27-30］。

研究表明，CpG DNA分別與鋁鹽、MF59、脂質(zhì)體、poly I：C聯(lián)用，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌類及病毒類疫苗臨床及臨床前研究中。GSK 擬將CpG DNA 與MPL、QS21、脂質(zhì)體（liposomes）聯(lián)用，應(yīng)用于腫瘤疫苗的研究中；另有CpG DNA 與宿主防御性多肽和聚磷腈構(gòu)建的復(fù)合佐劑模型，聯(lián)合多種疫苗抗原在動物和人類疫苗的廣泛試驗(yàn)中均獲得穩(wěn)定和高效的免疫效果［7-11］。

本課題組采用BC01 佐劑配以鋁鹽與緩沖體系構(gòu)成的CpG復(fù)合佐劑（BC02）配伍細(xì)菌類抗原和病毒類抗原開展藥效學(xué)評價，已完成的研究結(jié)果顯示，采用BC02 佐劑的凍干重組結(jié)核病疫苗（AEC／BC02）可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染豚鼠具有預(yù)防保護(hù)效果，臨床前安全性評價良好。2015年，新型結(jié)核病疫苗是國內(nèi)唯一獲得國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的人體臨床試驗(yàn)批件（批件號：2015L-00704）的疫苗［22，29，31］。采用BC02佐劑的重組帶狀皰疹疫苗免疫原性評價研究結(jié)果顯示，該佐劑與鋁佐劑協(xié)同作用，可提高IFNγ、IL-2 分泌水平；促進(jìn)抗gE蛋白特異性抗體及亞型，尤其是Th1 型IgG2a 的產(chǎn)生；提高水痘病毒（疫苗株）特異性抗體水平，促進(jìn)產(chǎn)生抗野毒株的抗體，誘導(dǎo)水痘病毒（疫苗株）和野毒株特異性中和抗體產(chǎn)生［15］。目前該項(xiàng)目正在申報(bào)IND階段中。

由于BCG-CpG-DNA 佐劑作用的廣譜性，未來也可與更多其他佐劑聯(lián)合使用作為細(xì)菌類或病毒類疫苗的佐劑，推動該佐劑向更深代次的研究，在未來疫苗開發(fā)中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

2 BC佐劑系統(tǒng)生物學(xué)活性研究進(jìn)展

將BCG-CpG-DNA 單獨(dú)或聯(lián)合Al（OH）3配伍不同細(xì)菌類、病毒類及寄生蟲類抗原，評價其對不同疫苗的免疫佐劑作用。

2.1 對重組結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85b 的作用 將重組結(jié)核分枝桿菌Ag85b 分別與鋁佐劑、BCG-CpGDNA 或鋁佐劑+ BCG-CpG-DNA 免疫小鼠，同時設(shè)PBS、BCG 對照組，評價INFγ分泌水平及對潛伏感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv豚鼠的疫苗保護(hù)力。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 對重組結(jié)核分枝桿菌Ag85b 有佐劑作用，表現(xiàn)在該佐劑能提高抗原特異性IFNγ 分泌水平，與鋁佐劑聯(lián)用，能提高感染動物保護(hù)效力，表現(xiàn)為已感染的動物經(jīng)疫苗治療后，臟器病變陰轉(zhuǎn)率提高，動物臟器病變指數(shù)降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）［21］。

2.2 對重組HBsAg的作用 將HBsAg單獨(dú)或分別聯(lián)合鋁佐劑、BCG-CpG-DNA 或鋁佐劑+ BCG-CpGDNA 免疫小鼠，檢測特異性抗-HBs 中和抗體水平、抗-HBs IgG 亞型、細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞功能、分泌IL-4水平。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 對重組HBsAg 具有較好的免疫佐劑作用，能提高抗-HBs中和抗體水平，促進(jìn)抗原特異性IgG2a 產(chǎn)生，誘導(dǎo)Th1 型免疫應(yīng)答，與鋁佐劑協(xié)同作用能部分逆轉(zhuǎn)Th2 反應(yīng)，同時能增強(qiáng)抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷作用［20］。

2.3 對A群腦膜炎球菌多糖疫苗的作用 將BCG-CpGDNA 與流腦多糖疫苗共同免疫小鼠3 次，評價其對小鼠IgG、IgG1 和IgG2a 抗體水平變化的影響。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 對A 群腦膜炎球菌多糖疫苗具有免疫佐劑作用，可提高A 群腦膜炎球菌多糖疫苗特異性IgG 抗體水平，并能促進(jìn)特異性抗體亞類的產(chǎn)生［20］。

2.4 對H1N1 流感疫苗的佐劑作用 用H1N1 流感疫苗單獨(dú)或聯(lián)合BCG-CpG-DNA 免疫小鼠，同時設(shè)PBS 對照組，檢測血凝抑制（haemagglutination inhibition，HI）抗體及抗體亞類。結(jié)果表明，BCG-CpGDNA 對H1N1 流感疫苗具有佐劑作用，可促進(jìn)抗體提前產(chǎn)生，縮短動物血清陽轉(zhuǎn)時間，HI抗體水平提高2 ～3 倍，對抗原特異性IgG1 水平影響不大，但能顯著性提高IgG2a水平［20］。

2.5 對狂犬病疫苗的佐劑作用 用狂犬病疫苗單獨(dú)或聯(lián)合BCG-CpG-DNA、單獨(dú)BCG-CpG-DNA 分別免疫小鼠各2 次，于第7 ～14、28、42 天經(jīng)眼眶采血，快速免疫熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）檢測血清抗體效價，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）檢測脾淋巴細(xì)胞經(jīng)狂犬病病毒抗原刺激后分泌的IFNγ及IL-2 水平。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 對狂犬病疫苗有佐劑作用，從初次免疫第7天開始至第42天，狂犬病疫苗聯(lián)合BCG-CpG-DNA 組血清中和抗體效價及IFNγ、IL-2水平均高于純病毒抗原組，并高于純病毒抗原組與純佐劑組之和；第14 天時，上述兩組小鼠血清抗體效價均達(dá)峰值，且差異最大。證實(shí)佐劑的加入可刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫，并產(chǎn)生持續(xù)的高水平細(xì)胞免疫應(yīng)答［23］。

2.6 對弓形蟲STAg 疫苗的佐劑作用 將STAg 單獨(dú)或分別與BCG-CpG-DNA、Al（OH）3、Al（OH）3+BCGCpG-DNA 免疫小鼠，設(shè)生理鹽水對照組，抗體水平、抗體效價及特異性INFγ 淋巴細(xì)胞數(shù)量檢測結(jié)果表明，STAg 聯(lián)合BCG-CpG-DNA 和鋁鹽能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，鋁鹽與BCG-CpGDNA佐劑聯(lián)用對弓形蟲STAg具有免疫協(xié)同效應(yīng)［24］。

2.7 對新冠DNA 疫苗的佐劑作用 將pSV10-SARSCoV-2單獨(dú)或聯(lián)合BC01佐劑、單獨(dú)BC01佐劑免疫小鼠，設(shè)PBS對照組，ELISA法檢測血清抗體結(jié)合滴度、疫苗對當(dāng)前流行假病毒D614G、D614G + I472V、L452R 和V483A產(chǎn)生的突變體的中和能力，ELISPOT檢測IFNγ 和IL-2 細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果表明，BC01佐劑可促進(jìn)小鼠中和抗體的早期產(chǎn)生，促進(jìn)DNA 疫苗中和全部假病毒變異體，增加了IFNγ 和IL-2 斑點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量。采用BC01 佐劑DNA 疫苗組合物可用于預(yù)防和／或治療冠狀病毒感染和／或由感染引起的疾?。?5］。

綜上所述，BCG-CpG-DNA 對不同細(xì)菌類、病毒類、寄生蟲類抗原均具有免疫佐劑作用，既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，也能誘導(dǎo)體液免疫，免疫反應(yīng)類型以Th1 型為主?？擅黠@增強(qiáng)抗原特異性抗體IgG水平，顯著提高IgG2a水平。BCG-CpG-DNA 佐劑與鋁佐劑協(xié)同作用，可明顯逆轉(zhuǎn)單獨(dú)鋁佐劑疫苗誘導(dǎo)的Th2 反應(yīng)并向Th1轉(zhuǎn)化。與新冠DNA 疫苗聯(lián)用誘導(dǎo)了更高滴度的中和抗體和更廣范圍的假病毒突變體，這在全球新冠大規(guī)模流行及新的病毒突變株不斷出現(xiàn)的今天，更具有現(xiàn)實(shí)意義。

3 BC佐劑系統(tǒng)免疫機(jī)制的研究進(jìn)展

BC佐劑系統(tǒng)通過以下免疫機(jī)制發(fā)揮佐劑作用。

3.1 刺激固有免疫 LI 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，BC 佐劑中的BCG-CpG-DNA 本身在信號通路水平上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中關(guān)鍵蛋白分子的磷酸化水平；在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）轉(zhuǎn)錄；在細(xì)胞因子分泌水平促進(jìn)TNF-α 和MCP-1、IFNγ、IL-6及IL-17 等細(xì)胞因子分泌；在細(xì)胞功能水平促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）增殖，上調(diào)MHC-Ⅱ分子和其他共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達(dá)、促進(jìn)吞噬抗原能力。其對固有免疫刺激作用主要依賴于TLR-9 受體存在，是有效的TLR-9 受體激動劑。BC 佐劑中的鋁佐劑與BCG-CpG-DNA 有協(xié)同刺激作用［32］。

3.2 提高免疫應(yīng)答速度、延長免疫反應(yīng)持續(xù)時間 LI等［15］研究發(fā)現(xiàn)，BC 佐劑與抗原配伍后，初次免疫后7 d即能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，末次免疫后24周仍維持一定水平細(xì)胞免疫、體液免疫與免疫記憶能力，與抗原對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。

3.3 增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng) LI 等［15］和ZHOU等［25］研究發(fā)現(xiàn)，BC 佐劑與抗原配伍后，能顯著提升分泌抗原特異性IFNγ與IL-2的T細(xì)胞數(shù)量。

3.4 增強(qiáng)體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)抗體亞類與活性 研究發(fā)現(xiàn)，BC 佐劑與抗原配伍后，能顯著提升IgG 滴度，提高IgG2a／IgG1 比例［15］，增強(qiáng)抗體中和活性［15，25］。

3.5 促進(jìn)免疫記憶 LI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，BC 佐劑與抗原配伍后，能顯著提升記憶T細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)量。

4 BC佐劑系統(tǒng)非臨床安全性評價

該項(xiàng)評價參考文獻(xiàn)［33］，以小鼠、大鼠、豚鼠、Beagle 犬等動物為研究對象，采用肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射等多種方式，進(jìn)行了一般藥理學(xué)研究、急性毒性試驗(yàn)、長期毒性試驗(yàn)、肌肉刺激試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、全身主動過敏試驗(yàn)、微生物回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)、生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)等，上述研究委托浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心完成。

4.1 一般藥理學(xué)研究 采用不同動物種屬（小鼠、犬）肌肉注射方式，BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）7 500、3 750、1 875 μg／kg 劑量對小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響；犬心血管及呼吸系統(tǒng)試驗(yàn)中，300 μg／kg 劑量對犬僅有R 波幅度升高的影響。BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)對小鼠的無毒副反應(yīng)出現(xiàn)劑量大于7 500 μg／kg，犬顯示毒性的劑量為300μg／kg，無毒副反應(yīng)出現(xiàn)劑量為150μg／kg。

4.2 急性毒性試驗(yàn) 采用不同動物種屬（小鼠、大鼠、豚鼠）單次肌肉注射方式，BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）150 μg／kg 劑量未見異常反應(yīng)，未見動物死亡，未顯示靶器官（靶組織）中毒，體質(zhì)量隨試驗(yàn)時間延長而增加。小鼠、大鼠兩種動物模型組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，給藥組動物的給藥局部有白色或土黃色小結(jié)節(jié)，觸摸較硬；其余臟器未見異常病理變化。鏡下可見給藥組動物均出現(xiàn)給藥部位受試物沉積并形成異物肉芽腫樣結(jié)節(jié)，分析是給予的受試物在局部蓄積、沉積后，機(jī)體刺激性反應(yīng)導(dǎo)致。

4.3 長期毒性試驗(yàn) 采用8次重復(fù)肌肉注射方式，BCGCpG-DNA復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）500、100和20μg／kg劑量對Beagle 犬一般行為、體質(zhì)量、體溫、攝食、血液學(xué)、生化學(xué)、心電、尿液、眼科、臟器重量和系數(shù)未見明顯影響，免疫原性上引起B(yǎng)eagle 犬的體液免疫應(yīng)答［抗藥物抗體（anti-drug antibody，ADA）的生成］，病理剖檢大體觀察和病理組織檢查發(fā)現(xiàn)給藥部位及給藥部位淋巴結(jié)與劑量相關(guān)的受試物沉積（停藥后檢查），500 和100μg／kg 劑量組犬給藥部位及其淋巴結(jié)出現(xiàn)劑量相關(guān)的受試物沉積和單核細(xì)胞增生，恢復(fù)期結(jié)束后雖略有減輕但仍存在，給藥部位由于受試物沉積而出現(xiàn)異物肉芽腫樣結(jié)節(jié)；20μg／kg 劑量組給藥部位出現(xiàn)受試物沉積和單核細(xì)胞增生，淋巴結(jié)髓質(zhì)出現(xiàn)反應(yīng)性增生。二期檢查各劑量組犬腸系膜淋巴結(jié)、給藥部位肌纖維和其他臟器均未見明顯異常。在試驗(yàn)劑量條件下，Beagle 犬肌肉注射給予BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）主要毒性靶器官是給藥部位及給藥部位淋巴結(jié)，無毒副反應(yīng)劑量低于20μg／kg。

4.4 肌肉刺激試驗(yàn) 采用單次肌肉注射方式，在150μg／次劑量條件下，BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）對兔股四頭肌無刺激反應(yīng)。

4.5 溶血試驗(yàn) 按常規(guī)動物溶血試驗(yàn)方法，BCGCpG-DNA復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）無溶血和凝集作用。

4.6 全身主動過敏試驗(yàn) 采用3 次肌肉注射致敏和1 次靜脈注射激發(fā)方式，BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）對豚鼠在致敏和激發(fā)期間，高低劑量（37.5μg、7.5μg）組均未見異常反應(yīng)；其首次致敏、末次致敏和激發(fā)時的平均體質(zhì)量與相應(yīng)時間的0.9% NaCl 注射液陰性對照組相似（P＞0.05）。表明BC02高低劑量對豚鼠無過敏反應(yīng)。

4.7 遺傳毒性試驗(yàn) 采用平板摻入法，BCG-CpG-DNA復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）的微生物回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)結(jié)果為陰性；采用單次肌肉注射方式，BC02 對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞未見誘發(fā)微核的作用；采用中國倉鼠肺細(xì)胞株（CHL）為靶細(xì)胞，有絲分裂中期染色體為檢測對象，BC02 對中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞的染色體畸變誘發(fā)作用為陰性。

4.8 生殖毒性試驗(yàn) 將雌、雄SD 大鼠于合籠前分別2 和5 次肌肉注射BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）750、150 和30 μg／（kg·次）后，按1∶1 比例合籠，BC02 對大鼠無明顯的親代一般毒性；對雌雄大鼠的生殖機(jī)能及生育力無明顯毒性；對大鼠胚胎形成及早期胚胎發(fā)育未見明顯影響；可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗藥物抗體，但未形成循環(huán)免疫復(fù)合物；無毒副反應(yīng)劑量≤750μg／（kg·次）。

將雌鼠合籠前及孕后共3 次肌肉注射750、150、30μg／kg BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02），未見明顯母體毒性、胚胎-胎仔發(fā)育毒性及致畸作用；可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答及抗藥物抗體，并在少數(shù)高劑量組大鼠體內(nèi)形成循環(huán)免疫復(fù)合物；無毒副反應(yīng)劑量≤750μg／（kg·次）。

綜上所述，BCG-CpG-DNA 復(fù)合佐劑系統(tǒng)（BC02）非臨床安全性評價結(jié)果表明，該復(fù)合佐劑系統(tǒng)是安全的，為臨床研究提供了參考。

5 BC佐劑系統(tǒng)臨床安全性評價

BCG-CpG-DNA 佐劑原液已用于凍干重組結(jié)核病疫苗（AEC／BC02）（ClinicalTrials.gov登記號：NCT-03026972）。2018 年9 月在上海市公共衛(wèi)生臨床中心完成該疫苗的Ⅰa 期臨床研究。Ⅰa 期選擇25 名結(jié)核分枝桿菌未感染人群［TB-PPD 皮試和Quanti-FERON-TBGold（QFT）檢測均陰性，簡稱PPD-QFT-］作為受試者，包括安慰劑組5 名、低劑量佐劑組10名、低劑量疫苗組10 名。采用臀部肌肉注射方式，初步評價了6 劑次（每劑間隔2 周）試驗(yàn)疫苗的安全性和耐受性。結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗在結(jié)核分枝桿菌未感染人群中安全性和耐受性良好，可繼續(xù)開展下一步臨床試驗(yàn)。Ⅰb 期臨床研究于2020 年5 月在武漢市傳染病醫(yī)院啟動，旨在通過結(jié)核病疫苗不同接種部位（上臂三角肌注射途徑）的接種方式，評價疫苗安全性和耐受性。截止目前，已完成所有受試者全程免疫后6 個月的安全性觀察等現(xiàn)場工作，未發(fā)生1 例嚴(yán)重不良事件，不良反應(yīng)以Ⅰ級和Ⅱ級為主，主要為注射部位疼痛，無Ⅲ級及以上不良反應(yīng)發(fā)生，臨床試驗(yàn)安全性結(jié)果顯示疫苗安全性良好［29，31］。

6 總結(jié)及展望

新型佐劑的使用可能引發(fā)疫苗學(xué)的一場新革命［34］。理想的佐劑對免疫系統(tǒng)有廣泛影響，既可有效激活體液和細(xì)胞免疫，又可在普通人群中使用仍具有良好的安全性和耐受性。正在研發(fā)的佐劑有上百種，但受限于安全性和有效性等因素，已上市預(yù)防性疫苗佐劑僅8 種，而我國目前疫苗使用佐劑為傳統(tǒng)鋁佐劑，大多數(shù)佐劑被國外制藥公司（如GSK 等）控制，需獲得許可方可在臨床上使用。因此，應(yīng)大力推動國內(nèi)優(yōu)良候選佐劑進(jìn)入臨床研究。

新型BC 佐劑系統(tǒng)中BC01 非甲基化CpG 基序決定了其作用不具有種屬差異性，最大程度地保留了免疫刺激成分，工藝可控，可節(jié)約生產(chǎn)成本，適與其他佐劑構(gòu)成佐劑系統(tǒng)發(fā)揮強(qiáng)大免疫刺激作用，并可同時誘導(dǎo)機(jī)體形成Th1和Th2型免疫應(yīng)答，幾乎對所有蛋白質(zhì)抗原和滅活疫苗均具有佐劑作用，在與其他佐劑合用時還可彌補(bǔ)其他佐劑誘導(dǎo)Th2 型免疫應(yīng)答的缺陷。此外，一些不能與Al（OH）3膠佐劑混合的減毒活疫苗或多價疫苗中，BC01 可作為佐劑單獨(dú)使用，甚至與新冠DNA 疫苗聯(lián)用在提高中和抗體滴度和對抗病毒突變株上，具有獨(dú)特潛力。另外，BC01佐劑還可刺激機(jī)體產(chǎn)生較早、較持久的免疫應(yīng)答，在免疫原性較弱和免疫原數(shù)量較少時尤為重要，為上述方面的研究提供了全新選擇。復(fù)合佐劑BC02 組成成分的Al（OH）3無機(jī)鹽佐劑與BC01 生物佐劑在激活機(jī)體固有免疫應(yīng)答上具有協(xié)同加強(qiáng)作用。與常用CpG 相比，最大區(qū)別是其為微生物來源的大分子量天然CpG DNA，而常用CpG為人工合成小分子ODN。BCG-CpG-DNA 結(jié)構(gòu)為雙鏈DNA，常用CpG 為單鏈DNA，兩者免疫刺激的有效成分均為未甲基化CpG基序，在免疫刺激性上均為CpG 與TLR-9 受體結(jié)合而刺激免疫反應(yīng)，作用基本一致。BC01 佐劑除制備優(yōu)勢外，最大優(yōu)勢在于安全性和人體使用劑量，BCGCpG-DNA 佐劑每人用劑量約100μg，遠(yuǎn)低于已上市乙肝疫苗Heplisav-B 中采用的CpG 1018（3 mg）［12-13］和正在進(jìn)行Ⅱ／Ⅲ期臨床的新冠疫苗（SCB-2019）（三葉草生物制藥有限公司）中采用的CpG 1018（1.5 mg）［9，35］。在當(dāng)前全球疫苗分配不公、可及性問題日漸突出前提下，BC 佐劑系統(tǒng)在疫苗研發(fā)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中具有獨(dú)特優(yōu)勢。

BC佐劑系統(tǒng)為一種新型免疫佐劑系統(tǒng)，由于BCGCpG-DNA本身具有免疫刺激作用，特別是對細(xì)胞免疫和抗體反應(yīng)的增強(qiáng)作用，其作為疫苗佐劑具有有效性、安全性及通用性，且質(zhì)量可控，并已獲得2 項(xiàng)專利授權(quán)［20-26］，可促進(jìn)疫苗的量產(chǎn)、可及性和可負(fù)擔(dān)性，為其應(yīng)用于重大傳染病新疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

但BCG-CpG-DNA 佐劑系采用機(jī)械破碎方式從BCG中提取DNA，因此BCG-CpG-DNA佐劑是隨機(jī)斷裂成的大小為3 000 ～10 000 bp 的DNA 片段，雖采用核酸含量、分子量、CpG 有效含量測定作為不同批次BCG-CpG-DNA 佐劑一致性的評價指標(biāo)，但仍需開展充分的結(jié)構(gòu)確證及質(zhì)量控制，以確定不同批次間佐劑質(zhì)量的一致性。

隨著對BC 佐劑系統(tǒng)免疫佐劑活性和質(zhì)控研究的不斷深入，其獨(dú)特的優(yōu)勢會越來越受到醫(yī)用生物制品研發(fā)者的重視，應(yīng)用前景將更加廣闊，可能會從根本上解決佐劑這一疫苗行業(yè)國內(nèi)存在短板的問題。