周帆 楊久揚(yáng) 趙恒麗

(武安市第一人民醫(yī)院輸血科，河北 武安 056300)

ABO 血型系統(tǒng)最初于1900 年提出，至今仍是輸血醫(yī)學(xué)和器官移植醫(yī)學(xué)中重要的血型系統(tǒng)[1]。 ABO 亞型是指紅細(xì)胞或分泌液所含A 或B 抗原量不同的表現(xiàn)，其在臨床工作中通常因血型正反定型不符而被發(fā)現(xiàn)[2]。 對亞型的正確鑒定是保證臨床用血安全的重要前提。 我們在對住院患者的血型鑒定中發(fā)現(xiàn)Ael 亞型，現(xiàn)將家系調(diào)查及血型鑒定結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

先證者為本院患者，郝某某，女，47 歲，2022 年7 月12日因子宮肌瘤入院。 既往病史否認(rèn)血液系統(tǒng)、腫瘤等重大疾病，無化療史，無移植史，無輸血史。 術(shù)前常規(guī)檢查血型(微柱凝膠法)正定型為O 型RhD 陽性，反定型為A 型，提示ABO 正反定型不符，故送檢標(biāo)本要求做進(jìn)一步血型鑒定。

1.2 試劑與儀器

抗-A、抗-B 血型定型試劑(單克隆抗體)(20220607)、抗-A1 凝集素(20220221)、抗-H 單克隆抗體(20220214)，均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司；抗-A，B(845000，DIAGAST)； ABO 血型反定型試劑盒( 人血紅細(xì)胞)(2022060102)、 意外抗體檢測試劑(人血紅細(xì)胞)(20220602)，均為長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司；人源抗-A 及新鮮Ac、Oc、Bc 對照細(xì)胞均為自制。 實驗室溫濕度符合要求，儀器設(shè)備均在檢定有效期內(nèi)，所用試劑均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 血清學(xué)試驗

1.3.1 ABO 血型鑒定、意外抗體篩查

參照文獻(xiàn)[3]對患者及其次子采用鹽水試管法進(jìn)行ABO、Rh 血型鑒定，鹽水試管法和經(jīng)典抗人球蛋白法進(jìn)行意外抗體篩查試驗，觀察結(jié)果并記錄。

1.3.2 抗-H 檢測

取檢測當(dāng)日新鮮A、B、O 細(xì)胞做對照，先證者及其次子血清分別于與抗-H 試劑反應(yīng)，觀察結(jié)果并記錄。

1.3.3 人源抗-A 血清的制備

參照文獻(xiàn)[3]選取實驗室內(nèi)8 份抗體篩選陰性的B 型血標(biāo)本，初篩1 ∶8稀釋后血清與患者反定型A 細(xì)胞，1 000 g離心15 s 凝集達(dá)到4＋混合備用。

1.3.4 人源抗-A 血清的質(zhì)量驗證

參照文獻(xiàn)[4]采用試管法對上述制備的人源化抗-A 血清的抗體效價進(jìn)行測定。

1.3.5 唾液血型物質(zhì)檢測

參照文獻(xiàn)[5]采集患者及其次子的唾液10 mL，經(jīng)離心、煮沸、再離心收集上清液，加入標(biāo)化后的單克隆抗體試劑，中和后與相應(yīng)紅細(xì)胞反應(yīng)，觀察結(jié)果并記錄。

1.3.6 吸收放散試驗

參照文獻(xiàn)[6]，結(jié)合IgM 類抗體的性質(zhì)進(jìn)行冷吸收和熱放散。 先證者及其次子在冷吸收時均同時采用上述試驗制備的人源化抗-A 血清、標(biāo)化的商品化單克隆抗-A 試劑及未標(biāo)化的商品化單克隆抗-A 試劑進(jìn)行試驗，同步吸收，以檢測用于吸收的抗體試劑的吸收能力。 同時使用新鮮O 型紅細(xì)胞作為陰性對照與先證者及其次子的紅細(xì)胞做平行試驗。

1.4 基因測序

經(jīng)與患者及家屬溝通，除先證者次子外，其他家屬尚未同意，故家系調(diào)查僅采集次子血樣及先證者血樣，委托中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司代為進(jìn)行ABO 基因測序。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)試驗

2.1.1 ABO 血型鑒定、唾液血型物質(zhì)、意外抗體篩查結(jié)果

先證者鹽水試管法ABO 血型鑒定立即離心，正定型為O 型Rh D 陽性，反定型Ac 管鏡下可見凝集；將試管置于4℃1 h 后可見Ac 管凝集增強(qiáng)，先證者血漿與Oc 及自身紅細(xì)胞均無凝集。 先證者次子鹽水試管法ABO 血型鑒定立即離心，正定型為B 型Rh D 陽性，反定型為B 型；將試管置于4℃1 h 后未見凝集強(qiáng)度增強(qiáng)，其血漿與Oc 及自身紅細(xì)胞均無凝集，結(jié)果見表1。 先證者及其次子鹽水抗人球蛋白法不規(guī)則抗體篩查結(jié)果均為陰性，結(jié)果見表2。

抗-A抗-B抗-D抗-A1抗-A，BAcBcOc自身對照唾液血型物質(zhì)先證者IS004＋00±2＋s00H 物質(zhì)4℃1 h004＋--2＋3＋--次子 IS04＋4＋04＋2＋000B 物質(zhì)4℃1 h04＋4＋--2＋0--H 物質(zhì)

2.1.2 抗-H 檢測

先證者及其次子紅細(xì)胞與抗-H 反應(yīng)，見表3。

先證者 次子正常B細(xì)胞對照正常O細(xì)胞對照正常A細(xì)胞對照抗-H4＋w3＋1＋s4＋1＋

2.1.3 人源化抗-A 血清的質(zhì)量驗證

參照文獻(xiàn)[4]對制備的人源化抗-A 血清的抗體效價和意外抗體篩查進(jìn)行鑒定，其效價＞64，意外抗體篩查試驗結(jié)果為陰性，符合試驗要求。

2.1.4 吸收放散試驗

先證者及其次子的紅細(xì)胞經(jīng)人源化抗-A 及標(biāo)化的商品化單克隆抗-A 試劑吸收并放散后，放散液均與標(biāo)準(zhǔn)A 細(xì)胞反應(yīng)，證實先證者及其次子的紅細(xì)胞表面存在A 抗原；先證者及其次子的紅細(xì)胞經(jīng)未標(biāo)化的單克隆抗-A 試劑吸收并放散后，與標(biāo)準(zhǔn)A 細(xì)胞反應(yīng)未產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。 陰性對照O 細(xì)胞經(jīng)人源化抗-A、標(biāo)化的單克隆抗-A 及未標(biāo)化的單克隆抗-A 吸收后的放散液與標(biāo)準(zhǔn)A 細(xì)胞均不反應(yīng)，見表4。

人源化抗-A 標(biāo)化單克隆抗-A 未標(biāo)化單克隆抗-A先證者2＋2＋0次子2＋2＋0陰性對照(O型紅細(xì)胞)0 0 0末次洗滌液000

2.2 基因測序結(jié)果

委托中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司對其測序后發(fā)現(xiàn)，先證者及其次子A等位基因在A102(基因測序模板A102 在A101 基礎(chǔ)上發(fā)生467 C＞T 的錯義突變)的基礎(chǔ)上，第7 外顯子發(fā)生767 T＞C 的錯義突變，導(dǎo)致多肽鏈第156 位(467 C＞T 的錯義突變)發(fā)生脯氨酸被亮氨酸替換、第256 位氨基酸發(fā)生異亮氨酸被蘇氨酸替換，見圖1。 綜合基因測序結(jié)果先證者的基因型為AEL05/O01，其次子基因型為AEL05/B101，檢索ISBT 官網(wǎng)[7]，先證者的ABO 血型基因型ISBT 命名為ABO?AEL.05//ABO?O.01.01，其次子基因型ISBT 命名為ABO?AEL.05//ABO?B.01.01。

3 討論

ABO 亞型是指紅細(xì)胞或分泌液所含A 或B 抗原量不同的表現(xiàn)，是由基因變異而形成的。 ABO 亞型在臨床工作中通常因血型正反定型不符而被發(fā)現(xiàn)[2]。 臨床上較為常見的A 亞型按紅細(xì)胞上A 抗原決定簇數(shù)量下降依次分為A1、A2、A3、Ax、Aend、Am、Ael 亞型等[8]。 大多數(shù)Ael 等位基因的先證人群為亞洲人， Ael 在人群中頻率較低且存在差異，報道顯示韓國約0.001%、日本約0.004 9%[9]。 Ael 血型亞型在我國人群表達(dá)概率約為八萬分之一[9]， 約為Rh 陰性血型的千分之一。

ABO 基因位于人類染色體9q34，全長19.5kb，由7 個外顯子組成，長度超19.5kb，共編碼354 個氨基酸。 其開放閱讀框主要位于第6、7 號外顯子，編碼酶催化區(qū)，也是決定ABO 基因產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶功能的主要區(qū)域。 本案例中先證者及其次子經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)特征性突變位點均位于第7 外顯子，為467 C＞T、767 T＞C 雜合突變，證明患者的這一特征性突變已遺傳至下一代，符合ABO 亞型必須具有遺傳學(xué)基礎(chǔ)的特點[3]。 767 位堿基發(fā)生的T＞C 突變可能導(dǎo)致α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性降低，從而使A 抗原表達(dá)減弱，形成Ael 亞型[10-12]。

現(xiàn)已報道的Ael 亞型等位基因共有12 種[13]，檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫， 767 位堿基突變只有Ael05 等位基因， 其他等位基因未發(fā)現(xiàn)在767 位發(fā)生突變，Ael05 型最早在我國被報道，并且主要發(fā)生在我國[13]。

利用基因測序的方法檢測ABO 血型基因是目前血型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[14]，但由于價格、試驗設(shè)備、試驗場地、人員等條件限制，基因測序無法在基層醫(yī)院開展，而吸收放散試驗因無需特殊儀器設(shè)備、簡單易學(xué)等優(yōu)點適合基層醫(yī)院開展。

有文獻(xiàn)報道，在吸收放散試驗中使用單克隆抗血清吸收并放散后檢測不到相應(yīng)抗原，需使用人源抗血清吸收放散才能檢出[3]，而人源化抗血清制備繁瑣，并且需要鑒定抗體效價、抗體親和力等指標(biāo)，給吸收放散試驗帶來不便。 在本次吸收放散試驗中同時使用人源化抗-A 血清、未經(jīng)標(biāo)化的單克隆抗-A 試劑以及標(biāo)化的單克隆抗-A 試劑與患者及其次子的紅細(xì)胞做平行試驗，試驗結(jié)果顯示，未經(jīng)標(biāo)化的單克隆抗-A 試劑與紅細(xì)胞吸收后，其放散結(jié)果為陰性，而人源化抗-A 血清及經(jīng)標(biāo)化的單克隆抗-A 試劑與紅細(xì)胞吸收后，放散結(jié)果均為陽性。 此外，在本次試驗中使用的是經(jīng)標(biāo)化的單克隆抗體試劑，目的是盡量避免商品化單克隆抗體試劑效價過高或放散液中的抗原量、唾液中的血型物質(zhì)含量過低，而產(chǎn)生的前帶現(xiàn)象，使試驗結(jié)果產(chǎn)生假陰性。 本次試驗發(fā)現(xiàn)的未經(jīng)標(biāo)化的單克隆抗體做吸收放散試驗漏檢弱抗原事件是偶然現(xiàn)象還是規(guī)律，其原因及影響因素尚需進(jìn)一步試驗驗證。

吸收放散試驗在血型抗體減弱或缺乏導(dǎo)致正反定型不符的血型鑒定中發(fā)揮重要作用[15]。 此外，吸收放散試驗在亞型的鑒定[2，5，8]、類抗體的檢測[16]、高效價冷凝集素標(biāo)本的處理[17]中具有重要臨床意義，其具有簡單易學(xué)、無需特殊儀器設(shè)備及試劑等眾多優(yōu)點，非常適合基層醫(yī)院開展。 正確、熟練、靈活應(yīng)用吸收放散試驗可大大提高血型鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高臨床用血的安全性和科學(xué)性，避免血液資源的浪費(fèi)。