吳嘉康 鄭詩凡 游訓(xùn)儀 王紅 徐瑩璨 鐘銳 劉嘉馨

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所，四川 成都 610052)

糖尿病足部潰瘍是糖尿病最為常見的并發(fā)癥之一，有報(bào)道指出，約30%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)慢性不愈合創(chuàng)面，且一年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)40%[1]。 隨著研究的不斷深入，創(chuàng)面形成被認(rèn)為是細(xì)胞組織功能受限或病變而導(dǎo)致內(nèi)源性生物因子的缺乏等多因素造成，可通過局部遞送外源性藥物來提高創(chuàng)面愈合的質(zhì)量[2]。

微針(microneedles， MNs)是一種新型經(jīng)皮給藥技術(shù)，相較于傳統(tǒng)糖尿病敷料，通過刺破皮膚形成微小通道，繞過存在于慢性創(chuàng)面中的理化屏障，可將大分子藥物遞送至皮膚深處，可極大提高藥物遞送效率，降低藥物損失率，提高生物利用率[3]。按照結(jié)構(gòu)和釋藥方式的不同，微針可分為可溶微針、實(shí)心不溶微針、空心微針和涂層微針[4]。 其中可溶微針采用生物相容性良好，穩(wěn)定易降解的生物醫(yī)用材料如透明質(zhì)酸，殼聚糖等制備而成，兼具皮下注射與皮膚貼片的雙重優(yōu)勢，在治療糖尿病創(chuàng)面領(lǐng)域中有著巨大潛力[5]。 富血小板血漿(plateletrich plasma，PRP)是通過離心全血后制備成的血小板高度濃縮的血漿制劑。 這種制劑富含各種血小板相關(guān)生長因子，近年來已被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)、韌帶和肌肉等損傷修復(fù)中[6-7]。 PL 是在PRP 的基礎(chǔ)上，采取反復(fù)凍融的方法或加入血小板激活劑，激活PRP 中高濃度的血小板，使其活化釋放大量生長因子后再去除血小板所得到的制劑[8-9]。 有文獻(xiàn)表明PL 中含有豐富轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子等生長因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，刺激細(xì)胞趨化性，在組織修復(fù)方面效果卓越的基礎(chǔ)[10-12]。

本研究使用羧甲基殼聚糖與聚乙烯基吡咯烷酮K-60 的復(fù)合材料為針體材料、聚乙烯基吡咯烷酮40000，透明質(zhì)酸與D-山梨醇的復(fù)合材料為背襯材料制備負(fù)載PL 的微針貼片，通過對微針陣列的整體形貌、壓變實(shí)驗(yàn)、微針測力等，生長因子含量以及糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合效果評價(jià)等，考察PL 微針的療效，為糖尿病組織修復(fù)方面提供一種新思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 血小板來源

濃縮血小板由成都市血液中心提供，取回后于血小板震蕩箱中22℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，6 ～8 周齡，體重(20±2)g【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SCXK[湘]2019-0004，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司】實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用已通過倫理審查委員會(huì)評審。

1.3 主要儀器與試劑

真空泵(AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；集熱式磁力攪拌器[MS-H280-Pro，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]；真空干燥器；高清測量工具顯微鏡(GP-490，昆山高品精密儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(ALLEGRAX-15R，BECKMAN COULTER 公司)； 高級型數(shù)字測力儀(M5-5，MARK-10 公司)；圓錐可溶微針PDMS 凹模具(針長600 μm，底部尺寸300 μm，陣列數(shù)量20×20)；石蠟包埋機(jī)(JB-L5，武漢俊杰電子)；脫色搖床(SLK-03000-S，SCILOGEX)；正置光學(xué)顯微鏡(DM500，Leica)；羧甲基殼聚糖(CMCS，批號C12864697，上海麥克林生化科技有限公司)；DAB 顯色劑(20X)(BL732A，biosharp)；人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:CSB-E11718h，武漢華美生物工程有限公司)；蘇木素染液(BL700B，biosharp)；聚乙烯吡絡(luò)烷酮K-60(PVPK-60，批號BSF210317，合肥巴斯夫生物科技有限公司)；聚乙烯吡絡(luò)烷酮40000(PVP，平均分子量40000，批號No.505X044，北京索萊寶科技有限公司)；低分子透明質(zhì)酸鈉(HA-TLM 20-40，批號20110241，華熙生物科技股份有限公司)；D-山梨醇(批號No.324R021，北京索萊寶科技有限公司)；人血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:CSB-E08923h，武漢華美生物工程有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 針體材料的配制

1)60 mg/mL CMCS、明膠混合溶液:將CMCS 與明膠按質(zhì)量比5 ∶3溶解于超純水中，50℃溫水浴并持續(xù)攪拌，待材料充分溶脹，自然冷卻；2)60 mg/mL CMCS 與不同濃度PVPK-60 混合溶液:分別稱取一定量的PVPK-60 與CMCS 溶解于超純水中，室溫靜置待材料充分溶脹，依次配制成濃度為20、30、40、50、60 mg/mL PVPK-60 與60 mg/mL CMCS 的溶液。

1.4.2 背襯材料的配制及篩選

1)500 mg/mL HA 溶液:將HA 溶解于超純水中，室溫靜置待材料充分溶脹，2 000 g 離心10 min去除氣泡；2)15 mg/mL HA，250 mg/mL PVP40000混合溶液:將HA 與PVP40000 混合粉末溶解于超純水中，再加入26.5 mg/mL D-山梨醇，50℃溫水浴并持續(xù)攪拌1 ～2h 至材料充分溶脹，冷卻后室溫2 000 g離心10 min 去除氣泡。 為考察材料的成型性能與穩(wěn)定性，篩選出制備微針的最佳背襯材料，以背襯平整度、背襯韌性、氣泡含量、脫模難易度與針型為指標(biāo)對背襯材料進(jìn)行綜合打分。

1.4.3 針體材料的篩選

1)砝碼壓變實(shí)驗(yàn):參考文獻(xiàn)[4]的方法，計(jì)算微針壓變前后的平均高度與彎折率。 2)力學(xué)實(shí)驗(yàn):使用高級型數(shù)字測力儀，測得PL 微針平均受力情況及形變程度，從而選出最佳濃度。

1.4.4 微針制備工藝

取150 μL 針體溶液倒入模具中，室溫下2 500 g離心10 min，抽真空至約-0.08 MPa，室溫下保持12 min，取出模具刮去多余針體溶液，加入約150 μL背襯溶液后，抽真空至約-0.08 MPa，保持12 min，刮去溶液并重新加入約250 μL 背襯溶液，然后將模具放置干燥器中過夜干燥，干燥器溫度維持在24℃左右，濕度維持在18%。

1.4.5 PL 的制備

參照文獻(xiàn)[13]的方法，將冷凍保存的濃縮血小板反復(fù)凍融6 次，在第6 次解凍后，室溫下3 100 g離心23 min，棄掉沉淀，將上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 PL 微針的制備及表征

1)PL 微針的制備， 根據(jù)“1.4.4 項(xiàng)”方法，將材料溶解于PL 中制備微針。 2)PL 微針表征:①形貌高度，用高清顯微鏡觀察針體形貌與高度；②生長因子含量檢測，將微針置于0.5 mL PBS 溶液中，待微針完全溶解后采用ELISA 試劑盒的方法檢測溶液中生長因子含量。

1.4.7 糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合效果評價(jià)

1)糖尿病小鼠模型的建立及創(chuàng)面的制備:將小鼠禁食10 h(過夜禁食不禁水)，稱重后尾尖采血，記錄血糖水平，按照小鼠體重120 mg/kg 的劑量，單次腹腔注射1%STZ 溶液。 造模后3 d 后，測定其空腹血糖，當(dāng)空腹血糖值高于11.10 mmol/L 視為模型建立成功。 麻醉小鼠后，將脫毛膏均勻涂抹于背部，等待數(shù)分鐘后將脫毛膏擦凈，裸露出無毛粉嫩的皮膚，用打孔器在脫毛區(qū)中部制造1 個(gè)直徑1.0 cm的全皮層損傷創(chuàng)面。 2)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合效果評價(jià): 根據(jù)“1.4.6 項(xiàng)”建立糖尿病小鼠創(chuàng)面模型，將16 只糖尿病小鼠隨機(jī)每組4 只分為4 組，分別采用PL 微針治療、不含有PL 的空白微針治療、PL 涂抹的方式治療、不做任何處理的對照組，在d0，d2，d4 給予治療，并于d0，d2，d4，d6，d8，d10拍照記錄創(chuàng)面變化情況，根據(jù)創(chuàng)面面積計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率(At)。 At ＝×100% 注:S0為術(shù)后即刻創(chuàng)面面積；St 為t 時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面面積；At 為t 時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率。 3)取材: d10 采用戊巴比妥鈉過量麻醉的方式處死各組小鼠。 在無菌環(huán)境下，切下整個(gè)創(chuàng)面組織后將其置于固定液中固定，然后經(jīng)脫水，包埋等步驟進(jìn)行后續(xù)處理。 4)蘇木素伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H＆E):將組織石蠟切片按照蘇木素染色、伊紅染色、脫水、鏡檢等步驟進(jìn)行后續(xù)處理。 5) 免疫組化: 將切片脫蠟，水化，經(jīng)抗原修復(fù)等步驟，分別在切片上滴加IL-6(1 ∶200)，TGF-β(1 ∶200)，CD31(1 ∶100)，并將其置于濕盒4℃孵育過夜，隨后滴加二抗標(biāo)記并進(jìn)行DAB 顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。 最后各組內(nèi)每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野拍照。 采用Image-Pro-Plus6.0 分析軟件。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraghPad8.0.2 版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理和分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)”表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針體材料篩選結(jié)果

材料為CMCS 與明膠時(shí)，針體溶液流動(dòng)性差，成針后高度較低，針體不飽滿，充斥氣泡，針型不均一，成針效果差。 材料為CMCS 與PVPK-60 時(shí)，各個(gè)濃度溶液流動(dòng)性好，成針后整高度較高，針體飽滿銳利，無彎曲變形，受到一定壓力時(shí)未出現(xiàn)斷針。5 種不同PVPK-60 濃度微針砝碼壓變實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，圖1。 力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，當(dāng)PVPK-60 濃度為40 mg/mL 時(shí)，PL 微針機(jī)械強(qiáng)度最高。 位移從0 μm增加到200 μm，每根針的壓力從0 N 增加到≈1.5 N，最終選取PVPK-60 濃度為40 mg/mL。

圖1 5 種不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變前形貌Figure 1 Morphology of CMCS microneedles before compression change at five different PVPK-60 concentrations

圖2 5 種不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針的力學(xué)-位移曲線Figure 2 Mechanical-displacement curves of CMCS microneedles at five different PVPK-60 concentrations

表1 不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變性能(±s，n＝10)Table 1 Crushable properties of CMCS microneedles with different PVPK-60 concentrations (±s，n＝10)

表1 不同PVPK-60 濃度的CMCS 微針壓變性能(±s，n＝10)Table 1 Crushable properties of CMCS microneedles with different PVPK-60 concentrations (±s，n＝10)

壓變前50 g砝碼100 g砝碼200 g砝碼針體濃度高度(μm) 503±2503±2492±5 463±10(20 mg/mL) 彎折率(%)-02±18±2針體濃度高度(μm) 504±5504±5487±5483±9(30 mg/mL) 彎折率(%)-03±04±1針體濃度高度(μm) 503±2503±2488±9481±7(40 mg/mL) 彎折率(%)-03±14±1針體濃度高度(μm) 509±3509±3 490±10 486±11(50 mg/mL) 彎折率(%)-04±14±2針體濃度高度(μm) 505±2505±2486±6478±6(60 mg/mL) 彎折率(%)-04±15±1

2.2 背襯材料篩選結(jié)果

按照文獻(xiàn)[14]的標(biāo)準(zhǔn)對2 種背襯材料進(jìn)行評分，A:500 mg/mL HA；B:15 mg/mL HA＋250 mg/mL PVP40000＋26.5 mg/mL D 山梨醇。 評分結(jié)果見表2，最終選擇B 作為背襯材料。

表2 不同背襯材料評分結(jié)果Table 2 Scoring results for different backing materials

2.3 PL 微針的形貌特征

本研究所制備的PL 微針陣列完整，針體飽滿，針尖銳利，整體高度約為(518±4)μm(圖3)。

圖3 PL 微針整體高度及形貌特征Figure 3 The overall height and morphological characteristics of PL microneedles

2.4 PL 微針生長因子檢測結(jié)果

結(jié)果如表3 所示，本研究制備的PL 中PDGFBB 含量為(18 741±1 287)pg/mL，VEGF 含量為(625±35)pg/mL，符合文獻(xiàn)[15]中的報(bào)道。 將PL制成微針后生長因子濃度仍能保持一半以上，表明本研究制備的PL 微針具有一定生物活性。

表3 PL 及PL 微針的生長因子含量Table 3 Growth factor content of PL and PL microneedles

2.5 糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合效果評價(jià)

創(chuàng)面大體觀結(jié)果如圖4 所示，PL 微針組愈合率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前3 組，有明顯差異。 在d6 時(shí)，PL 微針組小鼠創(chuàng)面愈合率為(83±5)%，PL 涂抹組小鼠創(chuàng)面愈合率為(64±4)%，空白微針組小鼠創(chuàng)面愈合率為(58±4)%，對照組小鼠創(chuàng)面愈合率為(52±4)%。 結(jié)果提示使用PL 微針有助于糖尿病小鼠傷口愈合。

圖4 糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合情況Figure 4 Wound healing in diabetic mice

2.6 PL 微針對糖尿病小鼠創(chuàng)面組織病理變化

對d10 小鼠傷口組織進(jìn)行H＆E 染色，結(jié)果如圖5 所示，空白微針組出血點(diǎn)最多，PL 微針組相較于其他三組，炎細(xì)胞浸潤及出血點(diǎn)較少，新生毛細(xì)血管數(shù)量較多，皮膚組織結(jié)構(gòu)較清晰。 結(jié)果提示使用PL 微針有助于糖尿病小鼠傷口愈合。

圖5 不同治療方式對糖尿病小鼠傷口愈合的影響Figure 5 Effect of different treatment modalities on wound healing in diabetic mice

2.7 PL 微針對糖尿病小鼠創(chuàng)面的抗炎作用

本實(shí)驗(yàn)選用促炎因子IL-6 和抗炎因子TGF-β對糖尿病小鼠創(chuàng)面組織切片進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果如圖6 所示，對照組IL-6 表達(dá)量明顯升高，空白微針組陽性區(qū)域與對照組相比無明顯差異，PL涂抹組與PL 微針組IL-6 表達(dá)量明顯下降，與對照組和空白微針組有顯著差異；而TGF-β 對照組表達(dá)量明顯下降，空白微針組與PL 涂抹組陽性區(qū)域與對照組相比無明顯差異，PL 微針組TGF-β 表達(dá)量明顯上升，與前三組均有顯著差異。 以上結(jié)果提示，使用PL 對糖尿病小鼠創(chuàng)面有一定抗炎作用，PL 微針的抗炎作用優(yōu)于PL 涂抹。

2.8 PL 微針對小鼠組織中血管新生的影響

本實(shí)驗(yàn)選用血管標(biāo)記物CD31 對傷口組織切片進(jìn)行免疫組化染色。 圖7 所示，PL 微針組CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量顯著上升，與對照組，空白微針組及PL 涂抹組有明顯差異。 結(jié)果提示，PL微針對糖尿病小鼠傷口組織新生血管有促進(jìn)作用。

3 討論

醫(yī)用高分子生物材料是一類天然或人工合成的特殊功能材料，種類繁多，可用于輔助診斷、治療疾病及替換人體器官等[16]。 其中CMCS 是水溶性殼聚糖衍生物，具有生物降解性，優(yōu)秀的生物相容性等特性，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，CMCS 能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，加速創(chuàng)面愈合，是用于糖尿病傷口理想的材料[17-18]。 但僅使用CMCS 制備微針，針體機(jī)械強(qiáng)度不佳，成針率較低。

增稠劑是一類增加體系黏度的助劑，近年來以發(fā)展新型高分子材料為主，具有增稠明顯，用量較少等特點(diǎn)[19]。 本研究選用兩種具有良好生物相容性的增稠劑:明膠與PVPK-60，來改善針體機(jī)械強(qiáng)度，增加成針率。 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入PVPK-60 制備得到的微針機(jī)械性能優(yōu)于明膠組，且當(dāng)PVPK-60濃度為40 mg/mL 時(shí)，微針力學(xué)性能最佳。

糖尿病難愈合創(chuàng)面形成的主要因素有持續(xù)炎癥，新生血管不足等[20]。 目前治療糖尿病創(chuàng)面方法多種多樣，雖能夠較好保護(hù)創(chuàng)面但藥物遞送能力都較弱。 微針擁有注射給藥以及皮膚貼片的雙重優(yōu)勢，按照結(jié)構(gòu)和釋藥方式的不同，微針可分為可溶微針、實(shí)心不溶微針、空心微針和涂層微針。 實(shí)心不溶微針是通過刺破皮膚后，移除微針，留下小通道孔徑以達(dá)到增強(qiáng)藥物遞送的能力，但由于微針材料是非降解材料，可能出現(xiàn)斷針裂針的情況，將針體滯留在組織內(nèi)，造成安全隱患；空心微針類似于縮小的注射器針頭，可最大化精確定量進(jìn)行藥物遞送，其造價(jià)昂貴，使用不便捷；涂層微針是將遞送的藥物包被在實(shí)心微針表面，形成藥物涂層，在刺入皮膚后吸收溶解，但由于微針針體較小，表面積極大地限制了載藥量，而以生物醫(yī)用材料制備而成的可溶微針，將藥物包封在針體中，插入皮膚后全部溶解，局部釋放，與其他類型的微針相比，可溶微針既能將藥物遞送至傷口深處，溶解后又能在表面形成粘稠液體，保護(hù)傷口微環(huán)境，提高載藥量，無廢棄殘留，患者使用便捷[21-22]。 目前有研究團(tuán)隊(duì)使用微針載藥治療糖尿病潰瘍，如Yuan 等[23]開發(fā)了1 種新型微針，通過負(fù)載人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體與他扎羅汀來治療糖尿病創(chuàng)面，藥物釋放持續(xù)一周左右，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明療效顯著，但外泌體存在提取困難、造價(jià)昂貴等問題，目前難以普及。 本研究采用的PL 制備簡便易保存，同時(shí)含有大量生長因子，是治療糖尿病創(chuàng)面的理想材料。 在本研究中，使用空白微針治療的小鼠創(chuàng)面中可見較多出血點(diǎn)與炎細(xì)胞浸潤，可能是微針造成微小創(chuàng)傷且未負(fù)載PL使得出血點(diǎn)增加。 使用PL 涂抹治療的小鼠創(chuàng)面中，愈合情況優(yōu)于對照組與空白微針組，以H＆E 染色以及免疫組化結(jié)果觀察，是由于PL 促進(jìn)了傷口組合的愈合，同時(shí)下調(diào)了促炎因子IL-6 的表達(dá)，減緩了傷口的炎癥情況。 本研究選用了TGF-β 作為抗炎因子檢測指標(biāo)，是因?yàn)樘悄虿?chuàng)面在臨床上表現(xiàn)為難以結(jié)痂封閉傷口環(huán)境，TGF-β 既能作為1 個(gè)抗炎的指標(biāo)，同時(shí)也是組織修復(fù)和創(chuàng)面纖維化的指標(biāo)，TGF-β 表達(dá)增高在一定程度上表示傷口結(jié)痂封閉的能力有一定提升[24]。 使用PL 微針治療的小鼠創(chuàng)面中，由于微針的通道作用將PL 遞送至組織深處，使其大幅度抑制了促炎因子的表達(dá)，并促進(jìn)抑炎因子TGF-β 與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31 的表達(dá)，高表達(dá)的CD31 表明其微血管新生旺盛，使其最終表現(xiàn)為糖尿病創(chuàng)面愈合效果最佳。

本研究制備的微針陣列完整、針體飽滿、針尖銳利、整體平坦，在維持一定機(jī)械強(qiáng)度的條件下有一定柔韌性，既能充分貼合創(chuàng)面，又不會(huì)對創(chuàng)面產(chǎn)生二次傷害。 從糖尿病小鼠創(chuàng)面大體觀察，H＆E染色與免疫組化結(jié)果均顯示PL 微針組治療有明顯效果。 但微針治療目前仍存在許多問題，如在微針制備方面還可以進(jìn)一步優(yōu)化工藝，篩選更穩(wěn)定，效果更好的生物醫(yī)用高分子材料等，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后期，會(huì)出現(xiàn)創(chuàng)面表層痂皮變厚，微針無法刺破，涂抹的藥物無法滲透等，這些還都需要我們進(jìn)一步研究。